PETUNJUK PRAKTIKUM

Disusun Oleh: Wahyu Widoretno

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN JURUSAN BIOLOGI - FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2019

Praktikum Teknologi Rekayasa Tanaman-2019 1

DAFTAR ISI

Halaman Daftar Isi 1 Topik 1. Teknik Persilangan pada Tanaman Anggrek 2 Topik 2. Induksi Mutasi dan Poliploidi 5 Topik 3. Kriopreservasi Tanaman 7 Topik 4. Analisis Stabilitas Genetik dengan Marka Molekuler 9

2

Topik 1 Teknik Persilangan pada Tanaman Anggrek

Teori dasar

lndonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman tanaman anggrek cukup banyak. Keunggulan tanaman anggrek ditentukan oleh warna, ukuran, bentuk dan susunan bunga, jumlah kuntum bunga per tangkai, panjang tangkai dan daya tahan kesegaran bunga. Salah satu upaya meningkatkan kualitas anggrek adalah perbaikan genetik melalui persilangan.

Persilangan adalah teknik mengawinkan bunga dengan meletakkan polen/serbuk sari pada stigma/kepala putik. Pada tanaman anggrek, persilangan biasanya dilakukan oleh serangga atau dengan bantuan manusia. Persilangan dapat digunakan untuk menambah keragaman genetik, memperoleh sifat ketahanan atau mendapatkan varietas baru dengan warna dan bentuk bunga yang menarik. Persilangan dapat dilakukan pada beberapa jenis/genus yang mudah melakukan persilangan antargenus. Persilangan akan menghasilkan keturunan yang disebut hibrida intra/interspesifik atau intra/intergenerik. Keberhasilan persilangan tergantung jarak genetik spesies yang disilangkan. Makin jauh jarak genetiknya, tingkat keberhasilan untuk mendapatkan tanaman F1 yang hidup dan fertil makin kecil. Kegagalan dalam persilangan juga dapat disebabkan belum masaknya polen atau stigma yang belum siap sehingga tidak terjadi pembuahan. Tujuan: memperoleh kombinasi genetik (warna, bentuk, ukuran, jumlah) dari 2 jenis anggrek melalui persilangan Bahan dan Alat:

- Tanaman anggrek yang telah berbunga (Dendrobium bigibbum, Dendrobium affine, Phalaenopsis dengan warna bunga berbeda)

- Pinset, tusuk gigi/batang korek api, tali, label, kantong plastik Cara Kerja:

- Pemilihan dan persiapan tanaman induk. Siapkan bunga jantan dan bunga betina, utamakan bunga yang baru mekar 4 hari karena saat itu polen telah anthesis dan belum lepas sedangkan antera masih lengket. Kuntum terbaik adalah kuntum kedua sampai keempat. Persilangan sebaiknya dilakukan pagi hari.

- Cap polinia yang terdapat pada ujung kolumna (column) dibuka, dan akan terlihat di dalamnya polinia yang berwarna kuning (Gambar 1A & B).

- Ambil polen (polinia) dari induk bunga jantan dengan menyentuhkan batang tusuk gigi sampai polinia terlepas dari tangkainya dan menempel pada batang tusuk gigi (Gambar 1C).

- Polinia dibawa dan diletakkan pada stigma (kepala putik) induk betina

Praktikum Teknologi Rekayasa Tanaman-2019 3

- Jika penyerbukan dilakukan pada anggrek yang tidak mempunyai perekat pollinia (Dendrobium dan Cattleya):

Letakkan kertas/tisue di bawah bunga untuk menampung pollinia agar tidak terjatuh ke tanah Sentuhkan ujung tusuk gigi ke dalam perekat pada lubang stigma selanjutnya sentuhkan ujung tusuk gigi yang sudah berperekat ke polinia pada kertas Masukkan polinia yang melekat pada ujung tusuk gigi ke dalam lubang stigma

- Polinia induk betina dibuang agar persilangan murni - Bunga yang sudah disilangkan, diselubungi plastik transparan untuk

menghindari terjadinya penyerbukan alami oleh hewan-hewan penyerbuk. - Beri label yang diikatkan pada tangkai kuntum bunga yang berisi nama

tetua betina x tetua jantan, tanggal persilangan, kode penyilang. Dalam satu tandan bunga sebaiknya hanya disilangkan 2 atau 3 kuntum saja untuk memperoleh hasil buah yang sehat dan besar.

- Penyerbukan dilakukan secara: a. Selfing (penyerbukan sendiri pada 1 speies anggrek dalam 1 pohon) b. Sibling (penyerbukan pada 1 spesies anggrek berbeda pohon) c. Crossing (penyerbukan satu genus beda spesies atau penyerbukan

antar genus) - Bunga akan menunjukkan kelayuan setelah 3-7 hari penyilangan tetapi

tangkai kuntum bunga masih hijau segar - Tanda-tanda penyilangan berhasil ditunjukkan dengan menggembungnya

bakal buah berwarna hijau segar setelah 2 minggu. Daun mahkota yang layu dari anggrek yang disilangkan dapat dipotong/dibuang untuk menghindari adanya infeksi jamur dan bakteri,

- Amati persentase keberhasilan persilangan, saat terbentuk buah, bentuk dan warna buah, diameter dan panjang buah.

- Buah (Gambar 1 D) hasil persilangan akan masak sekitar 3-6 bulan tergantung pada jenis anggreknya

- Buah yang telah masak dapat dtumbuhkan melalui teknik kultur jaringan untuk memperoleh tanaman anggrek.

4

Gambar 1. Morfologi bunga anggrek, penyerbukan anggrek, dan buah hasil

persilangan.

A B

C D

Praktikum Teknologi Rekayasa Tanaman-2019 5

Topik

Induksi Mutasi dan Poliploidi

Teori dasar Pemuliaan tanaman memerlukan variasi genetik dari sifat-sifat yang bermanfaat untuk pengembangan tanaman budidaya. Mutagenesis merupakan proses perubahan yang dapat diwariskan yang disebabkan bukan karena segregasi genetik atau rekombinasi genetik tetapi diinduksi dengan agen kimia atau fisik. Mutagen kimia yang sering digunakan untuk induksi mutasi antara lain EMS (Ethyl methanesulfonate), DMS (Dimethyl sulfate), kolkisin dan oryzalin. Sedangkan induksi mutasi secara fisik dilakukan dengan radiasi (neutrons, alpha rays, gamma, beta, x-rays, uv radiation). Mutasi dapat disebabkan oleh mutasi titik (terjadi di dalam gen pada sekuen DNA), mutasi struktur dalam kromosom (inversi, translokasi, duplikasi dan delesi) dan mutasi yang mengarah pada perubahan jumlah kromosom (poliploidi, aneuploidi dan haploidi). Induksi mutasi atau poliploidi tanaman dapat dilakukan secara in vivo dan in vitro. Induksi mutasi secara in vivo dilakukan dengan memberikan perlakuan mutagen pada biji atau pada ujung meristem kecambah/tanaman. Sedangkan induksi mutasi secara in vitro dilakukan dengan merendam eksplan pada larutan mutagen atau memaparkan eksplan pada sinar radiasi sebelum eksplan dikultur pada media kultur. Induksi mutasi secara in vitro juga dapat dilakukan dengan mengkulturkan eksplan pada medium yang mengandung mutagen. Mutasi atau duplikasi jumlah kromosom memungkinkan didapatkannya tanaman yang mempunyai sifat sifat unggul. Tanaman tetraploid telah terbukti dapat menghasilkan tanaman dengan ukuran yang lebih besar dan menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman diploid. Kunci utama dalam pemuliaan mutasi adalah proses identifikasi individu dengan mutasi target yang melibatkan 2 tahapan utama, yaitu skrining mutan dan konfirmasi mutan. Skrining mutan merupakan proses yang melibatkan seleksi individu dari populasi yang mengalami mutasi untuk mendapatkan kriteria seleksi spesifik seperti pembungaan awal, resistensi penyakit dibandingkan dengan tetuanya. Tetapi seleksi ini seringkali dianggap sebagai mutan putatif. Konfirmasi mutan merupakan proses reevaluasi mutan putatif di bawah lingkungan terkontrol dan beriulang menggunakan sampel yang besar. Melalui proses ini beberapa mutan putatif menunjukkan bukan mutan. Tujuan: Menginduksi mutasi dan poliploidi untuk mendapatkan tanaman dengan

karakter tertentu dan meningkatkan performa tanaman Bahan dan alat:

- Biji tanaman, kolkisin, EMS, agar - Erlenmeyer, pipet, polybag, media tanam

6

Cara kerja :

-. Biji dikecambahkan dalam media tanam tanah+kompos dalam polybag, masing-masing polybag ditanam 6 biji pada 3 lubang tanam

- Kecambah pada tahapan kotiledon (umur 7-10 minggu) diberi perlakuan mutagen kolkisin atau EMS (0, 0.1, 0.5, 1.0 %) selama 2, 4, 6 hari dengan interval pemberian mutagen 2 hari.

- Larutan kolkisin atau EMS untuk induksi mutasi dibuat dengan melarutkan kolkisin atau EMS dengan konsentrasi tersebut di atas dengan aquadest dengan agar 7 g/L pada suhu 50 oC

- Satu tetes (2-4 uL) suspensi kolkisin atau EMS hangat (≈ 40 oC) diteteskan pada atas kotiledon dari masing-masing kecambah untuk menutupi munculnya pucuk (Gambar 2)

- Pot ditempatkan pada ruang pertumbuhan dengan suhu 25 oC dengan kelembaban tinggi (kelembaban relative 100%) di bawah cahaya yang konstan untuk menpertahankan integritas tetesan agar.

- Pemberian mutagen diulang setelah interval 2 hari. - Setelah perlakuan, tanaman ditumbuhkan di bawah kondisi rumah kaca

- Setelah 2 minggu, dilakukan evaluasi persentase kemampuan tumbuh dan pertumbuhan kecambah (tinggi kecambah, jumlah dan luas area daun).

Gambar 2. Perlakuan kolkisin/EMS-agar pada kecambah

Praktikum Teknologi Rekayasa Tanaman-2019 7

Topik 3 Kriopreservasi Tanaman

Teori dasar

Kriopreservasi merupakan penyimpanan sel, jaringan dan organ pada temperatur sangat rendah pada nitrogen cair (-196 oC). Pada temperatur ini, sel dalam suatu keadaan tidak membelah dengan metabolisme hampir nol. Pada temperatur ini, gerakan molekul dikurangi secara drastis, tidak ada fase cair di dalam sel, dan semua proses metabolik seperti respirasi dan aktifitas ensimatik dideaktivasi yang memungkinkan untuk menjamin konservasi materi biologi lebih lama karena kerusakan biologi ditunda. Tetapi sel harus tetap memelihara struktur utuhnya yang akan memungkinkan kembali ke aktifitas normalnya setelah thawing.

Kriopreservasi merupakan metode ideal untuk konservasi plasma nutfah karena memungkinkan penyimpanan material biologi untuk periode waktu yang tidak terbatas dengan tetap menjaga stabilitas genetik dan karakteristik fenotipiknya. Kriopreservasi tidak memerlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang sehingga lebih efisien dari segi biaya, waktu, ruang penyimpanan, dan tenaga. Kriopreservasi juga mempermudah transport dan pertukaran plasma nutfah.

Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama dan teknik baru. Teknik lama (teknik pembekuan lambat) didasarkan pada dehidrasi yang diinduksi dengan pembekuan pada suhu di bawah titik beku air hingga -40 oC. Teknik pembekuan meliputi inkubasi sel pada krioprotektan dengan konsentrasi 1-2 M yang menyebabkan dehidrasi moderat dan diikuti oleh pembekuan lambat pada suhu 1 oC hingga suhu -40 oC, lalu pembekuan dalam nitrogen cair dan selanjutnya thawing (pelelehan).

Teknik baru didasarkan pada vitrifikasi, yaitu dehidrasi yang diinduksi pada suhu di atas titik beku air. Vitrifikasi adalah fase transisi air dari bentuk cair menjadi bentuk nonkristalin atau amorf, tembus pandang (glassy) karena peningkatan ekstrim dari larutan yang viskos selama pendinginan. Teknik vitrifikasi didasarkan pada dehidrasi sel pada suhu non-freezing (tidak beku), yaitu dengan merendam bahan dalam larutan krioprotektan dengan total konsentrasi 5-8 M pada suhu 0-25 oC dan diikuti oleh pembekuan dan selanjutnya thawing/pelelehan. Beberapa teknik baru yang telah berkembang antara lain vitrifikasi, enkapsulasi-dehidrasi, enkapsulasi-vitrifikasi, dan desikasi. Pada teknik vitrifikasi, bahan tanaman diperlakukan dengan senyawa krioprotektif dan dehidrasi dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti dengan pembekuan cepat, pelelehan, dan pembuangan krioprotektan serta pemulihan kultur.

Teknik enkapsulasi-dehidrasi didasarkan pada teknologi yang telah dikembangkan pada produksi benih sintetik. Pada teknik tersebut, bahan tanaman dienkapsulasi pada kapsul alginat, lalu ditumbuhkan pada medium yang diperkaya dengan sukrosa dan dikeringkan secara parsial dalam laminar air flow cabinet atau gel silika hingga kandungan air sekitar 20% dan diikuti oleh pembekuan cepat. Teknik enkapsulasi-vitrifikasi merupakan kombinasi antara teknik vitrifikasi dan enkapsulasi dehidrasi, yaitu bahan tanaman dienkapsulasi dengan kapsul alginat, lalu dibekukan dengan teknik vitrifikasi. Teknik desikasi merupakan teknik yang paling sederhana,

8

yaitu mengeringkan bahan tanaman dalam laminar air flow cabinet, gel silika atau flash drying hingga kandungan air 10-20%, kemudian diikuti oleh pembekuan cepat.

Faktor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi antara lain kecepatan pembekuan, jenis dan konsentrasi krioprotektan, tipe dan keadaan fsiologi bahan tanaman yang disimpan. Keberhasilan teknik kriopreservasi ditunjukkan pada kemampuan hidup dan regenerasi yang tinggi serta tingkat stabilitas genetik setelah kriopreservasi. Penentuan kemampuan hidup dapat dilihat dari kemampuan tumbuh kembali sel/jaringan yang disimpan, sedangkan viabilitas dapat diuji dengan pewarnaan Fluorescien diacetate (FDA), Triphenyl tetrazolium chloride (TTC) dan Evan’s blue. Tujuan: menyimpan bahan tanaman dalam waktu lama dan selanjutnya

menghasilkan tanaman true-to-type dari bahan yang disimpan tersebut. Bahan dan alat:

- Tunas in vitro/protocorm, media MS, gliserol, etilen glikol, DMSO, Nitrogen cair

- Water bath, cawan petri, skalpel, pinset, microtube, Erlenmeyer Cara kerja :

- Kultur ujung pucuk/protocorm donor pada media MS + sukrosa 120 mg/L selama 3 minggu

- Isolasi/ambil protocorm/ujung pucuk (panjang 0,5-0,8 mm, apical dome +1-2 primordia daun)

- Pada teknik vitrifikasi-enkapsulasi, ujung pucuk/protocorm dienkapsulasi pada gel sodium alginate sebelum dibekukan

- Eksplan diprekultur pada media MS yang mengandung sukrosa tinggi (0,3 – 0.7 M) selama 1 malam pada suhu 25 oC

- Beri perlakuan eksplan dengan larutan gliserol 2M + sukrosa 0.4 M selama 20 menit pada suhu 25 oC

- Paparkan eksplan pada larutan PVS2 (gliserol 30% + etilen glikol 15%+ DMSO 15% + sukrosa 0,4 M) selama 10 menit pada suhu 25 oC atau didehidrasi dengan pemaparan pada laminar air flow

- Imersi/celupkan secara langsung eksplan ke dalam larutan Nitrogen (LN2) dan simpan

- Hangatkan kembali secara cepat eksplan yang telah dikriopreservasi dalam water bath 40oC

- Rendam eksplan dalam larutan sukrosa 1,2 M selama 10 menit pada suhu 25oC

- Kultur kembali eksplan pada media MS + sukrosa 0,3 M (atas media diberi 2 lapis kertas)

- Transfer eksplan ke media MS yang mengandung sukrosa 0,1 M untuk pertumbuhan kembali planlet.

Praktikum Teknologi Rekayasa Tanaman-2019 9

Topik 4 Analisis Stabilitas/Variabilitas Genetik Tanaman dengan Marka Molekuler

Penggunaan marka/penanda molekuler dalam pemuliaan pada umumnya

adalah untuk mengidentifikasi hibrida, identifikasi varietas baru, melihat komposisi genetik hasil fusi protoplas dan memeriksa stabilitas regeneran. Perkembangan penanda molekuler yang cepat dan luas telah menyediakan alat yang sangat berguna untuk pemulia tanaman dalam mempelajari keragaman genetik, mencari sumber gen baru yang penting secara agronomis, identifikasi cultivar dan efisiensi manajemen generasi segregasi selama program pemuliaan tanaman melalui seleksi berdasar penanda (marker-assisted selection).

Penanda SSR (Simple Sequence Repeat) juga bisa disebut dengan mikrosatelit, merupakan unit pengulangan 1–6 pasangan basa DNA dengan variasi yang tinggi. Primer SSR dibentuk berdasarkan pada daerah pengapit konservatif lokus SSR yang bisa menghasilkan amplikasi PCR pada lokus SSR tersebut. Penanda SSR bersifat multialellik atau spesifikasi pada lokus, tingkat polimorfisme tinggi, dapat mendeteksi variasi alel yang tinggi dan mudah diulangi, sehingga sangat baik digunakan untuk mempelajari keragaman genetik diantara genotip–genotip yang berbeda. Penanda SSR juga dapat digunakan untuk pemetaan genetik, dan memperkirakan derajat jarak kekerabatan antar populasi. Penanda SSR juga dapat menambah keakuratan hasil seleksi yang dilakukan dengan metode visual (penanda morfologi).

Tujuan: mengevaluasi stabilitas genetik (tro-to-type) regeneran hasil kultur in vitro Bahan dan alat:

- Plantlet hasil kultur. - PCR, Elektroforesis, micropipette, waterbath, sentifuse, Geldoc, mortar,

pestel, tabung mikro, dll. - Buffer ekstraksi CTAB, fenol, kloroform, isoamil alkohol, isopropanol,

buffer TE, etidium bromida, primer mikrosatelit, PCR mix, dll. Cara kerja: Isolasi DNA.

- Daun 0, 1 g + 0,5 mL buffer ekstraksi digerus halus, dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah buffer ektraksi sampai volume mencapai 1 mL

- Sampel diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65 oC selama 30 menit - Sampel dikeluarkan dari waterbath dan didiamkan pada suhu ruang - Tabung mikro berisi sampel disentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm

pada suhu 4 oC selama 5 menit - Supernatan (600uL) dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan

ditambah larutan fenol:kloroform:isoamil alcohol (25:24:1) dengan volume yang sama

10

- Supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm pada suhu 4 oC selama 5 menit

- Supernatan diambil, dipindahkan ke tabung baru dan ditambah isopropanol sampai volume 1 mL

- Tabung sampel berisi sampel DNA disimpan suhu -20 oC selama 30 menit, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm pada suhu 4 oC selama 5 menit

- Fase cair dibuang, pelet DNA ditambahkan 300 uL etanol 75% dingin dan dicampur secara perlahn kemudian disentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm pada suhu 4 oC selama 2 menit, pencucian ini diulang 2 x

- Fase cair dibuang, pellet dikeringanginkan selama 20 menit - DNA kering ditambahkan buffer TE pH 8 sebanyak 50 uL dan

dicampurkan secara perlahan hingga seluruh DNA larut dalam larutan buffer.

- Kemurnian DNA diuji menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

Amplifikasi DNA - DNA hasil isolasi diamplifikasi dengan PCR. Primer yang digunakan 2

pasang primer mikrosatelit, yaitu TAA 41 (5’ AGGTCTACATTGGCATTGTC3’ dan 3’ACATGCAGTCTATAATGAAGT5’) dan TAA 15 (5’AGAGAAGAAACATTTGCTTTGCGGAGC3’ dan 3’CTTCCCAGCTGCACAAGC5’).

- Volume total reaksi PCR yang digunakan sebanyak 20 uL, terdiri dari stok DNA 1 uL, primer forward dan reserve masing-masing 1 uL, PCR mix dan ddH2O 17 uL.

- Kondisi untuk reaksi PCR yang digunakan adalah adalah pre-denaturasi 94 oC selama 2 menit, denaturasi 94 oC selama 20 detik, annealing suhu 42 °C selama 10 detik, extension 72 oC selama 20 detik dan post-extension 72 oC selama 5 menit, reaksi diulang sebanyak 35 siklus.

Visualisasi Hasil PCR - Hasil amplifikasi PCR divisualisasi dengan teknik elektroforesis. - Elektroforesis dilakukan melalui elektroforesis horizontal dengan 3%

agarose yang telah ditambah 1,5 uL EtBr. - Setelah gel memadat, sampel hasil PCR 3 uL dimasukkan ke dalam

sumuran dan di running dalam buffer TBE 0,5x pada tegangan 75 volt selama 65 menit dan sebagai pembanding digunakan DNA ladder 100 bp.

- Gel diamati dan dilakukan dokumentasi menggunakan Geldoc. Analisis Data.

- Pita DNA hasil amplifikasi diinterpretasikan sebagai data kualitatif, dengan melihat kehadiran atau ketidakhadiran larik DNA regeneran dibandingkan dengan tanaman induk/donor.

Praktikum Teknologi Rekayasa Tanaman-2019 11

- Apabila kehadiran pita DNA regeneran (yang diuji) sama dengan kehadiran pita DNA pada tanaman induk maka regeneran bersifat true to type.