Top Banner
VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT MYCOBACTERIOSIS DAN MOTILE AEROMONAS SEPTICEMIA PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy) UNI PURWANINGSIH SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
109

VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

Mar 03, 2019

Download

Documents

phungdien
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN

PENYAKIT MYCOBACTERIOSIS DAN MOTILE AEROMONAS

SEPTICEMIA PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

UNI PURWANINGSIH

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Page 2: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 3: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Vaksin koktail sel utuh untuk

pencegahan penyakit Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia (MAS)

pada ikan gurame (Osphronemus gouramy) adalah karya saya dengan arahan dari

komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan

tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang

diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks

dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, September 2013

Uni Purwaningsih

NIM B253110051

Page 4: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 5: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

ABSTRACT

UNI PURWANINGSIH. Whole cell cocktail vaccine for Mycobacteriosis and

Motile Aeromonas Septicemia in Gouramy (Osphronemus gouramy). Under

direction of AGUSTIN INDRAWATI and ANGELA MARIANA LUSIASTUTI

Infections of Mycobacterium sp. and Aeromonas sp. both are considered

severe fish pathogens on account of their ability to cause damaging disease

outbreaks in gouramy (Osphronemus gouramy). The efficacy of cocktail vaccine

was influenced by the concentrations of antigens, cross-reactions and competition

among the different antigens. The aims of this reseach was to analyze the synergy

and competence both antigens to inducing immunity and assess the effectiveness

and efficacy of cocktail vaccine A. hydrophila and M. fortuitum to producing

immune responses and improve survival rate in gouramy from Mycobacteriosis

and Motile Aeromonas Septicemia (MAS) infection. The Lethal dose of co-

infection used LD50 of A. hydrophila 108

cfu and M. fortuitum 107 cfu. Co-

infection test of gouramy showed clinical sign was anorexia, nodules on the

surface of the body and swelling in the abdominal cavity. The mortality of co-

infection 25Mf: 75Ah was reached until 50% (LD50) within 28 days. The

mortality patterns of Mycobacteriosis was chronic and MAS was acute infection.

Hematocrit and hemoglobine values of co-infection was decreased because

gouramy become sick that was caused invasion both of bacteria into the body.

Pathology anatomy of co-infection showed bleeding in the kidneys and spleen,

multifocal granulomas in liver and spleen, and ascites in the abdominal cavity.

Histopathology showed congestion, multifocal granuloma in the liver and spleen,

melano macrofag center (MMC) in the spleen and kidneys, inflammation and

necrosis were also found in the kidney. The protein profile analysis of whole cell

vaccine preparation M. fortuitum, A. hydrophila and cocktail vaccine showed

fourteen, fifteen and five to ten bands. The efficacy of monovalent and cocktail

vaccine showed phagocytic index, percentage of phagocytosis, total lymphocytes,

respiratory burst activity, complement and antibody titers were significantly

different (P <0.05), compared to controls. The evaluation of parameters from

efficacy monovalent and cocktail vaccine M. fortuitum and A. hydrophila before

and after challenge test were able to increased specific and non-specific immune

response in gouramy. The value of relative percent survival from monovalent

vaccine A. hydrophila was 92.32% and monovalent vaccine M. fortuitum was

78.57% when challenged by single infection but showed very low RPS when

challenged by co-infection compared to cocktail vaccine. Monovalent vaccine M.

fortuitum and A. hydrophila were only provide protection against homolog

bacteria and no cross protection against other bacteria. Cocktail vaccine was not

enough provides protection from mycobacteriosis and MAS when infected at the

same time. Therefore, it need use the adjuvant to optimalize cocktail vaccine to

inducting immune respon in gouramy.

Keywords: Gouramy (Ospronemus gouramy), Motile Aeromonas Septicemia

(MAS), Mycobacteriosis, cocktail vaccine

Page 6: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 7: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

RINGKASAN

UNI PURWANINGSIH. Vaksin koktail sel utuh untuk pencegahan penyakit

Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia pada ikan gurame

(Osphronemus gouramy). Dibimbing oleh AGUSTIN INDRAWATI dan

ANGELA MARIANA LUSIASTUTI

Infeksi bakteri Mycobacterium sp. dan Aeromonas spp. menjadi salah satu

kendala keberhasilan budidaya gurame di Indonesia. Timbulnya penyakit

Mycobacteriosis (Fish Tubercullosis) dan Motile Aeromonas Septicaemia (MAS)

mengakibatkan kerugian ekonomi karena menyebabkan kematian yang tinggi dan

menurunkan kualitas produk perikanan. Saat ini, penggunaan antibiotik sebagai

salah satu upaya pengendalian kedua jenis penyakit tersebut telah dilarang karena

dampak bahaya residu, resistensi dan penurunan nilai keamanan pangan. Oleh

karena itu diperlukan solusi alternatif yang efektif, efisien dan aplikatif melalui

pemberian vaksin koktail M. fortuitum dan A. hydrophila. Keberhasilan vaksin

koktail dipengaruhi oleh konsentrasi antigen , reaksi silang dan kompetisi di

antara antigen yang berbeda. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis

sinergitas dan kompetensi kedua antigen dalam menginduksi imunitas pada ikan

gurame serta mengkaji efektifitas dan efikasi vaksin koktail dari bakterin M.

fortuitum dan A. hydrophila dalam menghasilkan respons imun dan meningkatkan

kelangsungan hidup pada ikan gurame untuk mencegah infeksi penyakit

Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia.

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Ilmu

Penyakit Hewan dan kesehatan Masyarakat Veteriner - Fakultas Kedokteran

Hewan IPB dan Laboratorium Kesehatan Ikan Balai Penelitian dan

Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor. Ikan uji yang digunakan berukuran 25

– 30 g per ekor dengan syarat memenuhi asumsi “Spesific Free Pathogen”

terhadap Mycobacterium sp. dan Aeromonas sp. Isolat yang digunakan adalah M.

fortuitum kode 31 dan A. hydrophila AHL 0905-2. Preparasi vaksin dilakukan

berdasarkan modifikasi metode yang telah dikembangkan oleh Purwaningsih et al.

(2012) dan Sugiani (2012).

Tahap pertama, menganalisis karakteristik hasil artifisial ko-infeksi

bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila dengan melihat perubahan pada parameter

patologi klinik darah, gambaran darah, histopatologi dan kematian ikan gurame.

Ikan gurame ko-infeksi menunjukkan gejala klinis nafsu makan menurun, nodul

pada permukaan tubuh, kemerahan pada bekas suntikan, asites dan eksopthalmia.

Perlakuan ko-infeksi 75Mf:25Ah dan 50Mf:50Ah menunjukkan kematian yang

rendah yaitu 10 – 20% sedangkan pada ko-infeksi 25Mf:75Ah jumlah kematian

ikan gurame mencapai 50% (LD50) dalam waktu 28 hari. Pola kematian penyakit

Mycobacteriosis bersifat kronis sedangkan infeksi MAS bersifat akut. Nilai

hematokrit dan hemoglobin perlakuan ko-infeksi menurun, hal ini dikarenakan

ikan menjadi sakit akibat invasi kedua jenis bakteri tersebut kedalam tubuh.

Proporsi limfosit pada perlakuan ko-infeksi mengalami penurunan dan sebaliknya neutrofil dan monosit mengalami peningkatan setelah infeksi. Patologi anatomi

Page 8: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

ko-infeksi menunjukkan pendarahan pada ginjal dan limpa, multifokal granuloma

pada hati dan limfa serta asites pada rongga perut. Histopatologi menunjukkan

kongesti, granuloma multifokal pada hati dan limpa, melano macrofag centre

(MMC) pada limpa dan ginjal dan peradangan dan nekrosis juga ditemukan pada

organ ginjal.

Tahap kedua, preparasi sediaan vaksin inaktif dari isolat M. fortuitum dan

A. hydrophila dengan inaktifasi menggunakan neutral buffer formalin 3%.

Evaluasi terhadap vaksin dilakukan melalui uji keamanan, sterilitas dan karakter

profil protein sediaan vaksin. Efikasi vaksin monovalen dan koktail tidak

menyebabkan kematian setelah 24 jam pascainjeksi. Analisa profil protein

terhadap vaksin sediaan sel utuh M. fortuitum, A. hydrophila dan koktail masing -

masing menunjukkan jumlah pita protein yang bervariasi. Residu formalin vaksin

25 Mf : 75 Ah sebesar 0.205 mg/L, vaksin 50 Mf : 50 Ah sebesar 0.191 mg/L dan

vaksin 75 Mf : 25 Ah sebesar 0.136 mg/L dan tidak terdeteksi pada semua sampel

otot ikan perlakuan vaksin monovalen maupun koktail. Analisa histologi

menunjukkan tidak ditemukan adanya perubahan pada organ hati, ginjal dan limpa

pada perlakuan vaksin. Inaktifasi vaksin dengan menggunakan neutral buffer

formalin 3 % terbukti aman karena kelangsungan hidup pada berbagai kelompok

perlakuan 98 – 100 %.

Tahap ketiga, menganalisis respon imun terhadap pemberian vaksin

monovalen dan koktail M. fortuitum dan A. hydrophila sebagai penilaian terhadap

parameter keberhasilan vaksinasi pada ikan gurame. Keberhasilan vaksinasi dapat

diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

proteksi aplikasi vaksin pada ikan. Analisis bakterisidal serum dapat dijadikan

komponen untuk melihat viabilitas patogen dalam inang yang ditunjukkan melalui

aktifitas respiratory burst, titer antibodi dan komplemen. Pemeriksaan komponen

darah dapat digunakan untuk mengetahui kondisi status kesehatan ikan,

mengevaluasi pertahanan non spesifik pada spesies ikan dan mengetahui pengaruh

stress terhadap kesehatan ikan. Ikan gurame pada perlakuan vaksin monovalen

maupun koktail menunjukkan nilai indek fagositik, persentase fagositosis, total

limfosit, aktivitas respiratory burst, komplemen dan titer antibodi yang berbeda

nyata (P<0.05) dibanding kontrol. Titer antibodi mengalami peningkatan setelah

14 hari pascavaksinasi. Hasil evaluasi terhadap parameter – parameter diatas

menunjukkan bahwa vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A.

hydrophila mampu meningkatkan respon imun spesifik dan non spesifik pada ikan

gurame.

Tahap keempat, menganalisis peningkatan respon imun pasca uji tantang

dengan infeksi tunggal maupun ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila

terhadap penyakit Mycobacteriosis dan MAS. Uji tantang dilakukan

menggunakan dosis LD50 infeksi tunggal maupun ko-infeksi dari bakteri M.

fortuitum dan A. hydrophila. Potensi vaksin dihitung berdasarkan nilai nilai RPS

(Relative Percent Survival) dan hasil analisa respon hematologi dan serologi..

Ikan gurame pada perlakuan vaksin monovalen maupun koktail pasca uji tantang

dengan infeksi tunggal maupun ko-infeksi menunjukkan nilai hematokrit,

hemoglobin, indek fagositik, persentase fagositosis, total limfosit, aktivitas

respiratory burst, komplemen dan titer antibodi yang berbeda nyata (P<0.05)

dibanding kontrol. Nilai RPS vaksin monovalen A. hydrophila sebesar 92.32%

Page 9: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

setelah diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila dan vaksin monovalen M.

fortuitum sebesar 78.57% berbeda halnya ketika diuji tantang dengan bakteri ko-

infeksi menunjukkan nilai RPS yang sangat rendah dibanding vaksin koktail.

Vaksin monovalen M. fortuitum dan A. hydrophila hanya memberikan proteksi

terhadap bakteri homolog dan tidak proteksi silang terhadap bakteri lain. Vaksin

koktail belum cukup protektif memberikan perlindungan pada ikan gurame jika

terinfeksi penyakit Mycobacteriosis dan MAS dalam waktu yang bersamaan. Oleh

karena itu perlu dicoba penggunaaan adjuvan untuk mengoptimalkan kerja vaksin

koktail dalam menginduksi respon imun pada gurame.

Kata kunci : Gurame (Osphronemus gouramy), Motile Aeromonas Septicemia

(MAS), Mycobacteriosis, vaksin koktail

Page 10: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 11: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

©Hak Cipta milik IPB, tahun 2013

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

yang wajar IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

Page 12: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 13: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN

PENYAKIT MYCOBACTERIOSIS DAN MOTILE AEROMONAS

SEPTICEMIA DAN PADA IKAN GURAME

(Osphronemus gouramy)

UNI PURWANINGSIH

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Mikrobiologi Medik

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Page 14: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis :

Prof. Dr. drh. Fachriyan H Pasaribu

Page 15: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

Judul Tesis : Vaksin koktail sel utuh untuk pencegahan penyakit

Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia

pada ikan gurame (Osphronemus gouramy)

Nama : Uni Purwaningsih

NIM : B 253110051

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr.drh. Agustin Indrawati, M. BioMed Dr. drh. Angela M. Lusiastuti, M.Si

Ketua Anggota

Mengetahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Mikrobiologi Medik

Prof. Dr.drh. Fachriyan H Pasaribu Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal Ujian : ...................... Tanggal Lulus : ....................

Page 16: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 17: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-

Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam

penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2012 – Juni 2013 ini adalah

Vaksin koktail sel utuh untuk pencegahan penyakit Mycobacteriosis dan Motile

Aeromonas Septicemia pada ikan gurame (Osphronemus gouramy).

Terimakasih penulis ucapkan kepada Dr. drh. Agustin Indrawati,

M.BioMed dan Dr. drh. Angela Mariana Lusiastuti, M.Si selaku pembimbing

yang memberi saran dan masukan. Terimakasih penulis ucapkan kepada

Kementrian Kelautan dan Perikanan yang telah memberikan beasiswa periode

September 2011 – Agustus 2013. Terima kasih kepada Kepala Balai Penelitian

dan Pengembangan Budidaya Air Tawar atas bimbingan dan arahan selama

penulis menyelesaikan pendidikan. Disamping itu, penghargaan penulis

sampaikan kepada Ir. Taukhid, MSc; Dr. Desy Sugiani, M.Si ; Tuti Sumiati, SPi;

Ahmad Wahyudi; Edy Farid Wadjdy; Bambang Priadi; Mikdarullah; serta seluruh

staf peneliti dan karyawan-karyawati lingkup Balai. Terimakasih untuk teman -

teman MKM 2011 silaturahmi kita tetap terjalin dan terima kasih untuk staf lab.

Terpadu Mikrobiologi FKH IPB atas bantuannya selama penelitian. Ungkapan

terimakasih juga disampaikan kepada Ayahanda Sri Purwanto dan Ibunda

Suwarni serta ayahanda Saini dan Ibunda Siti Sulaminah yang selalu memberikan

doa dan dukungannya. Suamiku tercinta drh. Agus Karyono, dua bidadari kecilku

“Fathia Qutrotunnada Alifa dan Fahira Amalia Khairunnisa” terima kasih atas

semangat dan pengertiannya serta seluruh keluarga atas doa dan motivasi selama

penulis menyelesaikan pendidikan.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2013

Uni Purwaningsih

Page 18: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 19: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 22 Januari 1981 sebagai anak

pertama dari pasangan Sri Purwanto dan Suwarni. Pendidikan sarjana ditempuh di

Jurusan Kedokteran Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah

Mada pada tahun 1999 dan lulus pada tahun 2004. Kesempatan untuk melanjutkan

ke Program Magister pada Program Studi Mikrobiologi Medik IPB diperoleh dari

program beasiswa KKP pada tahun 2011.

Penulis bekerja sebagai Peneliti Muda di Badan Penelitian dan

Pengembangan Kelautan dan Perikanan, Kementerian Kelautan dan Perikanan

sejak tahun 2005, ditempatkan di Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya

Air Tawar sebagai peneliti bidang kesehatan ikan.

Page 20: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 21: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

xii

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL ...............................................................................

Halaman

xiii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................... xvi

I. PENDAHULUAN

Latar Belakang ............................................................................. 1

Tujuan Penelitian ......................................................................... 4

Manfaat Penelitian ....................................................................... 4

Hipotesis ...................................................................................... 4

II. TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Mycobacteriosis ............................................................

Penyakit Motile Aeromonas Septicemia (MAS) .........................

5

6

Bakteri Mycobacterium fortuitum ................................................ 7

Bakteri Aeromonas hydrophila .................................................... 8

Imunologi Ikan ............................................................................. 9

Vaksinasi pada ikan .....................................................................

11

III. BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................... 14

Ikan Uji ........................................................................................ 14

Isolat Bakteri ................................................................................ 14

Vaksin .......................................................................................... 14

Alur Pelaksanaan Penelitian......................................................... 15

Parameter yang Diukur................................................................. 21

Analisis Data................................................................................. 25

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Tahap 1 : Patogenitas ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila

pada ikan gurame (O. gouramy) ………………………………..

26

Tahap 2 : Kajian Preparasi vaksin M. fortuitum dan A

hydrophila....................................................................................

34

Tahap 3 : Efikasi vaksin koktail bakterin A. hydrophila dan M.

fortuitum pada ikan gurame (O. gouramy)…………...................

41

Tahap 4 : Proteksi silang vaksin koktail bakterin M. fortuitum

dan A. hydrophila pada ikan gurame (O. gouramy) ……….......

54

V. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………... 64

DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………...

65

LAMPIRAN …………………………………………………………. 73

Page 22: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Perlakuan ko-infeksi LD50 ……………………………………... 15

2. Komponen perlakuan vaksin …………………………………... 19

3. Perlakuan proteksi vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum

dan A. hydrophila ………………………………………………

20

4. Hasil uji kadar formalin sediaan vaksin koktail yang diinaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3% ………………………….....

35

5. Deteksi kadar residu formalin pada daging ikan gurame yang

divaksinasi dengan vaksin koktail dan monovalen inaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3% ………………….................

36

6. Berat protein sediaan vaksin monovalen sel utuh yang diin-

aktifasi dengan neutral buffer formalin 3% …………………….

38

7. Karakter berat molekul protein hasil SDS page vaksin

monovalen A. hydrophila dan M. fortuitum serta gabungan

keduanya yang diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3% .

40

8. Parameter hematologi dan respon imun efikasi vaksin monova-

len dan koktail setelah diuji tantang dengan A. hydrophila…….

57

9. Parameter hematologi dan respon imun efikasi vaksin

monovalen dan koktail setelah diuji tantang dengan M.

fortuitum ……………………………………………………….

58

10. Parameter hematologi dan respon imun efikasi vaksin

monovalen dan koktail setelah diuji tantang ko-infeksi dengan

M. fortuitum dan A. hydrophila ………………………………...

58

11. Tingkat RPS ikan gurame yang divaksinasi dengan vaksin

monovalen dan koktail M. fortuitum dan A. hydrophila ………..

61

12. Kisaran hasil pengukuran kualitas air selama penelitian ……..... 63

Page 23: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Alur pelaksanaan penelitian Vaksin koktail untuk pencegahan

penyakit Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia

pada ikan Gurame (O. gouramy) ………………………..............

15

2. Kadar hematokrit ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum

(Mf) dan A. hydrophila (Ah). ……………………………………

26

3. Kadar hemoglobin ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum

(Mf) dan A. hydrophila (Ah) …………………………………….

27

4. Total limfosit ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf)

dan A. hydrophila (Ah) ………………………………………….

28

5. Total neutrofil ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf)

dan A. hydrophila (Ah) ……………………………………….....

29

6. Total monosit ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf)

dan A. hydrophila (Ah) ………………………………………..

30

7. Kematian ikan gurame perlakuan ko-infeksi M. fortuitum (Mf)

dan A. hydrophila (Ah) ……………………………………….....

31

8. Gejala klinis ikan gurame perlakuan ko-infeksi M. fortuitum

(Mf) dan A. hydrophila (Ah)..........................................................

31

9. Patologi anatomi ikan gurame perlakuan ko-infeksi M.

fortuitum (Mf) dan A. hydrophila (Ah)..........................................

32

10. Fotomikrograf organ hati (A), ginjal (B) dan limpa (C) ikan

gurame ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila ……………...

33

11. Fotomikrograf organ hati (A), ginjal (B) dan limpa (C) gurame

uji yang divaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail

inaktifasi dengan neutral buffer formalin 3% …………………...

37

12. SDS-PAGE sediaan vaksin monovalen dan koktail inaktifasi

neutral buffer formalin 3% ………………………………............

38

13. Titer antibodi serum ikan gurame pascavaksinasi yang diuji

tantang dengan bakterin A. hydrophila…………………………..

42

14. Titer antibodi serum ikan gurame pascavaksinasi yang diuji

tantang dengan bakterin M. fortuitum…………………................

42

15. Titer antibodi serum ikan gurame pascavaksinasi yang diuji

tantang dengan gabungan bakterin M. fortuitum dan A.

hydrophila………………………………………………………..

42

16. NBT Assay ikan gurame pasca vaksinasi dengan berbagai

sediaan vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A.

hydrophila yang diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3%..

44

17. Aktifitas komplemen serum ikan gurame pascavaksinasi dengan

vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi menggunakan

neutral buffer formalin 3% terhadap bakteri A. hydrophila, M. fortuitum dan ko-infeksi……………………….............................

46

18. Kadar hemoglobin ikan gurame pasca vaksinasi dengan

berbagai sediaan vaksin …………………………………………

48

19. Kadar hematokrit ikan gurame pasca vaksinasi dengan berbagai

sediaan vaksin …………………………………………………...

49

Page 24: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

xv

20. Persentase fagositosis ikan gurame pasca vaksinasi dengan

berbagai sediaan vaksin …………………………………………

50

21. Indek fagositik ikan gurame pasca vaksinasi dengan berbagai

sediaan vaksin……………………………………………………

51

22. Persentase total limfosit sel darah putih ikan gurame pasca

vaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail yang

diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3%............................

52

23. Persentase total monosit sel darah putih ikan gurame pasca

vaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail yang

diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3% ……………........

53

24. Persentase total neutrofil sel darah putih ikan gurame pasca

vaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail yang

diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3% ………………....

53

25. Kematian kumulatif harian ikan gurame yang divaksinasi

dengan vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi dengan

neutral buffer formalin 3% setelah diuji tantang dengan bakteri

A. hydrophila………………..........................................................

54

26. Kematian kumulatif harian ikan gurame yang divaksinasi

dengan vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi dengan

neutral buffer formalin 3% setelah diuji tantang dengan bakteri

M. fortuitum……………………………………..........................

55

27. Kematian kumulatif harian ikan gurame yang divaksinasi

dengan vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi dengan

neutral buffer formalin 3% setelah diuji tantang dengan

koinfeksi bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila……………......

56

Page 25: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Fenotipik M. fortuitum…………………………………………... 73

2. Pengujian Kadar Formalin dengan Metode AOAC (1990) .......... 74

3. Tahapan Pewarnaan Silver Hasil SDS-PAGE ............................... 75

4. Berat Protein Vaksin ..................................................................... 76

5. Hasil SDS-PAGE Protein Vaksin .................................................. 77

6. Persentase dan Indek Fagositosis .................................................. 78

7. Nilai NBT-Assay .......................................................................... 79

8. Aktifitas Komplemen .................................................................... 80

9. Titer Antibodi ................................................................................ 81

10. Relative Percent Survival (RPS) ……………........……………... 82

12. Komposisi Kandungan Media ……………………….......……… 83

Page 26: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level
Page 27: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Ikan gurame merupakan salah satu komoditas unggulan pada budidaya air

tawar, sehingga banyak dibudidayakan oleh para pembudidaya saat ini. Menurut

data FAO tahun 2010 produksi gurame sebesar 7,68% dari total produksi ikan air

tawar. Data statistik perikanan budidaya tahun 2010 menunjukkan bahwa

perkembangan ikan gurame sudah mencapai kehampir seluruh Indonesia. Sentra

budidaya ikan gurame tidak lagi sebatas daerah pulau Jawa namun meluas hingga

luar pulau Jawa.

Selain Jawa Barat yang dikenal sebagai provinsi utama penghasil gurame

di Indonesia, diketahui juga ada beberapa provinsi lain penghasil ikan tersebut

yaitu Sumatera Barat, Jawa Timur, Jawa Tengah, DI Yogyakarta, Lampung dan

Sumatera Selatan bahkan juga mulai berkembang ke wilayah Indonesia Timur

yaitu Bali, Sulawesi, Kalimantan, Nusa Tenggara dan Papua. Jawa Barat sebagai

sentra budidaya ternyata setiap tahun rata-rata masih kekurangan sebelas ribu ton

ikan gurame untuk kebutuhan konsumsi.

Demikian meluasnya penyebaran budidaya ikan gurame di Indonesia,

sehingga diperlukan prosedur budidaya yang efektif, efisien dan aplikatif terutama

jika dikaitkan dengan kendala penyakit yang seringkali menghambat budidaya.

Vaksinasi sebagai salah satu solusi aplikatif menjadi sangat diperlukan dalam

budidaya untuk mencegah terjadinya wabah dan penyebaran penyakit potensial

pada perikanan budidaya.

Kematian ikan gurame akibat infeksi bakteri Mycobacterium fortuitum dan

Aeromonas hydrophila menjadi penghambat keberhasilan produksi budidaya.

Kedua penyakit tersebut terjadi karena rendahnya ketahanan tubuh ikan,

lingkungan perairan yang buruk serta manajemen pemberian pakan yang tidak

baik. Kedua penyakit tersebut mengakibatkan kerugian ekonomi dan menurunnya

kualitas produk ikan gurame yang dihasilkan. Infeksi Mycobacteriosis dan MAS

telah dilaporkan terjadi pada budidaya ikan gurame di sekitar daerah Parung

Page 28: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

2

Bogor (Purwaningsih et al. 2012 unpublished). Berdasarkan hasil uji identifikasi

dan karakterisasi diperoleh dua jenis bakteri tersebut sebagai agen etiologinya.

Pada dasarnya A. hydrophila merupakan patogen oportunis sehingga

sangat umum dijumpai di air dan memiliki beragam serotipe yang berbeda

tingkatan virulensinya. Umumnya penyebaran terjadi secara horizontal lewat

kontak langsung dengan air atau ikan yang sakit (Irianto, 2005). Penyakit

biasanya timbul dalam tipe infeksi akut dengan kondisi klinis ditandai dengan

munculnya peradangan yang sistemik dan mengakibatkan kematian dalam waktu

24 sampai 48 jam. Tipe infeksi kronis ditandai adanya kerusakan pada bagian

sirip, lesi pada kulit, gerakan renang lemah dan menyebabkan kematian 10%

sampai 70% dari total populasi di kolam budidaya (Ibrahem et al. 2008). Penyakit

yang diakibatkan oleh infeksi A. hydrophila mulai yang bersifat akut hingga

bersifat laten membentuk infeksi septisemia yang lebih dikenal dengan nama

penyakit Hemorrhagic Septicaemia atau Aeromonas Septicemia (Ismail et al.

2010).

Bakteri M. fortuitum merupakan patogen yang dapat menyerang jenis ikan

air tawar maupun laut. Tingkat infeksi dalam suatu populasi dapat bervariasi dari

10 hingga 100% (Irianto, 2005). Penyakit akibat bakteri Mycobacterium spp

dikenal sebagai Mycobacteriosis atau fish tuberculosis. Menurut Rukmono (2010)

penyakit Mycobacteriosis dapat menyebabkan kematian 30 – 60% dari total

populasi pada budidaya ikan gurame. Mycobacteriosis merupakan jenis penyakit

kronis yang progresif, butuh waktu berminggu – minggu bahkan berbulan - bulan

untuk menunjukkan gejala klinis antara lain ikan lemah, pembengkakan pada

permukaan tubuh, mata menonjol (exopthalmia), lesi dan borok pada tubuh

(Purwaningsih et al. 2009). Ciri lain untuk mengetahui ikan terserang penyakit ini

antara lain kelesuan, anoreksia, berkurangnya jumlah sirip, kekurusan, peradangan

dan ulserasi kulit, edema, peritonitis dan terdapat benjolan pada otot.

Histopatologi penyakit ini menunjukkan granuloma yang bersifat fokal dan

multifokal pada berbagai organ internal yaitu hati, ginjal, limpa, jantung, otot

serta mata. Diagnosis biasanya berdasarkan gejala klinis dan adanya bakteri tahan

asam pada jaringan tubuh ikan (Tappin. 2007).

Page 29: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

3

Penanggulangan penyakit MAS dan Mycobacteriosis akibat infeksi M.

fortuitum dan A. hydrophila dengan metode vaksinasi monovalen telah banyak

dilakukan. Bangkit (2011) menyatakan vaksin sediaan broth M. fortuitum yang

diinaktifasi dengan formalin 1% (v/v) pada dosis 107 cfu mampu menginduksi

respon kekebalan spesifik ikan gurame dengan nilai kelangsungan hidup relatif

80%. Gesti (2011) meneliti vaksin M. fortuitum sediaan Ekstracellular Produk

(ECP) dengan dosis rendam 109 cfu mampu merangsang sistem imun ikan gurame

dengan nilai kelangsungan hidup relatif sebesar 80.02% pasca uji tantang

menggunakan bakteri M. fortuitum 106 cfu. Chen et al. (1998) juga menyatakan

bahwa ikan nila yang divaksinasi dengan produk ECP M. fortuitum menunjukkan

peningkatan jumlah nitroblue tetrazolium (NBT) dan aktivitas lisosim pada

minggu ke 2 dan 6 pascavaksinasi. Ismail et al. (2010) telah meneliti vaksin A.

hydrophila yang dibuat dalam bentuk sediaan sel utuh yang diinaktifasi

menggunakan formalin untuk menghasilkan bakterin A. hydrophila. Vaksinasi

ikan Lele (Clarias gariepinus) menggunakan sediaan vaksin sel utuh A.

hydrophila isolat AHL0905-2 yang diinaktifasi menggunakan formalin (0,5% v/v)

dan diaplikasikan melalui perendaman, menghasilkan relative percent survival

(RPS) sebesar 98,75% dengan level titer antibodi log 2 pada nilai 4 setelah

divaksinasi selama 21 hari (Sugiani et al. 2010).

Vaksinasi pada ikan merupakan upaya melindungi ikan terhadap infeksi

berbagai patogen, dapat dilakukan dengan menggunakan vaksin monovalen atau

koktail. Strategi vaksinasi harus mempertimbangkan penyakit spesifik apa yang

menginfeksi, jenis vaksin, metoda vaksinasi, pemilihan waktu vaksinasi dan

perlakuan vaksinasi ulang (booster). Vaksin koktail harus mampu melindungi dari

semua serotipe dari tiap patogen penyebab penyakit tertentu, dengan

memperhatikan kompetisi antigen spesifik yang mungkin terjadi terutama ketika

vaksin diaplikasikan melalui injeksi (Toranzo et al. 2009).

Penelitian mengenai vaksin koktail Mycobacterium fortuitum dan

Aeromonas hydrophila adalah sesuatu yang baru dan sampai saat ini belum

ditemukan publikasinya pada jurnal nasional maupun internasional. Penelitian ini

merupakan upaya awal untuk mengeksplorasi seberapa potensialnya antigen dari

M. fortuitum dan A. hydrophila sebagai bahan vaksin dalam menginduksi respon

Page 30: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

4

kekebalan spesifik pada ikan gurame untuk mencegah penyakit Mycobacteriosis

dan Motile Aeromonas Septicemia yang hingga saat ini masih sulit dikendalikan.

1.2 Tujuan Penelitian

Penelitian yang akan dilakukan bertujuan untuk :

1. Menganalisis patogenitas ko-infeksi bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila

pada ikan gurame.

2. Menganalisis sinergitas dan kompetensi kedua antigen dalam menginduksi

imunitas pada ikan gurame.

3. Mengkaji efektifitas dan efikasi vaksin koktail dari bakterin M. fortuitum dan

A. hydrophila dalam menghasilkan respons imun dan meningkatkan

kelangsungan hidup pada ikan gurame.

1.3 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan produk vaksin koktail M.

fortuitum dan A. hydrophila untuk pencegahan wabah penyakit Mycobacteriosis

dan MAS pada ikan gurame (Osphronemus gouramy).

1.4 Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila memiliki perbedaan karakteristik

patogenisitas pada ikan gurame.

2. Bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila memiliki sinergitas dan kompetensi

dalam menginduksi imunitas pada ikan gurame.

3. Vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila dapat memberikan

proteksi lebih baik dibandingkan dengan vaksin monovalen M. fortuitum

maupun vaksin monovalen A. hydrophila pada ikan gurame yang terinfeksi

M. fortuitum dan A. hydrophila (penyakit Mycobacteriosis dan MAS).

Page 31: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Mycobacteriosis

Mycobacteriosis atau fish tuberculosis merupakan penyakit bakterial yang

bersifat kronis progresif yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium sp.

Mycobacterium sp. adalah bakteri yang berbentuk batang, dengan ukuran 0.2-

0.6x1.0-10 µm, bersifat tahan asam, tidak bergerak, tidak membentuk spora atau

kapsul dan bersifat aerob. Bakteri ini banyak dijumpai di perairan tawar dan laut

maupun tanah dengan suhu optimal pertumbuhannya 25-30oC. Tidak dapat

tumbuh pada suhu 37oC kecuali M. marinum, M. fortuitum dan M. chelonei.

Ikan yang terinfeksi Mycobacterium sp. menunjukkan gejala bervariasi,

namun sering pula tidak menunjukkan gejala klinis sama sekali (Kurnia 2010).

Gejala klinis yang ditimbulkan oleh penyakit Mycobacteriosis antara lain ikan

lemah, pembengkakan pada permukaan tubuh, mata menonjol (exopthalmia), lesi

dan borok pada tubuh (Purwaningsih et al. 2009). Gejala klinis dapat dilihat

ketika penyakit mulai akut setelah beberapa bulan sampai satu tahun, menginfeksi

semua umur ikan dan semua jenis ikan baik ikan air tawar maupun ikan laut

(Tappin 2007). M. fortuitum bersifat patogen karena memiliki faktor virulensi.

Faktor virulensi dapat berupa material organik maupun bagian sel. Banyak bakteri

patogen mampu menyerang seluruh bagian tubuh inang meskipun bakteri patogen

tersebut hanya berkoloni di satu tempat saja. Hal itu karena bakteri mengeluarkan

toksin (Purwoko 2007).

Irianto (2005) menyatakan bahwa Mycobacteriosis merupakan penyakit

yang perlu mendapat perhatian karena : 1) menyebabkan kematian kronik pada

ikan dengan tingkat mortalitas rendah hingga sedang tetapi berlangsung terus

menerus, 2) Mycobacterium tidak dapat diobati dan 3) ikan yang terinfeksi

memungkinkan menularkannya kepada manusia. Penanggulangan penyakit ini

sementara dilakukan dengan menggunakan antibiotik atau zat kimia lainnya

namun hasilnya tidak signifikan. Penggunaan bahan-bahan tersebut apabila

Page 32: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

6

digunakan dalam jangka waktu lama akan berdampak negatif terhadap lingkungan

dan saat ini penggunaan bahan-bahan tersebut sudah tidak direkomendasikan lagi.

Penyakit Motile Aeromonas Septicemia (MAS)

Menurut Kamiso et al. (1993) A. hydrophila merupakan salah satu bakteri

patogen penyebab kematian pada ikan gurame. Gejala klinis dari ikan Gurame

yang terinfeksi Motile Aeromonas Septicemia (MAS) ditandai dengan adanya

septicemia, luka, cacat tulang, eksoptalmia dan nekrosis otot. Penelitian yang

dilakukkan oleh Ibrahem et al. (2008) diperoleh hasil isolasi dan identifikasi jenis

bakteri A. hydrophila dari bagian organ intestinal ikan yang sakit maupun ikan

yang sudah sehat, hal ini dapat terjadi pada kondisi invasi penyakit ataupun

kondisi MAS yang akut dengan adanya lokalisasi koloni bakteri A. hydrophila

yang teridentifikasi dari jaringan hematopoetik. Pada kondisi posmortem

ditemukan adanya luka fokal pada organ hati, limpa, dan ginjal serta terdapat

cairan yang mengisi rongga abdominal.

Uji biokimia identifikasi terhadap Aeromonas hydrophila antara lain

dengan reaksi voges-proskauer (VP), citrate utilization, lysine decarboxylase

(LDC), arabinosa dan tes fermentasi amygadalin untuk melihat tingkat virulensi

dari bakteri. Reaksi biokimia berkorelasi dengan tingkat virulensi. Variasi tingkat

virulensi dari spesies penyebab Motile Aeromonas dapat dilihat dengan uji

karakteristik biokimia dari bakteri A. hydrophila (Toranzo et al. 1986). Burke et

al. (1983) mengemukakan hubungan yang signifikan antara tingkat virulensi A.

hydrophila pada ikan dengan produksi asam dari arabinosa dan sukrosa, tes VP

dan LDC, penambahan elastase dan aktifitas hemolitik.

Tingkat virulensi dari mikroorganisme berasosiasi dengan produksi enzim

tertentu. Hal ini mengindikasikan bahwa tes yang bersifat enzimatik dapat

digunakan untuk mengidentifikasi bakteri A. hydrophila. A. hydrophila secara

khas menghasilkan hemolisin. Beberapa strain menghasilkan enterotoksin. Sakai

et al. (1993) menyatakan uji aktifitas hemolitik isolat A. hydrophila pada media

TSA yang diberi 5% Red Blood Cells (RBCs) domba menunjukkan hasil bahwa

72% bakteri A. hydrophila dengan 2 tipe aktifitas hemolitik, isolat A. hydrophila ß

Page 33: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

7

hemolitik dan strain A. hydrophila non hemolitik. Ada suatu korelasi antara

hemolisin dan virulensi isolat A. hydrophila. A. hydrophila mampu memproduksi

hemolisin ekstraselular dengan membentuk zona hemolisis pada media agar

darah. Terdapat korelasi yang kuat antara hasil dari uji biokimia, aktifitas

enzimatik, aktifitas hemolitik dan tes patogenisitas dari isolat A. hydrophila

dengan tingkat virulensinya. Sangat direkomendasikan untuk melakukan

serangkaian uji tersebut untuk melihat tingkat virulensi dari isolat A. hydrophila

(Ibrahem et al. 2008).

Bakteri Mycobacterium fortuitum

Najiah et al. (2011) menyatakan fenotipik bakteri M. fortuitum diketahui

memiliki karakteristik yaitu tahan asam, memiliki panjang 3-6 µ, non

photochromogenik, mampu tumbuh pada suhu 28 - 37°C, dapat tumbuh pada

media Ogawa, Lowenstain Jenssen, Mac Conkey dengan kristal violet, Blood

Agar, Tryptic Soy Agar, Briliant Heart Infusion Agar, Sauton Agar, Nutrient

Agar, Middlebrook 7H10, Baird Parker Agar, TCBs, EMB, NaCl 3 dan 5%

,mampu menghidrolisa tween, memiliki enzym arylsulfatase dan katalase, dapat

mereduksi nitrat dan tellurite, mengurai amilum pada media acetat, suksinat,

piruvat, glukosa, fruktosa, sukrosa, arabinose, trehalose, mannitol dan galaktosa,

hal tersebut selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 1.

Faktor virulensi bakteri Mycobacterium terletak pada dinding sel antara

lain : 1) Antigen 85 kDa, fungsinya dalam aktivitas mycolyltransferase untuk

mentransfer asam mycolic rantai panjang kederivat trehalosa, penting untuk

biosintesis dinding sel mikobakteri dan untuk kelangsungan hidup ; 2) LAM

(lipoarabinommannan), merupakan inducer kuat sitokin kemoatraktan. PILAM

(phospho-myo-inositol-capped LAM) juga dapat menginduksi respon proinflamasi

ampuh dalam makrofag dan sel dendritik ; 3) MmaA4 (methyltransferase forms

methoxy and keto derivatives of the meromycolic acid chain) ; 4) PcaA adalah

siklopropana sintase yang menggabungkan cycloproprane cincin proksimal

tunggal pada asam α-mycolic dan produksi cord factor dalam dinding sel,

diperlukan untuk faktor virulensi dan ketahanan ; 5) PDIM (phthiocerol

Page 34: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

8

dimycocerosate), berperan memberikan dasar yang stabil untuk penyisipan lipid

lain dan juga berperan sebagai pengubah fluiditas, yang fungsinya untuk

memodulasi viskositas dinding sel (Takayama et al. 2005 ; Ronning et al. 2000;

Briken et al. 2004).

Menurut Chen et al. (1997), bahwa Mycobacterium tuberculose memiliki

aktivitas enzim mucinase, lipase, RNase, DNase tetapi tidak memiliki aktivitas

protease. Aktivitas mucinase juga terdeteksi pada M. marinum sedangkan lipase

dan RNase pada M. chelonei dan M. fortuitum. Aktivitas enzimatik tersebut dapat

berperan sebagai faktor virulensi pada Mycobacterium.

Bakteri Aeromonas hydrophila

Noga (1997) mengemukakan bahwa isolat A. hydrophila merupakan

bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek berukuran 1-4 µm, oxidase-positif,

mampu menfermentasi glukosa, mampu tumbuh dalam media agar Mac Conkey,

bersifat motil dan koloni berbentuk bulat halus dengan diameter 2-3 mm, ukuran

lebar sel 0.3-1 μm dan panjang sel 2-4.5 μm. Identifikasi juga dapat dilakukan

menggunakan sistem tes kit API 20 NE. Media identifikasi selektif Rhimler-

Shotts (media R-S) dibuat oleh Shotts dan Rhimler (1973) untuk mempermudah

identifikasi jenis bakteri aeromonad yang akan membentuk koloni berwarna

kuning pada media.

Uji biokimia A. hydrophila menunjukkan hasil reaksi positif pada sitokrom

oksidase, hidrolisis gelatin, produksi indol, glukosa, sukrosa, fermentasi manitol,

arginin dehidrolase dan tes ß- galaktosidase. Sebagian isolat positif pada media

Voges Proskauer, lisin dekarboksilase, tripsin, fermentasi tes arabinosa, ß-

glukosidase, ß-glaktosidase, ß-glukuronidase, ∞-glukosidase, dan valin

arilamidase. Identifikasi enzimatik menggunakan sistem tes kit API ZYM

menunjukkan bahwa isolat bereaksi positif pada alkalin fosfatase, butirat esterase

(C4), caprilat esterase (C8), miristate lipase (C14), leusin arilamidase dan N-

asetil- ß-glukosaminidase, asam fosfatase dan fosfomidase. Beberapa isolat

menunjukkan hasil negatif pada sistein arilamidase, chimotripsin, α-mannosidase

Page 35: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

9

dan α-fukosidase. Aktifitas hemolitik ada yang bersifat ß –hemolitik, α- hemolitik,

dan non-hemolitik (Ibrahem et al. 2008).

Menurut Rajeswari et al. (1999), Aeromonas merupakan mikroflora

normal perairan, namun bakteri tersebut adalah patogen oportunistik pada

berbagai golongan poikilotermal immunocompromised dan homeotermal. Infeksi

A. hydrophila menyebabkan infeksi saluran pencernaan, luka dan infeksi sistemik.

Faktor potensi virulensi bakteri tersebut termasuk endotoksin, hemolisin,

sitotoksin dan protease. Sirirat et al. (1999) melaporkan bahwa protein yang

berukuran 52 kDa adalah aerolisin yang merupakan protein permukaan S-layer

dianggap sebagai salah satu faktor virulensi.

Imunologi Ikan

Pada mulanya ikan teleostei dianggap tidak memiliki suatu reaksi

kekebalan, namun setelah ditemukan suatu reaksi kekebalan pada ikan salmon

mengugurkan pendapat tersebut. Ikan seperti hewan pada umumnya, memiliki

mekanisme pertahanan diri (sistem imun) terhadap patogen. Meskipun sistem

imun belum selengkap pada vertebrata tingkat tinggi tetapi sistem imun ikan jauh

lebih berkembang dibandingkan dengan sistem imun pada invertebrata. Respon

imun dibentuk oleh organ limfoid, organ limfoid ikan letaknya menyatu dengan

jaringan myeloid sehingga dikenal dengan jaringan limfomyeloid.

Sistem pertahanan spesifik tubuh ikan terbagi menjadi dua, yaitu

pertahanan seluler (antibody production) dan pertahanan humoral (cell mediated

immunity). Paparan antigen menghasilkan stimulasi sejumlah sel limfosit muda

yang dapat mengenali antigen melalui reseptor spesifik. Pada awal kehidupannya,

sistem pertahanan ikan yang mula-mula berfungsi adalah sistem pertahanan non-

spesifik, sedangkan pertahanan spesifik pada ikan baru berkembang dan dapat

berfungsi dengan baik sekitar umur beberapa minggu setelah telur menetas (Ellis.

1988).

Menurut Anderson (1974) respon seluler pada ikan merupakan respon

imun yang bersifat non spesifik. Respon ini meliputi pertahanan mekanik dan

Page 36: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

10

kimiawi (mukus, kulit, sisik dan insang) dan pertahanan seluler (sel makrofag,

leukosit seperti limfosit, monosit, neutrofil, eosinofil dan basofil). Mekanisme

pertahanan tubuh yang sinergis antara pertahanan humoral dan seluler

dimungkinkan oleh adanya interleukin, interferon dan sitokin, yang berperan

sebagai komunikator dan amplikasi dalam mekanisme pertahanan humoral dan

seluler ikan. Ellis (2001) mengemukakan bahwa respon dan faktor humoral terdiri

dari serum amiloid protein, antibodi, lisosim, transferin, interferon, antiprotease,

lektin, lisin, protease, protein C-reaktif, dan komplemen. Sedangkan respon dan

faktor seluler antara lain adalah makrofag, killer cell, neutrofil, reaksi penolakan

allograft dan hipersensitifitas.

Sistem kekebalan tubuh ikan terhadap antigen melalui mekanisme fagosit

dengan perantara makrofag dan granular leukosit, sebagai contoh neutrofil

menyerang mikroorganisme yang masuk melalui jaringan kulit ikan atau mukus.

Selain itu ada lisosim dan komplemen lain yang merusak patogen. Komponen

spesifik dalam sistem imun, terdiri dari humoral dan respon sel memori, walaupun

memori imun pada ikan secara umum sangat kurang berkembang dibandingkan

hewan tingkat tinggi lainnya. Tingkat induksi dan respons imun ikan sangat

dipengaruhi oleh suhu perairan (Anderson, 1999).

Produksi antibodi adalah suatu proses yang terjadi dalam limfosit sebagai

reaksi terhadap adanya bahan protein asing (antigen), termasuk sel – sel bakteri.

Antibodi dapat bekerja melalui 3 cara : 1) langsung menyerang benda asing, 2)

melalui pengaktifan sistem komplemen untuk menghancurkan benda asing dan 3)

pengaktifan sistem yang mengubah lingkungan antigen benda asing. Kemampuan

mengadakan reaksi terhadap rangsangan imunologik terletak pada sel – sel

limfoid yaitu sel B dan sel T. Pemaparan pertama dengan suatu antigen

merangsang sel T memunculkan sel – sel efektor respon imun yang diperantarai

sel. Sel efektor ini berperan dalam menyingkirkan dan membunuh benda asing.

Disamping itu sel T dibantu makrofag dalam menghancurkan benda asing atau

merangsang sel B untuk meningkatkan produksi antibodi. Limfosit B

berdiferensiasi menjadi sel plasma menghasilkan antibodi spesifik untuk

menstimulasi antigen juga membentuk sel memori. Walaupun sulit diukur,

imunitas seluler juga akan meningkat pada pemaparan ke 2 kalinya.

Page 37: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

11

Tanggap kebal adaptif dapat terbentuk pada kelompok teleostei seperti

ikan dan dapat dideteksi dalam hitungan hari bahkan minggu (4-6 minggu) dari

infeksi atau peradangan awal tergantung dari suhu lingkungan. Press & Evensen

(1999) menyatakan bahwa tanggap kebal adaptif terdiri dari jaringan sel protein

komplek, pengantar pesan biokimia (sitokin) dan gen yang bekerja sama untuk

menghasilkan suatu induksi tanggap kebal spesifik yang memerlukan Abs

(antibodi spesifik) dan Ags (antigen spesifik). Menurut Fujaya (2004) bahwa

perolehan kekebalan aktif pada ikan tergantung pada peran serta jaringan dan sel –

sel hospes setelah bertemu dengan imunogen.

Vaksinasi pada Ikan

Vaksinasi merupakan upaya untuk meningkatkan respon imun terhadap

patogen tertentu yang berdasar pada dua elemen imunitas adaptif yaitu spesifitas

dan memori. Antigen yang digunakan sebagai vaksin dapat berupa organisme

hidup yang masih ganas atau sudah dilemahkan, organisme utuh yang dimatikan,

fragmen subseluler dan antigen permukaaan sel, toksin yang diinaktifkan,

rekombinan DNA dan anti – idiotipe.

Vaksin bakteri adalah antigen buatan yang berasal dari suatu jasad patogen

yang tidak bersifat patogen lagi karena sudah dilemahkan atau dimatikan, yang

akan merangsang sistem imun dengan cara meningkatkan kekebalan ikan dari

infeksi patogen selanjutnya (Ellis. 1988). Umumnya ada dua tipe vaksin, yaitu

vaksin mati (dead vaccine) dan vaksin hidup (live vaccine). Vaksin mati yang

berupa organisme patogen yang dinonaktifkan (dimatikan) dengan cara

pemanasan yaitu pada suhu 100oC (heat killed), formalin (formaline killed) dan

penghancuran dengan menggunakan sonikator (sonic killed), sedangkan vaksin

hidup yang berupa organisme patogen yang dilemahkan tanpa atau dengan

mengurangi virulensinya (Ellis. 1988).

Ikan dapat diimunisasi dengan tiga cara yaitu melalui injeksi

(intraperitoneal), perendaman dalam larutan vaksin dan melalui oral (dicampur

dengan pakan). Ketiga cara ini memiliki keuntungan dan kerugian yang akan

Page 38: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

12

mempengaruhi level proteksi, efek samping dan biaya yang harus dikeluarkan

untuk kegiatan vaksinasi. Pemberian vaksinasi melalui injeksi telah banyak

digunakan pada skala industri dan kegiatan riset di laboratorium dengan hasil

yang baik dan alur mekanisme pembentukan respons imunnya juga telah

diketahui, akan tetapi pemberian vaksin melalui oral dan perendaman masih

belum banyak diketahui alur penyerapan antigen dan presentasi antigen setelah

diserap (Gudding et al. 1999).

Vaksin yang efektif harus memenuhi 3 syarat utama yaitu 1) mampu

menginduksi imunitas yang tepat, 2) stabil dalam penyimpanan dan 3) bersifat

imunogenik. Adanya perbedaan sifat antigenik yang beragam antara kelompok

organisme yang komplek, maka diperlukan strategi penggunaan vaksinasi, baik

dengan menggunakan monovalen dan vaksin koktail. Menurut Baba et al, (1988)

bahwa vaksinasi dengan larutan antigen ekstraselular lebih efektif dalam

memberikan perlindungan melawan serotipe yang heterolog dibandingkan dengan

vaksin yang hanya terdiri dari satu jenis sel utuh dari antigen.

Formula vaksin ideal adalah sediaan vaksin koktail yang dapat

memproteksi secara simultan terhadap beberapa patogen penting penyebab suatu

penyakit dan efektif digunakan untuk spesies ikan yang luas. Vaksin koktail

adalah sediaan vaksin yang terdiri dari dua atau lebih antigen yang berasal dari

jenis atau strain yang berbeda. Formula vaksin koktail harus dibuat dengan teliti

karena masalah kompetisi antigen dapat muncul terutama ketika vaksin tersebut

diaplikasikan melalui injeksi (Toranzo et al. 2009).

Penelitian mengenai vaksin koktail telah banyak dilakukan walaupun

memberikan hasil yang bervariasi. Hoel et al. (1997) membuat vaksin koktail

yang berisi bakteri A. salmonicida, Vibrio salmonicida dan V. anguillarum.

Respons imun humoral Atlantic salmon yang divaksin dengan vaksin koktail lebih

baik dalam memberikan proteksi terhadap antigen A. salmonicida dibandingkan

dengan vaksin monovalen. Gassent et al. (2004) melakukan vaksinasi pada

Anguilla anguilla L. menggunakan vaksin bivalen yang terdiri dari bakteri V.

vulnificus strain CECT 4604 dan CECT 5198 untuk menanggulangi penyakit pada

A. Anguilla (eel disease). Aplikasi melalui oral dan injeksi memberikan proteksi

Page 39: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

13

tinggi sebesar 80-100%. Penelitian yang dilakukan oleh Bastardo et al. (2012)

memperoleh hasil vaksin koktail Lactococcus garvieae dan A. hydrophila

memberikan level proteksi sebesar 70% setelah diuji tantang ko-infeksi dan level

antibodi tertinggi terdeteksi pada 15 hari post vaksinasi.

Page 40: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

14

BAB III

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan Balai Penelitian

dan Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT) Bogor, Laboratorium

Mikrobiologi Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan kesehatan Masyarakat

Veteriner – Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Terpadu – Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya dan Laboratorium Uji Balai Besar Pengolahan

Produk Perikanan dan Bioteknologi (BBP3B) Jakarta. Penelitian dilakukan pada

bulan Desember 2012 - Juni 2013.

Ikan Uji

Ikan uji menggunakan ikan Gurame (Osphronemus gouramy ) berukuran

25 - 30 g. Ikan yang digunakan harus memenuhi asumsi Spesifik Pathogen Free

(SPF) bebas dari karakteristik yang akan muncul ketika terinfeksi penyakit

Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia, melewati masa aklimatisasi

selama 14 hari. Ikan uji yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 1.080 ekor,

dengan rincian 150 ekor untuk uji tahap 1, 210 ekor untuk uji tahap 2 serta 720

ekor untuk uji tahap 3 dan 4.

Isolat Bakteri

Bakteri Mycobacterium fortuitum dan Aeromonas hydrophila

menggunakan isolat koleksi BPPBAT Kementerian Kelautan dan Perikanan,

Bogor. A. hydrophila diinokulasi dalam media Tryptic Soy Agar (TSA)

menggunakan A. hydrophila isolat AHL0905-2 dan M. fortuitum diinokulasi

dalam media Sauton Agar (SA) menggunakan M. fortuitum isolat 31.

Vaksin

Ada 2 sediaan vaksin monovalen yang di uji pada penelitian ini, yaitu

vaksin monovalen sel utuh A. hydrophila (Sugiani. 2012) dan vaksin monovalen

Page 41: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

15

sel utuh M. fortuitum (Purwaningsih et al. 2012) dan 3 sediaan vaksin koktail

bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila.

Alur Pelaksanaan Penelitian

Penelitian dilakukan dalam 4 tahapan penelitian yang disajikan pada Gambar 1.

Gambar 1 Alur pelaksanaan penelitian vaksin koktail untuk pencegahan

penyakit Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia

pada ikan Gurame (O. gouramy).

Tahap 2

Kajian preparasi vaksin M. fortuitum dan A. hydrophila

Sediaan vaksin

Komponen vaksin terdiri dari vaksin sel

utuh dan koktail

Fraksinasi protein melalui SDS-PAGE

Uji kualitas vaksin

Uji keamanan vaksin (innocuity

test), uji sterilitas vaksin (sterility

test) dan uji kadar formalin

Tahap 3

Efikasi vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan

gurame (Osphronemus gouramy)

Melakukan analisis spesifik respon vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A.

hydrophila secara in vivo pada ikan gurame

gambaran darah, patologi klinik darah, aktifitas Respiratory Burst, aktifitas

komplemen dan titer antibodi

Tahap 1 Uji patogenitas ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila

Gejala klinis, gambaran darah, patologi klinik darah, histopatologi dan

kematian ikan

Tahap 4

Proteksi silang vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila

pada ikan gurame (Osphronemus gouramy)

Melakukan analisis respon proteksi silang vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum

dan A. hydrophila terhadap mono infeksi dan ko-infeksi secara in vivo pada ikan

gurame

RPS, gambaran darah, patologi klinik darah, aktifitas Respiratory Burst, aktifitas

komplemen dan titer antibodi

Page 42: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

16

Tahap 1

Uji patogenitas ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame

(O. gouramy)

Ko-infeksi adalah infeksi bersama dua atau lebih agen patogen yang dapat

menyebabkan inang menjadi sakit. Uji patogenitas ko-infeksi M. fortuitum dan

A. hydrophila pada ikan gurame dilakukan dengan menginjeksikan secara

intraperitoneal yaitu M. fortuitum 107

cfu dan A. hydrophila 108 cfu. Infeksi A.

hydrophila dilakukan pada hari ke – 21 pascainfeksi dengan M. fortuitum.

Pengamatan dilakukan selama 28 hari untuk melihat dampak infeksi pada

ikan gurame. Parameter yang diamati antara lain patologi klinik darah,

gambaran darah, histopatologi dan kematian ikan uji.

Tabel 1 Perlakuan ko-infeksi LD50

Perlakuan Tipe bakteri Perbandingan volume bakteri Kode

1

2

3

4

Mf : Ah

Mf : Ah

Mf : Ah

PBS

75 : 25

50 : 50

25 : 75

-

A

B

C

D

Mf (M. fortuitum) ; Ah (A. hydrophila) ; PBS (Phosphat Buffer Saline pH 7.2)

Tahap 2

Kajian Preparasi vaksin M. fortuitum dan A. hydrophila

1. Preparasi sediaan vaksin

Pembuatan vaksin koktail menggunakan cara kultur dengan modifikasi

metode kultur terpisah menurut Silva et al. (2009). Proses inaktifasi vaksin

dilakukan dengan menambahkan neutral buffer formalin dalam sediaan kultur

bakteri. Untuk membentuk vaksin koktail maka setiap sediaan vaksin

dicampurkan sesuai perbandingan komposisi yang telah ditentukan (v/v).

Page 43: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

17

Vaksin yang akan dibuat pada penelitian ini adalah vaksin koktail yang

berisi campuran dari sel utuh bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila. Prosedur

pembuatan vaksin yang akan dilakukan adalah sebagai berikut :

1.1 Sediaan vaksin sel utuh

Vaksin sel utuh bakteri M. fortuitum, dibuat dengan modifikasi metode

Purwaningsih et al. (2012), bakteri M. fortuitum diinokulasi kedalam media

Sauton broth diinkubasi di inkubator dengan shaker selama 72 jam pada suhu

37oC. Hasil kultur ditambahkan neutral buffer formalin 3%, kemudian

dihomogenkan selama 24 jam. Hasil inaktifasi disentrifus pada 3000 g selama 30

menit, pelet sel bakteri dan supernatan dipisahkan, kemudian pelet diresuspensi

dalam PBS pH 7,2 dengan rasio 1:10 (v/v).

Vaksin sel utuh A. hydrophila, dibuat dengan modifikasi metode Sugiani

(2012). Bakteri A. hydrophila diinokulasi dalam media BHI, diinkubasi dalam

inkubator dengan shaker selama 24 jam pada suhu 32oC. Kultur bakteri

diinaktivasi dengan menambahkan neutral buffer formalin hingga konsentrasi

akhir formalin menjadi 3% (v/v) selama 24 jam. Sel utuh bakteri Inaktif diperoleh

dengan mensentrifus pada 3000 g selama 30 menit dan pelet (endapan) sel

diresuspensi dengan PBS (pH 7,2) dengan rasio 1:10 (v/v).

Masing-masing suspensi M. fortuitum dan A. hydrophila dicuci sebanyak

3 kali dengan mensentrifus suspensi bakteri pada 10.000 g selama 10 menit pada

suhu 4 oC, kemudian diresuspensi dengan PBS pH 7,2. Suspensi bakteri yang

telah dicuci dikombinasikan dengan perbandingan tertentu (v/v) M. fortuitum : A.

hydrophila untuk membentuk vaksin koktail.

2. Uji kualitas vaksin koktail

2.1 Uji keamanan vaksin (Innocuity test)

Uji keamanan vaksin menggunakan metode Anderson et al. (1970) dengan

menginokulasi bakterin dari sediaan vaksin pada ikan gurame ( O. gouramy )

secara intra peritoneal (IP) dan sebagai kontrol ikan diinjeksi dengan PBS.

Setelah 28 hari dilakukan reisolasi bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila dari

ikan perlakuan untuk melihat koloni bakteri yang sama. Vaksin yang dikatakan

Page 44: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

18

aman jika hasil dari reisolasi tidak diperoleh bakteri aktif yang sama dengan isolat

vaksin.

2.2 Uji sterilitas vaksin (Sterility test)

Uji sterilisasi seperti yang dilakukan Aly (1981) dengan melakukan

kultivasi sediaan vaksin dalam BHIA dan Sauton agar yang diinkubasi pada suhu

28°C selama 24 jam dan 37°C selama 72 jam untuk memastikan tidak ada bakteri

yang tumbuh dari jenis A. hydrophila dan M. fortuitum yang sama seperti bakterin

sediaan vaksin.

2.3 Uji kadar formalin vaksin

Uji kuantitatif untuk melihat residu kadar formalin yang terkandung dalam

sediaan vaksin setelah inaktifasi dilakukan dengan menggunakan metode AOAC

(1990). Tahapan analisis dapat dilihat pada Lampiran 2. Penyerapan warna dilihat

dengan alat spektrofotometer pada absorban 415 nm.

Hasil analisis dimasukkan ke dalam rumus:

Kadar formalin (ppm)

Keterangan :

Ca : Mikrogram formalin dari kurva

W : berat contoh (gram)

F : faktor pengenceran

2.4 Analisa protein sel utuh menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate–

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE) Preparasi sediaan lysate sel utuh dari M. fortuitum dan A. hydrophila

diisolasi menggunakan metode pemurnian Encheva et al. (2006). Sebanyak 200

mg (berat basah) sel diresuspensi dalam 1 mL lysis buffer (0.2% SDS, 133 mm

DTT, 17 mm MgCl2, 50 mm Tris) yang berisi 375 U benzonase (Sigma) dan 350

U mutanolysin (Sigma). Sel diinkubasi 24 jam pada 37oC kemudian dipindahkan

ke dalam Lysing Matrix B tubes (MP Biomedicals) dan dihomogenkan selama 30

menit dalam FastPrep-24 (MP Biomedicals) dengan pendinginan setiap 2 menit

diatas es.

Page 45: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

19

Sel utuh disentrifus pada 16.000 g selama 30 menit pada suhu 4oC, dan

supernatan dikumpulkan kemudian disimpan pada -80oC. Setiap isolat, berisi

protein dalam 100 µL aliquot dipresipitasi menggunakan trichloroacetic acid /

acetone dan diresuspensi pada volume yang sama dengan PBS, untuk menguji

sterilitas dari protein dilakukan protein assays, di mana konsentrasi protein diuji

menggunakan Micro BCA-Protein Assay (Pierce).

Whole-cell lysates dari setiap isolat dianalisa dengan SDS–PAGE

(LaFrentz et al., 2004). Protein (25 μg) dipisahkan dalam 12% polyacrylamide

gel menggunakan Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad) dan kemudian diwarnai

dengan Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad). Precision Plus protein standards (Bio-

Rad) digunakan untuk menghitung masa molekul dari pita protein. Gel kemudian

di foto menggunakan Densitometer (Bio-Rad).

Tahap 3

Efikasi vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila pada

ikan gurame (O. gouramy)

Pengujian vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila pada

ikan gurame uji dilakukan mengunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan

komponen perlakuan sebagai berikut :

Tabel 2. Komponen perlakuan vaksin

Perlakuan Komponen vaksin

1

2

3

4

5

6

25 (su Mf) : 75(su Ah)

50 (su Mf) : 50(su Ah)

75 (su Mf) : 25(su Ah)

su Ah

su Mf

K

Mf (Mycobacterium fortuitum), Ah (Aeromonas hydrophila), su (sel utuh), K (kontrol)

Kajian terhadap respon imun spesifik dan non spesifik dilakukan

pengambilan sampel darah ikan gurame pada minggu ke -1, minggu ke -2 dan

minggu ke -3 pasca vaksinasi untuk pemeriksaan titer antibodi, aktifitas

respiratory burst, komplemen, aktifitas fagositosis, patologi klinik darah dan

gambaran darah.

Page 46: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

20

Tahap 4

Proteksi vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan

gurame (O. gouramy)

Kajian efektivitas vaksin koktail terhadap pengaruh mono infeksi dan ko-

infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila dilakukan pada hari ke – 21 pasca

vaksinasi dengan menginjeksikan pada masing – masing perlakuan dengan mono

infeksi M. fortuitum 107 cfu, A. hydrophila 10

8 cfu dan infeksi gabungan

keduanya (Tabel 3).

Pengamatan terhadap uji tantang dengan monovalen A. hydrophila

dilakukan selama 14 hari sedangkan uji tantang dengan monovalen M. fortuitum

dan ko-infeksi diamati selama 28 hari. Parameter uji yang diukur dalam tahap ini

antara lain titer antibodi, aktifitas respiratory burst, komplemen, aktifitas

fagositosis, patologi klinik darah dan gambaran darah.

Tabel 3 Perlakuan proteksi vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A.

hydrophila

Perlakuan Ulangan Komponen vaksin Komponen uji tantang

1

2

3

4

5

6

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

25 (su Mf) : 75(su Ah)

25 (su Mf) : 75(su Ah)

25 (su Mf) : 75(su Ah)

50 (su Mf) : 50(su Ah)

50 (su Mf) : 50(su Ah)

50 (su Mf) : 50(su Ah)

75 (su Mf) : 25(su Ah)

75 (su Mf) : 25(su Ah)

75 (su Mf) : 25(su Ah)

su AH

su AH

su AH

su MF

su MF

su MF

K

K

K

M. fortuitum

A.hydrophila

Ko-infeksi

M. fortuitum

A.hydrophila

Ko-infeksi

M. fortuitum

A.hydrophila

Ko-infeksi

M. fortuitum

A.hydrophila

Ko-infeksi

M. fortuitum

A.hydrophila

Ko-infeksi

M. fortuitum

A.hydrophila

Ko-infeksi

Mf (Mycobacterium fortuitum),Ah (Aeromonas hydrophila), su (sel utuh), K (kontrol)

Page 47: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

21

Parameter yang Diamati

Beberapa parameter uji yang diamati pada penelitian ini diantaranya

adalah kematian ikan, gejala klinis dan gambaran sistem imun ikan.

Gejala klinis

Gejala klinis ikan diamati dengan melihat tingkah laku makan, berenang,

respon terhadap kejutan dan perubahan anatomi bagian luar tubuh ikan maupun

organ dalam ikan.

Hematologi dan gambaran sistem imun

Pengamatan hematologi dan gambaran sistem imun dilakukan dengan

mengamati sampel darah yang diambil dari ikan perlakuan kemudian diukur kadar

hemoglobin menurut metode Sahli (Wedenmeyer & Yasutake 1977). Kadar

hematokrit menurut metode Anderson dan Siwicki (1995). Aktifitas fagositosis

meliputi indek fagositik dan persen fagositosis dievaluasi menggunakan metode

Zhang et al. (2008).

Produksi oksigen radikal dari fagositosis dalam darah dapat dilihat dengan

pewarnaan nitroblue tetrazolium (NBT-Assay) seperti yang dilakukan Anderson

dan Siwicki (1995). Aktifitas komplemen (Complement consumption assay)

dilakukan menggunakan metode Vivas et al. (2005). Titer antibodi diukur dengan

menggunakan aglutinasi langsung (direct aglutination) terhadap antigen-antibodi

perlakuan.

1 Gambaran hematologi

Darah diambil secara intra muscular dari caudal vein ikan menggunakan

spuit yang telah diberi heparin sebagai antikoagulan, darah disimpan pada suhu

15oC. kemudian diukur kadar hemoglobin menurut metode Sahli dengan

salinometer (Wedenmeyer dan Yasutake 1977), kadar hematokrit menurut metode

Anderson dan Siwicki (1993).

2 Indek fagositosis

Aktifitas fagositosis dievaluasi menggunakan metode Zhang et al. (2008)

dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 100 µL suspensi Staphylococcus aureus

kepadatan 107 cfu/mL dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf, ditambahkan 200

µL darah dengan heparin dan dihomogenkan menggunakan vortex, kemudian

Page 48: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

22

diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30 oC. Sebanyak 1 mL salin ditambahkan

ke dalam tabung dan dihomogenkan. Solusi homogenat disentrifus dengan 3.000 g

selama 5 menitl lalu 1 mL supernatan diambil kemudian dibuang dan sisa solusi

dihomogenkan kembali. Diambil satu tetes homogenat, dibuat preparat ulas di atas

slide glass. Preparat difiksasi dengan metanol selama 2-3 menit, kemudian dicuci

dengan akuades, preparat dikeringanginkan, tahap akhir preparasi diwarnai

dengan pewarna giemsa. Preparat diamati di bawah mikroskop. Persen Fagositosis

(PF) dan Indek Fagositosis (IF) dihitung menggunakan rumus:

PF =(N1/100)x100

IF = N2/100

Keterangan :

N1 : total jumlah fagosit yang memakan (engulfing) bakteri secara acak dari 100

fagosit yang terhitung.

N2 : total jumlah bakteri yang dimakan oleh fagosit dari 100 fagosit yang

terhitung.

3 Uji Respiratory burst (NBT-assay)

Produksi oksigen radikal dari fagositosis dalam darah dapat dilihat dengan

pewarnaan nitroblue tetrazolium (NBT). Sebanyak 50µl sampel darah dengan

heparin diletakkan pada sumur microplate well “U” diinkubasi selama 1 jam pada

suhu 37ºC kemudian dicuci dengan PBS dan ditambahkan 50µl 0.2% NBT,

suspensi NBT - sel darah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 25°C. Setelah itu

lakukan fiksasi dengan metanol 100% selama 2 – 3 menit dilanjutkan dengan

metanol 30% sebanyak 3 kali. Kemudian dikeringanginkan, selanjutnya

tambahkan 60 µl kalium hydroxide dan 70 µl larutan dimethylsulfoxide. Analisa

produksi radikal oksigen dengan menggunakan NBT (nitroblue tetrazolium)

dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540

nm (Anderson and Siwicki, 1995).

4 Aktifitas komplemen

Aktifitas komplemen (Complement consumption assay) dilakukan

menggunakan metode Vivas et al. (2005) yang dimodifikasi. Sebanyak 200 µL

serum ikan dan 200 µL suspensi bakteri A. hydrophila (108 cfu/mL) dicampurkan

Page 49: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

23

dengan PBS steril dalam 1,5 mL tabung Eppendorf. Sebanyak 200 µL serum ikan

dan 200 µL suspensi bakteri M. fortuitum (108 cfu/mL) dicampurkan dengan PBS

steril dalam 1,5 mL tabung Eppendorf. Sebanyak 200 µL serum ikan dan 100 µL

suspensi bakteri A. hydrophila dan 100 µL suspensi bakteri M. fortuitum

dicampurkan dengan PBS steril dalam 1,5 mL tabung eppendorf, untuk kontrol

tabung eppendorf hanya diisi dengan PBS. Tabung diinkubasi selama 1,5 jam

pada suhu 16 oC. Ditambahkan 400 µL PBS ke dalam setiap tabung dan suspensi

difilter menggunakan filter 0,22 µm.

Larutan hasil filtrasi dimasukkan ke dalam mikrotiter 25 µL, ditambahkan

secara serial (serial two-fold dilutions) 2% suspensi rabbit red blood cells

(RaRBC) dalam PBS yang kemudian diinkubasi selama 1,5 jam pada 16 oC.

Tahap selanjutnya ditambahkan 100 µL 0,9% salin dingin (ice-cold), dan sel

diendapkan dengan cara disentrifus (1.400 g, 5 menit, 4 oC). Absorban supernatan

dilihat dengan 405 nm. 100% hemolisis diperoleh dengan menambahkan 25 µL

RaRBC dan 175 µL akuades sedangkan aktifitas lisis (spontaneous lysis)

diperoleh dengan menambahkan 25 µL RaRBC dan 50 µL PBS, setelah 1 jam

diinkubasi ditambahkan 100 µL 0,9% salin. Aktifitas komplemen dihitung dengan

melihat hemolisis pada RaRBC, hasil dimasukkan dalam rumus berikut :

Percent haemolysis = {(A405(sampel) –A405(spontaneous lysis))/(A405 (100%

haemolysis)- A405(spontaneous lysis)} x 100%

5 Titer Antibodi

Pengamatan titer antibodi dilakukan untuk mengamati antibodi yang

dihasilkan oleh ikan setelah diberi perlakuan. Pengamatan dilakukan terhadap

beberapa ekor sampel ikan uji. Pengukuran titer antibodi dilakukan sebelum

dilakukan vaksinasi, minggu ke tiga pada masa induksi vaksin dan minggu ke 4

setelah uji tantang. Serum darah ikan uji diperoleh dengan cara darah diambil

menggunakan jarum suntik, kemudian dimasukkan ke dalam microtube 1.5 ml.

Agar serum yang didapat benar-benar bersih dan terpisah dari sel darah, maka

darah disentrifus, serum yang diambil bisa diambil dari supernatan. Kemudian

dilakukan uji aglutinasi dalam microplate. Keberadaan antibodi dapat dideteksi

Page 50: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

24

dengan metode aglutinasi langsung melalui pengenceran serum darah sesuai

dengan perlakuan. Jika dalam serum mengandung antibodi, maka ketika serum

diberi antigen akan terjadi aglutinasi kompleks antigen-antibodi.

Uji titer antibodi menggunakan microplate well 96 berbentuk huruf „U‟.

Serum ikan perlakuan vaksin sebagai antibodi dimasukkan ke dalam sumur no 1

(kontrol positif) dan sumur no 2 masing-masing 30 µL, kemudian dilakukan

pengenceran seri (serially two-fold diluted) dalam PBS 30 µL (pH 7,2) sampai

sumur ke – 11, pada sumur ke-12 hanya diisi PBS (kontrol negatif). Pengujian

kelompok pertama dengan menambahkan antigen ke dalam sumur ke-1 sampai

sumur ke – 12 sebanyak 30 µL bakteri homolog A. hydrophila. Kelompok kedua,

menambahkan ke dalam sumur ke-1 sampai sumur ke – 12 sebanyak 30 µL

bakteri homolog M. fortuitum. Kelompok terakhir, menambahkan ke dalam sumur

ke – 1 sampai sumur ke – 12 sebanyak 15 µL bakteri A. hydrophila +15 µL

bakteri M. fortuitum. Microplate well “U” yang berisi antibodi dan antigen

kemudian diinkubasi 24 pada suhu ruang dan titer aglutinasinya dihitung. Nilai

titer dimasukkan dalam hitungan log 2.

Histopatologi

Pengamatan gambaran histopatologi dilakukan untuk mengetahui efek

patologis dari penyakit Mycobacteriosis (infeksi M. fortuitum) MAS dan (infeksi

A. hydrophila) terhadap ikan gurame.

Relative Percent Survival (RPS)

Tingkat kelangsungan hidup (SR) setelah uji tantang kemudian dihitung

menjadi nilai Relative Percent Survival (RPS) untuk melihat efektifitas vaksinasi

dengan menggunakan rumus Ellis (1988) :

Page 51: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

25

Analisis Data

Penelitian dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap

(RAL). Analisis untuk data pengamatan diferensial leukosit, kadar hemoglobin,

kadar hematokrit, indeks fagositosis, persen fagositosis, aktifitas Respiratory

Burst, aktifitas komplemen, titer antibodi dan RPS (Relative Percent Survival)

dianalisis dengan program ANOVA (SPSS). Perubahan gejala klinis dan

histopatologi organ dianalisis secara deskriptif.

Page 52: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tahap 1

Patogenitas ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila pada

ikan gurame (O. gouramy)

Penelitian tahap 1 menunjukkan hasil nilai hematorit perlakuan ko-infeksi

A, B dan C mengalami penurunan setiap minggunya pascainfeksi, hal tersebut

ditunjukkan pada Gambar 2. Nilai hematorit perlakuan ko-infeksi pada hari ke – 7

berbeda nyata (P<0.05) dengan nilai ko-infeksi hari ke – 28 pascainfeksi.

Gambar 2 Kadar hematokrit ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf)

dan A. hydrophila (Ah). (A) Tipe bakteri 75Mf:25Ah, (B) Tipe

bakteri 50Mf:50Ah, (C) Tipe bakteri 25Mf:75Ah, (D) Kontrol

Kadar hematokrit pada perlakuan ikan gurame yang diinfeksi dengan ko-

infeksi bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila mengalami penurunan berkisar 21

– 23%, hal ini didukung oleh Randal (1970) dalam Dopongtanung (2008) yang

menjelaskan bahwa bila nilai hematokrit ikan di bawah 22% menunjukkan bahwa

ikan mengalami anemia dan kemungkinan mengalami infeksi penyakit bakteri.

Hematokrit berpengaruh terhadap pengukuran eritrosit (Hesser et al. 1960) dan

merupakan persentase volume eritrosit dalam darah (Sastradipradja et al. 1989).

Ko-infeksi bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila secara fisiologis menyebabkan

penurunan nafsu makan sehingga berpengaruh terhadap penurunan nilai

hematokrit darah.

Page 53: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

27

Rata – rata kadar hemoglobin pada perlakuan ikan gurame yang diinfeksi

dengan ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila mengalami penurunan dengan

nilai berkisar 3 – 4 g 100 mL-1

dibanding kelompok kontrol (Gambar 3). Kadar

hemoglobin pada perlakuan A, B dan C mengalami penurunan 1 minggu

pascainfeksi dan mulai meningkat kembali pada minggu ke – 2 dan ke – 3

pascainfeksi hal ini diduga disebabkan tubuh mulai berespon adaptif terhadap

invasi patogen yang masuk ke dalam tubuh, namun kadar hemoglobin kembali

menurun pada minggu ke – 4 pascainfeksi setelah diinfeksi dengan A. hydrophila.

Gambar 3 Kadar hemoglobin ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf)

dan A. hydrophila (Ah). (A) Tipe bakteri 75Mf:25Ah, (B) Tipe

bakteri 50Mf:50Ah, (C) Tipe bakteri 25Mf:75Ah, (D) Kontrol

Menurunnya nilai hemoglobin dalam darah berkaitan dengan rendahnya

nilai eritrosit yang diduga karena darah ikan mengalami lisis. Lisis disebabkan

oleh pecahnya eritrosit karena adanya toksin bakteri di dalam darah yang disebut

haemolisin. Toksin ini akan melisis hemoglobin dan melepaskan hemoglobin.

Kadar hemoglobin yang rendah dapat menjadi salah satu indikasi pada ikan atas

terjadinya infeksi dalam hal ini yang disebabkan bakteri (Lucky. 1977).

Darah merupakan cairan tubuh yang berfungsi sebagai alat transportasi

oksigen nutrien dan menjaga keseimbangan tubuh. Infeksi suatu penyakit akan

mengakibatkan darah mengalami perubahan, terutama kandungan hematokrit,

hemoglobin, jumlah eritrosit dan jumlah leukosit (Lagler et al. 1977). Menurut

Jawad et al. (2004) parameter hematologis dapat digunakan untuk memonitor

status kesehatan dan respon fisiologis ikan terhadap stres lingkungan.

Page 54: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

28

Hasil perlakuan ko-infeksi pada ikan gurame dengan komposisi bakteri M.

fortuitum dan A. hydrophila yang berbeda menunjukkan penurunan persentase

jumlah limfosit dan sebaliknya terjadi peningkatan persentase jumlah monosit

dan neutrofil. Persentase limfosit perlakuan A, B dan C pada minggu ke – 3 dan

ke – 4 pascainfeksi berbeda nyata (P<0.05) dengan D (kontrol). Proporsi limfosit

mengalami penurunan setiap minggunya setelah infeksi, di mana penurunan yang

tajam terjadi pada minggu ke – 3 pascainfeksi M. fortuitum dan minggu ke – 4

pascainfeksi A. hydrophila, hal ini dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4 Total limfosit ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf) dan

A. hydrophila (Ah). (A) Tipe bakteri 75Mf:25Ah, (B) Tipe bakteri

50Mf:50Ah, (C) Tipe bakteri 25Mf:75Ah, (D) Kontrol

Respon imun alamiah ikan terhadap serangan infeksi bakteri akan

terbentuk dengan melibatkan peran sel darah putih (leukosit) sebagai barier

pertahanan tubuh. Komponen sel darah putih terdiri dari limfosit, monosit,

neutrofil, eosinofil dan basofil. Respon imun alami akan bertahan dan berfungsi

dengan baik dalam waktu beberapa hari sampai minggu setelah invasi bakteri ke

dalam tubuh.

Proporsi neutrofil pada perlakuan A, B dan C berbeda nyata (P<0.05)

dibanding D (kontrol), hal ini dapat dilihat pada Gambar 5. Peningkatan

signifikan neutrofil mulai terjadi pada minggu ke – 3 dan ke – 4 pascainfeksi, hal

ini dikaitkan dengan aktifitas multiplikasi dan faktor virulensi bakteri M.

fortuitum dan A. hydrophila yang meningkat. Ikan gurame mengalami infeksi A.

hydrophila setelah 21 hari diinfeksi dengan M. fortuitum.

Page 55: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

29

Gambar 5 Total neutrofil ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf) dan

A.hydrophila (Ah). (A) Tipe bakteri 75Mf:25Ah, (B) Tipe bakteri

50Mf:50Ah, (C) Tipe bakteri 25Mf:75Ah, (D) Kontrol

Neutrofil dan monosit merupakan fagosit kuat yang akan mengeliminasi

patogen yang masuk ke dalam jaringan tubuh. Fulton et al. (2002) menyatakan

bahwa komponen lipoarabinomannan yang merupakan komponen dinding sel

bakteri akan mengaktifasi sel granulosit darah sebagai respon imun awal terhadap

infeksi Mycobacterium. Infeksi A. hydrophila menyebabkan septisemia yang

ditandai dengan terjadinya pendarahan pada organ ginjal dan limfa sehingga sel

granulosit keluar dari pembuluh darah bergerak aktif ke daerah yang mengalami

radang untuk memfagosit patogen yang masuk sehingga hal ini menyebabkan

proporsi jumlah sel granulosit yaitu neutrofil di dalam darah cenderung menurun.

Persentase jumlah monosit pada perlakuan ko-infeksi dengan

perbandingan bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila yang berbeda mengalami

peningkatan yang signifikan pada minggu ke – 3 dan ke – 4 pascainfeksi. Proporsi

monosit pada perlakuan A, B dan C berbeda nyata (P<0.05) terhadap D (kontrol)

(Gambar 6).

Jumlah monosit minggu ke – 4 pascainfeksi pada perlakuan A,B dan C

mengalami peningkatan. Perlakuan A mengalami peningkatan tertinggi, hal ini

disebabkan persentase bakteri M. fortuitum yang diinfeksikan lebih besar dari

perlakuan lain. Adanya infeksi akan menstimulasi tubuh mengaktifasi respon

pertahanan dengan meningkatkan jumlah monosit untuk menfagosit bakteri M.

fortuitum yang masuk ke dalam tubuh, belum selesai tubuh mengeliminasi M.

Page 56: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

30

fortuitum, tubuh kembali diinfeksi dengan A. hydrophila yang akhirnya

menyebabkan monosit meningkat kembali karena tubuh harus mengeliminasi dua

agen patogen pada saat yang bersamaan. Monosit adalah perkusor dari makrofag

yang berasal dari jaringan limfoid ikan, meninggalkan sirkulasi dan memulai

tugas fagosit di jaringan untuk menghadang invasi patogen.

Gambar 6 Total monosit ikan gurame hasil ko-infeksi M. fortuitum (Mf) dan

A. hydrophila (Ah). (A) Tipe bakteri 75Mf:25Ah, (B) Tipe bakteri

50Mf:50Ah, (C) Tipe bakteri 25Mf:75Ah, (D) Kontrol

Kematian akibat infeksi M. fortuitum terjadi mulai hari ke – 18

pascainfeksi, sedangkan kematian akibat infeksi akut A. hydrophila dan M.

fortuitum terjadi pada hari ke 23 – 25 pascainfeksi, hal tersebut dapat dilihat pada

Gambar 7. Pola kematian akibat ko-infeksi bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila

merupakan hasil gabungan karakter dari kedua jenis bakteri tersebut. Infeksi

kronis terjadi selama 28 hari masa pengamatan dan infeksi akut terjadi setelah 48

jam pascainjeksi dengan A. hydrophila. Jumlah ikan yang mengalami kematian

setiap perlakuan berbeda – beda, hal ini terkait dengan perbedaan tingkat virulensi

dari komposisi bakteri ko-infeksi yang berbeda. Pengujian ko-infeksi pada ikan

gurame menggunakan M. fortuitum 107

cfu dan A. hydrophila 108 cfu.

Perlakuan ko-infeksi 75Mf:25Ah dan 50Mf:50Ah menunjukkan kematian

yang rendah yaitu 10 – 20% sedangkan pada ko-infeksi 25Mf:75Ah jumlah

kematian ikan gurame mencapai 50%. Talaat et al. (1999) menginokulasikan M.

fortuitum ATCC 109

cfu secara intraperitoneal menyebabkan kematian 100%

dalam jangka waktu kurang dari 8 hari dan pada dosis 108 cfu menyebabkan

Page 57: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

31

kematian 21% pada ikan Goldfish (Carassius auratus). Penelitian yang dilakukan

oleh Vivas et al. (2003) menggunakan A. hydrophila pada dosis LD50 108

cfu

selama 14 hari pada ikan rainbow trout.

Gambar 7 Kematian kumulatif harian ikan gurame perlakuan ko-infeksi M.

fortuitum (Mf) dan A. hydrophila (Ah). (A) Tipe bakteri

75Mf:25Ah, (B) Tipe bakteri 50Mf:50Ah, (C) Tipe bakteri

25Mf:75Ah, (D) Kontrol

Gejala klinis akibat infeksi M. fortuitum mulai terlihat pada hari ke – 14

ditandai dengan penurunan nafsu makan dan hari ke – 18 mulai terlihat nodul

dalam ukuran 0.1 – 0.2 cm pada permukaan tubuh. Sedangkan infeksi A.

hydrophila menunjukkan gejala klinis luka pada bekas injeksi dan terlihat

pembengkakan pada rongga perut mulai 24 – 48 jam pascainfeksi. Ko-infeksi 28

hari menyebabkan mata menonjol atau eksopthalmia pada gurame uji. Perubahan

gejala klinis tersebut ditunjukkan pada Gambar 8.

Gambar 8 Gejala klinis ikan gurame perlakuan ko-infeksi M. fortuitum (Mf)

dan A. hydrophila (Ah) menunjukkan nodul, kemerahan pada

bekas suntikan dan eksopthalmia (tanda panah berwarna merah)

Page 58: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

32

Patologi anatomi menunjukkan granuloma pada hati dan limpa mulai

terbentuk pada hari ke – 21 pascainfeksi bakteri M. fortuitum (Gambar 9). Asites

dalam rongga perut dan pendarahan pada organ ginjal dan limpa pada ko-infeksi

terjadi mulai 24 – 48 jam post infeksi A. hydrophila. Perubahan histopatologi hari

ke – 28 pascainfeksi menunjukkan tingkat kerusakan yang signifikan dibanding

21 hari pascainfeksi, hal ini disebabkan dua agen patogen yaitu M. fortuitum dan

A. hydrophila telah bersinergis bersama – sama menimbulkan kerusakan jaringan

Menurut Talaat et al. (1999) infeksi M. fortuitum 108 cfu pada ikan Goldfish

menyebabkan lesi granulomatous pada berbagai organ internal yaitu peritoneum,

pankreas, hati, limpa dan ginjal.

Gambar 9 Patologi anatomi ikan gurame perlakuan ko-infeksi M. fortuitum

(Mf) dan A. hydrophila (Ah) menunjukkan granuloma pada

berbagai organ internal. A. 21 hari ko-infeksi ; B. 28 hari ko-

infeksi

Perubahan histopatologi hasil ko-infeksi 21 hari dan 28 hari pascainfeksi

menunjukkan kongesti, granuloma multifokal pada hati dan limpa, nekrosis pada

sel hati dan sel ginjal, melano macrofag center (MMC) pada limpa dan ginjal

serta peradangan dan hemorhagik juga ditemukan pada organ ginjal, hal tersebut

dapat dilihat pada Gambar 10.

Mikobakteria kaya akan lipid, mencakup asam mikolat (asam lemak rantai

panjang C78 – C90), lilin dan fosfatida. Dalam sel, lipid sebagian besar terikat

pada protein dan polisakarida (Jewetz et al. 1996). Granuloma merupakan

kerusakan jaringan yang terjadi akibat dipeptida muramil yang merupakan salah

satu jenis protein yang dimiliki oleh jaringan terikat kompleks dengan asam

mikolat yang dihasilkan oleh bakteri Mycobacterium spp. Granuloma terlihat

sebagai kumpulan sel – sel epiteloid yang berasal dari histiosit. Nekrosis

A B

Page 59: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

33

ditemukan di daerah sentral granuloma. Di dalam granuloma juga ditemukan

jaringan ikat fibrosit dan sejumlah limfosit.

(A) (B) (C)

Gambar 10 Fotomikrograf organ hati (A), ginjal (B) dan limpa (C) ikan gurame

ko-infeksi M.fortuitum dan A. hydrophila menunjukkan kongesti (k),

granuloma (g), vakuolisasi (v), melano macrofag center (mmc),

hemorrhagic (h), inflamasi (m), necrosis (n), (Perbesaran 100 –

200x, Pewarnaan Hematoxylin-Eosin). Atas (hasil ko-infeksi 21 hari

pascainfeksi, Bawah (hasil ko-infeksi 28 hari pascainfeksi)

Melano macrofag center (MMC) adalah agregat makrofag merupakan

kumpulan sel yang mengandung pigmen pada jaringan. MMC ditemukan pada

organ ginjal dan limpa ikan gurame perlakuan ko-infeksi. Melanomakrofag atau

endapan coklat akibat ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame terjadi

karena adanya eksudasi kuman di jaringan. Infiltrasi sel radang yang ditemukan pada

jaringan organ ikan gurame ko-infeksi mengindikasikan terjadinya peradangan

pada jaringan tersebut. Toksin yang dihasilkan oleh bakteri M. fortuitum dan A.

hydrophila menstimulasi bekerjanya respon imun non spesifik ikan gurame, hal

ini ditandai dengan aktifitas sel granulosit yang keluar dari pembuluh darah

bergerak aktif ke daerah yang mengalami kerusakan serta makrofag untuk

mengeliminasi invasi patogen. Proses keradangan secara normal akan diikuti oleh

peningkatan jumlah sel limfosit, makrofag maupun neutrofil. Menurut Darwis et

al. (2000) infeksi menyebabkan peradangan pada tubulus maupun glomerulus

K

G

G

v

m

MMC

h

MMC

G

G

G

MMC n

n

Page 60: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

34

ginjal yang dapat melanjut menjadi nekrosis multifokal dan mempengaruhi proses

metabolisme tubuh.

Alagappan et al. (2009) menyatakan bahwa infeksi A. hydrophila

menyebabkan melano macrofag center (MMC) pada ginjal dan limfa serta

kerusakan sel dan nekrosis pada hati dan ginjal, hal yang sama juga terjadi pada

perlakuan ko-infeksi 28 hari pascainfeksi. Kerusakan yang terjadi akibat ko-

infeksi pada ikan gurame perlakuan disebabkan adanya toksin mematikan dari

produk ekstraseluler yang bersifat virulen yang dihasilkan kedua bakteri tersebut.

Infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame secara

mikroskopik menyebabkan kongesti pada hati dan ginjal. Kongesti merupakan

keadaan yang menunjukkan peningkatan volume darah karena pelebaran

pembuluh darah kecil (Robbins dan Kumar. 1995). Menurut Smith and Jones

(1961) kongesti terjadi akibat reaksi keradangan dan kerusakan bagian organ.

Kongesti merupakan proses pasif yang disebabkan oleh menurunnya aliran darah

vena. Kongesti akan menunjukkan perubahan warna merah, tergantung derajat

oksigenasi darah. Kongesti juga merupakan gejala patologis pertama dari

kerusakan jaringan dan terjadi peningkatan jumlah darah di dalam pembuluh

darah sehingga akan tampak kapiler darah melebar dan sinusoid-sinusoid di hati

terisi banyak eritrosit (Thomson. 1978). Kongesti dapat dikaitkan dengan aktifitas

multiplikasi bakteri dan endotoksin atau eksotoksin dihasilkan oleh bakteri gram

negatif (Brook et al. 1989).

Tahap 2

Kajian Preparasi vaksin M. fortuitum dan A. hydrophila

Uji innocuity sediaan vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A.

hydrophila menunjukkan tidak terjadi kematian setelah 24 jam pascavaksinasi.

Perubahan secara fisiologis dan anatomis juga tidak ditemukan. Re-isolasi

terhadap gurame uji dari masing – masing kelompok perlakuan menunjukkan

tidak diperoleh adanya pertumbuhan bakteri pada media kultur. Tidak terjadinya

Page 61: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

35

kematian setelah 24 jam pascavaksinasi, tidak ditemukannya perubahan fisiologis

dan anatomis pada gurame uji menandakan bahwa sediaan vaksin monovalen dan

koktail yang diberikan terbukti aman dan tidak menimbulkan efek samping.

Penggunaan neutral buffer formalin sebagai bahan inaktifasi bakteri memberikan

tingkat keamanan lebih baik dibanding menggunakan formalin yang seringkali

menimbulkan perubahan pada tingkah laku dan peradangan pada area bekas

suntikan, hal tersebut disebabkan oleh efek toksik dari formalin yang dapat

berpengaruh secara fisiologis dan anatomis pada ikan.

Uji sterility terhadap masing – masing sediaan vaksin monovalen maupun

koktail diperoleh hasil tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri pada media

kultur, hal tersebut menunjukkan bahwa proses inaktifasi efektif dan tidak ada

kontaminasi mikroba selama proses pembuatan vaksin.

Uji kadar formalin dilakukan berdasarkan metode AOAC (1990)

menggunakan spektrofotometer dengan tingkat limit deteksi sebesar 0.0049 ppm.

Konsentrasi formalin dari sediaan masing – masing vaksin koktail sel utuh yang

digunakan adalah sebagai berikut : vaksin 25 Mf : 75 Ah sebesar 0.205 mg/L,

vaksin 50 Mf : 50 Ah sebesar 0.191 mg/L dan vaksin 75 Mf : 25 Ah sebesar 0.136

mg/L. Hal tersebut menunjukkan bahwa sediaan vaksin relatif aman untuk

digunakan melalui injeksi secara intraperitoneal karena kelangsungan hidup pada

berbagai kelompok perlakuan 98 – 100 % (Tabel 4 ).

Tabel 4 Hasil uji kadar formalin sediaan vaksin koktail yang diinaktifasi dengan

neutral buffer formalin 3%.

No Sampel Kadar Formalin (mg/L)

1 Vaksin koktail 25 Mf:75Ah 0.205

2 Vaksin koktail 50 Mf:50 Ah 0.191

3 Vaksin koktail 75 Mf:25Ah 0.136

Pemakaian formalin sebagai salah satu bahan inaktifasi dalam proses

pembuatan vaksin telah banyak dilakukan pada berbagai penelitian

pengembangan vaksin baik pada bidang veteriner maupun akuakultur. Global isu

mengenai dampak formalin kaitannya dengan food hygiene dan food safety masih

menjadi perdebatan para ahli dari berbagai disiplin pada bidang terkait. Menurut

Page 62: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

36

Sugiani (2012), penggunaan formalin dalam sediaan vaksin masih dapat diterima

jika konsentrasi rendah dan tidak menyebabkan efek toksik ketika diaplikasikan

baik secara injeksi, rendam ataupun melalui pakan.

Formalin merupakan senyawa aldehid yang dihasilkan dari reaksi oksidasi

metanol dengan katalis perak pada suhu 600-700oC. Konsentrasi yang tinggi dapat

menimbulkan reaksi secara kimia dengan hampir semua zat di dalam sel, sehingga

menekan fungsi sel dan menyebabkan kerusakan organ tubuh. Kerusakan di

dalam sel terjadi karena formalin mengkoagulasi protein yang terdapat pada

protoplasma dan nukleus (Cahyadi 2006 dalam Saraswati, dkk. 2009). Menurut

Austin & Austin (1987) penggunaan formalin dalam pembuatan vaksin lebih

menguntungkan secara komersial dibandingkan zat kimia lain seperti kloroform,

fenol dan sodium hidroksida. Formalin telah digunakan sebagai bahan inaktifasi

untuk bakteri A. hydrophila, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas piscicida, P.

anguiliseptica, Vibrio anguilarum, dan V. ordalii. Formalin membunuh dengan

cara mendehidrasi sel bakteri dan mengganti cairan dalam sel dengan komponen

yang menyerupai gel. Penambahan formalin menyebabkan protoplasma menjadi

kehilangan kelembaban sehingga sel pecah.

Kadar residu formalin dari masing – masing perlakuan ikan gurame yang

divaksinasi dengan vaksin koktail dan monovalen tidak terdeteksi dari otot ikan,

kadar residu formalin pada daging ikan gurame hal ini dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5 Deteksi kadar residu formalin pada otot ikan gurame yang divaksinasi

dengan vaksin koktail dan monovalen inaktifasi dengan neutral buffer

formalin 3%.

No Jenis vaksin yang diinjeksikan ke

ikan gurame

Kadar Formalin (mg/L)

1 Vaksin koktail 25 Mf:75Ah Tidak terdeteksi

2 Vaksin koktail 50 Mf:50 Ah Tidak terdeteksi

3 Vaksin koktail 75 Mf:25Ah Tidak terdeteksi

4 Vaksin monovalen A. hydrophila Tidak terdeteksi

5 Vaksin monovalen M. fortuitum Tidak terdeteksi

6 kontrol Tidak terdeteksi

Menurut Yang et al. (2005) meneliti kadar formalin pada otot ikan mas

(Cyprinus carpio). Perlakuan ikan yang direndam dengan formaldehid 37% pada

Page 63: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

37

suhu 20ºC dan 30ºC pada dosis 250 ppm 1 jam, 100 ppm 2 jam dan 25 ppm

jangka waktu sampai 48 jam menunjukkan bahwa residu formalin terdeteksi pada

level yang sangat rendah dari ke 3 perlakuan tersebut setelah 144 jam. Hal

tersebut menunjukkan bahwa senyawa formalin akan terdegradasi secara perlahan

di lingkungan perairan.

Berdasarkan pemeriksaan secara histologis juga tidak ditemukan adanya

kerusakan akibat residu formalin pada ikan uji dari masing – masing perlakuan

pada organ hati, ginjal dan limpa. Residu formalin dalam level rendah mampu

direspon positif secara fisiologis oleh ikan sebagai material toksik yang tidak

menyebabkan kerusakan pada jaringan hati, ginjal dan limfa (Gambar 11).

Gambar 11 Fotomikrograf organ hati (A), ginjal (B) dan limpa (C) gurame uji

yang divaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail inaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3% menunjukkan tidak ada

perubahan (perbesaran 200x, perwarnaan Hematoxylin-Eosin,). Atas

: organ dari ikan normal, Bawah : organ dari ikan perlakuan vaksin

Menurut Kwon dan Choon (1996) efek toksik residu formalin pada ikan

rockfish dapat menyebabkan edema pada sel epithel, proliferasi dan nekrosis

lamela sekunder insang, kongesti, piknotik dan vakuolisasi pada jaringan hati.

Selain itu sel mukus bertambah, nekrosis pada sel epitel dan tubulus proximal

ginjal, serta nekrosis pada bagian dermis dan epidermis dari jaringan kulit.

Formalin lebih toksik dibanding dengan neutral buffer formalin pada kondisi yang

sama. Oleh karena itu penggunaan neutral buffer formalin 3% sebagai bahan

inaktifasi vaksin monovalen dan koktail lebih aman dan tidak menyebabkan efek

samping pada ikan gurame.

A C B

Page 64: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

38

Bakteri tersusun atas senyawa protein yang memiliki kadar dan ukuran

yang berbeda – beda pada setiap struktur penyusunnya. Berat protein sediaan

vaksin sel utuh A. hydrophila inaktifasi neutral buffer formalin 3% sebesar 0.81

mg/L dan sediaan vaksin sel utuh M. fortuitum sebesar 8.71 mg/L (Tabel 6). Berat

protein vaksin sel utuh A. hydrophila yang diperoleh tidak berbeda jauh dari

penelitian yang dilakukan oleh Sugiani (2012) yaitu sebesar 0.53 mg/L.

Tabel 6 Berat protein sediaan vaksin monovalen sel utuh yang diinaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3%

No Nama vaksin Berat protein (mg/L)

1 A. hydrophila 0.81

2 M. fortuitum 8.71

Vaksin monovalen sel utuh M. fortuitum memiliki berat protein yang lebih

besar dari sel utuh A. hydrophila, hal ini dapat dikaitkan dengan stuktur bakteri M.

fortuitum yang jauh lebih kompleks dibanding dengan A. hydrophila. M. fortuitum

tersusun atas lapisan peptidoglikan lebih tebal 60 – 100% dari pada bakteri A.

hydrophila yang hanya memiliki ketebalan 10 – 20%, di mana pada lapisan

tersebut berikatan dengan protein.

Profil protein sediaan vaksin monovalen A. hydrophila terdiri dari 15 pita

protein, vaksin monovalen M. fortuitum terdiri dari 14 pita protein sedangkan

vaksin koktail A. hydrophila – M. fortuitum terdiri dari jumlah pita protein yang

bervariasi (Gambar 12).

Gambar 12 SDS PAGE sediaan vaksin monovalen dan koktail inaktifasi neutral

buffer formalin 3% (M) Marker (1) koktail 25Mf:75Ah (2) koktail

50Mf:50Ah (3) koktail 75Mf:25Ah (4) monovalen A. hydrophila

(5) monovalen M. fortuitum

200 116 89 61 47 37 28 21

5 4 3 2 1 M

Page 65: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

39

Berdasarkan hasil analisa SDS PAGE sediaan vaksin monovalen A.

hydrophila menunjukkan pita protein yang berukuran 103.48, 83.76, 72.76, 64.70,

53.62, 51.16, 45.50, 35.98, 27.79, 24.14, 22.50, 16.58, 14.74, 12.50 dan 7.29 kDa

(Tabel 7). Aerolisin dengan ukuran 53 kDa juga teridentifikasi pada vaksin

monovalen A. hydrophila. Hemolisin yang berukuran 88 kDa teridentifikasi

dengan ukuran yang mendekati yaitu 83.76 kDa. Pita protein 83.76, 53.62 dan

45.50 kDa yang merupakan ukuran mendekati karakteristik isolat virulen

ditemukan pada vaksin monovalen A. hyrophila. Hal tersebut menunjukkan

bahwa bakteri A. hydrophila yang digunakan merupakan isolat virulen. Menurut

Sirirat et al. (1999) yang melakukan karakterisasi protein sediaan ECP bakteri A.

hydrophila dengan pewarna silver menunjukkan bahwa isolat yang virulen terlihat

pita utama pada 88, 52 dan 45 kDa sedangkan isolat avirulen 95023 pada 88, 45,

31 dan 24 kDa dan isolat III/39 pada 70, 50, 33 dan 20 kDa. Pita protein yang

berukuran 88 kDa teridentifikasi sebagai haemolisin dan 52 kDa teridentifikasi

sebagai aerolisin, keduanya merupakan toksin yang dihasilkan oleh A. hydrophila

yang berperan sebagai faktor virulensi.

Hasil analisa SDS PAGE sediaan vaksin monovalen M. fortuitum

menunjukkan pita protein yang berukuran 124.84, 108.44, 94.19, 83.76, 72.76,

64.70, 51.16, 44.44, 35.98, 27.79, 16.58, 14.74, 12.50 dan 6.96 kDa (Tabel 7).

Protein yang mendekati 65 kDa juga ditemukan pada vaksin monovalen M.

fortuitum yaitu 64.70 kDa dan merupakan protein yang bersifat imunogenik.

Menurut Chen et al. (1997) profil protein ECP Mycobacterium spp pada ikan

menunjukkan pita utama pada 65 kDa dan < 14 kDa dan pita lain yang

teridentifikasi juga berukuran 70, 45, 40, 38 dan 25 kDa. Sel utuh sonikasi

menunjukkan pita utama pada ukuran 68, 65, 55, 50, 31, 27 dan 16 kDa serta pita

yg berukuran > 97 kDA. Protein yang berukuran 65 kDa bersifat imunogenik pada

ikan dan kelinci. Antigen vaksin monovalen M. fortuitum dan A. hydrophila

mengandung material protein yang bersifat imunogenik dengan ukuran 60 – 120

kDa. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Stuart (1999) bahwa molekul antigen

yang bersifat imunogenik memiliki ukuran lebih besar dari 60 kDa.

Page 66: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

40

Tabel 7 Karakter berat molekul protein hasil SDS PAGE vaksin monovalen A

hydrophila dan M. fortuitum serta gabungan keduanya yang diinaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3%

Sediaan vaksin BM kDa

Monovalen A hydrophila 103.48; 83.76; 72.76; 64.70; 53.62; 51.16; 45.50;

35.98; 27.79; 24.14; 22.50; 16.58; 14.74; 12.50;

7.29

Monovalen M. fortuitum 124.84; 108.44; 94.19; 83.76; 72.76; 64.70; 51.16;

44.44; 35.98; 27.79; 16.58; 14.74; 12.50; 6.96

Koktail 25Mf:75Ah 103.48; 83.76; 64.70; 45.50; 27.79

Koktail 50Mf:50Ah 124.84; 103.47; 83.76; 64.70; 53.62;51.16; 35.98;

27.79; 22.50; 16.58

Koktail 75Mf:25Ah 124.84; 103.48; 83.76; 72.76; 53.82; 44.44;

35.98;27.79; 16.58

Berat molekul protein hasil masing – masing sediaan vaksin koktail dapat

dilihat selengkapnya pada Tabel 7, profil protein vaksin koktail menunjukkan

variasi jumlah dan ukuran pita protein. Vaksin koktail 25Mf : 75Ah memiliki 5

pita protein yang terdiri dari 5 pita protein A. hydrophila dan 2 pita protein M.

fortuitum, dimana terdapat 2 ukuran pita protein yang sama untuk kedua jenis

bakteri tersebut yaitu 64.70 dan 27.29 kDa. Vaksin koktail 50Mf : 50Ah memiliki

10 pita protein yang terdiri dari 9 pita protein A. hydrophila dan 7 pita protein M.

fortuitum, di mana terdapat 6 ukuran pita protein yang sama untuk kedua jenis

bakteri tersebut yaitu 83.76, 64.70,51.16, 35.98, 27.79 dan 16.58 kDa. Vaksin

koktail 75Mf : 25Ah memiliki 9 pita protein yang terdiri dari 7 pita protein A.

hydrophila dan 7 pita protein M. fortuitum, di mana terdapat 5 ukuran pita protein

yang sama untuk kedua jenis bakteri tersebut yaitu 83.76, 72.76, 35.98,27.79 dan

16.58 kDa. Profil protein vaksin koktail merupakan gabungan dari vaksin

monovalen M. fortuitum dan A. hydrophila.

Page 67: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

41

Tahap 3

Efikasi vaksin koktail bakterin A. hydrophila dan M. fortuitum pada

ikan gurame (O. gouramy)

Keberhasilan vaksinasi dapat diukur dari beberapa parameter

imunologi untuk mengetahui keamanan dan level proteksi aplikasi vaksin pada

ikan. Analisis bakterisidal serum dapat dijadikan komponen untuk melihat

viabilitas patogen dalam inang yang ditunjukkan melalui aktifitas titer antibodi,

respiratory burst dan komplemen (Ellis, 2001). Sedangkan pemeriksaaan

komponen darah dilakukan untuk mengetahui kondisi status kesehatan ikan,

mengevaluasi pertahanan non spesifik pada spesies ikan dan mengetahui pengaruh

stres terhadap kesehatan ikan (Svobodova dan Vykusova, 1991). Parameter

imunologi dan hematologi darah pada penelitian tahap 3 diperoleh hasil sebagai

berikut :

1. Titer Antibodi

Titer antibodi ikan gurame (Gambar 13,14 dan 15) dengan perlakuan

vaksin monovalen maupun koktail menunjukkan perbedaan yang nyata dibanding

dengan kontrol (P<0,05). Hasil pengamatan antar perlakuan vaksin menunjukkan

perlakuan vaksin koktail memiliki titer antibodi yang lebih tinggi, pada uji tantang

dengan bakteri gabungan (ko-infeksi) pada nilai 6, dan 5 (log 2) dibanding dengan

monovalen.

Pemberian vaksin monovalen dan koktail terbukti mampu menginduksi

respon imun spesifik pada ikan gurame. Peningkatan titer antibodi terjadi setelah

2 minggu atau 14 hari pascavaksinasi dan secara signifikan meningkat pada

minggu ke – 3 pascavaksinasi. Penurunan titer antibodi terjadi 1 minggu setelah

uji tantang dan meningkat kembali 2 minggu setelah uji tantang.

Hasil titer antibodi pada perlakuan vaksinasi monovalen A. hydrophila

ternyata lebih tinggi dalam membentuk respon imun yaitu mencapai nilai 8 (log 2)

demikian juga untuk monovalen M. fortuitum yaitu nilai 6 (log 2) untuk jika

dibandingkan dengan vaksin koktail ketika uji tantang dengan bakteri tunggal.

Hasil titer antibodi terhadap uji tantang gabungan (ko-infeksi) menunjukkan nilai

titer yang relatif lebih rendah jika dibandingkan dengan proteksi vaksin koktail.

Page 68: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

42

Gambar 13 Titer antibodi serum ikan gurame (O. gouramy) pascavaksinasi yang

di tantang dengan bakterin A. hydrophila

Gambar 14 Titer antibodi serum ikan gurame (O. gouramy) pascavaksinasi yang

di tantang dengan bakterin M. fortuitum

Gambar 15 Titer antibodi serum ikan gurame (O. gouramy) pascavaksinasi yang

di tantang dengan gabungan bakterin M. fortuitum dan A.

hydrophila

Page 69: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

43

Penurunan kembali titer antibodi yang terjadi minggu ke – 4 setelah uji

tantang dengan koinfeksi M. fortuitum dan A. hydrophila, hal ini disebabkan

karena uji tantang dengan bakteri A. hydrophila dilakukan setelah 3 minggu

terlebih dahulu ditantang dengan bakteri M. fortuitum. Ketika titer antibodi

mengalami peningkatan setelah pemulihan uji tantang dengan M. fortuitum ikan

gurame kembali diuji tantang dengan A. hydrophila sehingga menyebabkan nilai

titer antibodinya menjadi menurun. Hal tersebut merupakan fisiologis normal di

mana tubuh ikan akan memberikan respon terhadap adanya patogen atau benda

asing yang masuk.

Antibodi bereaksi spesifik dengan antigen membentuk senyawa komplek

berupa endapan (presipitat) dan gumpalan (aglutinat) yang ditujukan melalui uji

imunopresipitasi atau uji aglutinasi. Titer antibodi mencerminkan kemampuan

tubuh ikan terhadap infeksi bakteri melalui respons imun spesifik. Semakin tinggi

nilai titer maka diharapkan kemampuan perlindungan terhadap infeksi juga

menjadi tinggi. Antibodi yang beredar dalam sirkulasi akan menetralisasi molekul

antifagositik dan eksotoksin lainnya yang diproduksi bakteri.

2. Respiratory Burst (NBT – Assay)

Hasil penelitian menunjukkan nilai NBT pada awal perlakuan berkisar

antara 0.115 – 0.234, peningkatan nilai NBT terjadi pada minggu ke – 2 maupun

ke – 3 pasca vaksinasi (Gambar 16). Gurame uji dari masing – masing perlakuan

vaksin menunjukkan nilai Optical density (OD) yang berbeda nyata (P<0.05)

dibanding pada perlakuan kontrol. Gurame uji yang divaksinasi dengan vaksin

monovalen A. hydrophila menunjukkan nilai NBT yang lebih tinggi dibanding

perlakuan lain dan kontrol. Perlakuan pemberian vaksin pada gurame uji mampu

meningkatkan kemampuan sel fagosit dalam melawan antigen.

Page 70: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

44

Gambar 16 NBT Assay ikan gurame pasca vaksinasi dengan berbagai sediaan

vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A. hydrophila yang

diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3%

Respiratory burst disebut juga oksidatif burst memainkan peranan penting

dalam sistem imun. Aktifitas produksi oksigen radikal superoksida (O2) pada

aktifitas fagositosis dapat dilihat dengan menggunakan pewarna NBT. NBT atau

nitroblue tetrazolium adalah senyawa kimia yang digunakan dalam biokimia dan

imunologi untuk mendeteksi alkali fosfatase enzim. Nilai NBT semakin tinggi

menunjukkan bahwa produksi radikal oksigen bebas pada aktifitas respiratory

burst semakin besar. Produksi radikal bebas ini digunakan untuk melawan

patogen. Ikan mempunyai mekanisme membunuh sel-sel fagosit melalui oksigen

bebas dalam vakuola lisosom. Mekanisme ini mampu meningkatkan permeabilitas

sel bakteri sehingga bisa menyebabkan masuknya substansi dan cairan dalam sel

bakteri yang kemungkinan bisa menyebabkan plasmolisis.

Radikal oksigen toksik ini dengan cepat dikonversi menjadi hidrogen

peroksida (H2O2) yang memiliki sifat bakterisidal yang kuat. Karakter radikal

oksigen yang bersifat toksik terhadap patogen ini diduga pula dikonversi menjadi

radikal hidroksi (OH-) yang memiliki kemampuan mendegradasi membran lipid

antigen.

Penurunan aktifitas NBT mengindikasikan adanya kontaminan dan infeksi

yang kronis atau ikan sedang dalam kondisi stres. Peningkatan NBT dapat

mengindikasikan bahwa perlakuan penyuntikan vaksin telah efektif merangsang

Page 71: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

45

sistem kekebalan tubuh ikan (Anderson, 2004). Neutrofil dan sel fagositik yang

teraktivasi dapat menghasilkan absorban 20 – 30% lebih tinggi, yang

menunjukkan produksi oksigen radikal yang lebih tinggi untuk pertahanan

terhadap penyakit.

Vaksin koktail yang merupakan gabungan dari bakterin monovalen A.

hydrophila dan M. fortuitum yang memiliki karakteristik yang berbeda dari sel

dan hasil metabolitnya ternyata tidak menyebabkan imunosupresi yang biasanya

ditandai dengan penurunan nilai NBT (penurunan aktifitas respiratory burst).

3. Aktifitas komplemen

Aktifitas komplemen dalam melisiskan RaBC terhadap bakteri A.

hydrophila 109 cfu menunjukkan terjadinya peningkatan pada minggu ke – 2 dan

ke – 3 pascavaksinasi dengan nilai hemolisis berkisar antara 60 – 80% pada

pengenceran pertama. Hal tersebut menandakan bahwa Aktifitas komplemen akan

mengalami peningkatan setelah 14 hari pascavaksinasi. Pada perlakuan vaksin

monovalen A. hydrophila dan koktail 50Mf:50Ah menunjukkan kemampuan

aktifitas komplemen yang lebih tinggi dan berbeda nyata (P<0.05) dibanding

perlakuan vaksin lain dan kontrol, hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 17.

Peningkatan aktifitas komplemen dalam melisiskan RaBC terhadap

bakteri M. fortuitum 108 cfu juga terjadi pada pengenceran ke – 2 dan ke – 3

dalam jangka waktu 2 dan 3 minggu pascavaksinasi, hal tersebut dapat diamati

pada Gambar 17. Perlakuan vaksin monovalen M. fortuitum dan koktail

50Mf:50Ah menunjukkan kemampuan hemolisis yang lebih besar dan berbeda

nyata (P<0.05) dibanding perlakuan vaksin lain maupun kontrol.

Aktifitas komplemen pascavaksinasi dalam melisiskan RaBC terhadap

gabungan bakteri A. hydrophila dan M. fortuitum mengalami peningkatan pada

minggu ke – 2 dan ke – 3 dengan rata – rata hemolisis sebesar 50 – 80%.

Kemampuan komplemen pada perlakuan vaksin koktail 50Mf : 50Ah terhadap

bakteri A. hydrophila, M. fortuitum dan gabungan keduanya menunjukkan

kemampuan aktifitas komplemen yang lebih tinggi dari perlakuan vaksin lain

maupun kontrol, hal tersebut dapat dilihat pada gambar 17.

Page 72: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

46

(a) (b) (c)

(1)

(2)

(3)

Gambar 17 Aktifitas komplemen serum ikan gurame pascavaksinasi dengan

vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi menggunakan

neutral bufer formalin 3% terhadap bakteri A. hydrophila. (1),

bakteri M. fortuitum (2) dan ko-infeksi (3), (a) minggu ke-1, (b)

minggu ke-2, (c) minggu ke-3

( ) vaksin koktail 25Mf:75Ah, ( ) vaksin koktail 50Mf:50Ah ,( )

vaksin koktail 75Mf:25Ah ,( ) vaksin monovalen Ah, ( ) vaksin

monovalen Mf ( ) kontrol

Page 73: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

47

Komplemen merupakan sekumpulan molekul protein dan interaksinya

yang terjadi secara berantai, mengakibatkan efek biologis pada membran, pada

sifat sel dan interaksi protein lain. Sedikitnya ada 11 jenis protein komplemen

yang ada dalam plasma normal, masing-masing ada dalam keadaan inaktif tetapi

bila komplemen diaktivasi, setiap jenis komplemen mempunyai fungsi spesifik.

Aktifasi dapat dimulai dengan reaksi antigen dengan IgG atau IgM atau bila ada

kontak dengan IgA yang menggumpal, selain itu aktivasi dapat pula dimulai oleh

kontak dengan polisakarida atau lipopolisakarida, oleh produk yang terjadi akibat

aktivasi sistem pembekuan atau kalikrein.

Menurut Holand dan Lambris (2002), akhir dari aktivitas komplemen

adalah terbentuknya suatu pori fungsional pada membrane sel di mana

komplemen tersebut melekat, kemudian terjadi perubahan konformasi fosfolipid

sel yang menyebabkan lisis dan berakhir dengan kematian sel. Hal tersebut

disebut MAC (membrane attack complex). Komplemen dapat diinisiasi melalui

tiga jalur yaitu jalur klasik (classical complement pathway atau CCP), jalur

alternatif (alternate complement pathway atau ACP), dan jalur lektin (lectin

complement pathway / LCP). Jalur klasik berasosiasi dengan imunitas dapatan

yang dirangsang oleh aktifitas perlekatan permukaan antigen, membentuk ikatan

antigen-antibodi komplek.

Persamaan ketiga jalur tersebut adalah sama- sama mengaktivasi pusat

katalitik sistem komplemen yaitu C3, menginduksi C9 dan akhirnya membentuk

membrane attack complex. Perbedaan ketiga jalur tersebut terletak pada stimulus

yang menginduksi, jalur lecithin distimulasi oleh kompleks antigen – antibodi,

jalur MB-lecitin distimulasi oleh kompleks manosa-binding lecithin dan jalur

alternatif distimulasi oleh LPS (lipopolisakarida) dari permukaan patogen.

4. Kadar Hemoglobin

Kadar hemoglobin pada ikan gurame uji pascavaksinasi mengalami

peningkatan pada minggu ke – 2, dengan rata – rata kadar hemoglobin sebesar 5 –

6.8 g 100 mL-1

. Kadar hemoglobin selama masa induksi kekebalan 21 hari

mengalami fluktuasi dan pada minggu ke – 1 dan ke – 3 pascavaksinasi

mengalami penurunan. Kadar hemoglobin perlakuan vaksin A, B, C, D dan E

Page 74: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

48

setelah minggu ke – 2 vaksinasi lebih tinggi dan berbeda nyata (P<0.05) dengan

F (kontrol), dapat dilihat pada Gambar 18.

Gambar 18 Kadar hemoglobin ikan gurame pasca vaksinasi dengan berbagai

sediaan vaksin. (A) koktail 25Mf:75Ah, (B) koktail 50 Mf:50Ah,

(C) koktail 75Mf:25Ah, (D) monovalen A. hydrophila, (E)

monovalen M. fortuitum, (F) kontrol

Hemoglobin adalah metaloprotein (protein yang mengandung zat besi) di

dalam eritrosit yang berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru ke

seluruh tubuh, pada mamalia dan hewan lainnya. Hemoglobin juga pengusung

karbon dioksida kembali menuju paru-paru untuk dihembuskan keluar tubuh.

Molekul hemoglobin terdiri dari globin, apoprotein dan empat gugus heme, suatu

molekul organik dengan satu atom besi. Penurunan kadar hemoglobin terjadi

karena adanya pengurangan jumlah eritrosit dan penambahan jumlah plasma

darah yang menyebabkan warna merah darah berkurang. Proses tersebut

merupakan respon fisiologis normal dari ikan pasca vaksinasi. Kadar hemoglobin

ikan gurame sehat dengan ukuran 24 – 29 cm yang pernah dilaporkan oleh

Minaka et al. (2012) adalah sebesar 12.9 g 100 ml-1

.

Kadar hemoglobin ditentukan berdasarkan warna dan kepekatan inti sel

darah merah. Semakin tua eritrosit maka kadar hemoglobin semakin tinggi.

Tingginya kadar hemoglobin dikarenakan eritrosit yang ada dalam tubuh yaitu

eritrosit tua dan eritrosit muda yang baru dibentuk oleh jaringan hematopoetik.

Eritrosit yang masih baru memiliki inti yang besar dan warna yang lebih terang.

Page 75: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

49

Jumlah hemoglobin pada sel darah merah ikan berbeda pada setiap stadia

perkembangannya (Ellis et al. 1978).

5. Hematokrit Darah

Kadar hematokrit untuk sel darah dari masing – masing perlakuan berkisar

30.5 – 39.01% dan nilai plasma darah 60.99 – 69.92% (Gambar 19). Berdasarkan

analisa statistik kadar hematokrit antar perlakuan pada ikan gurame 3 minggu

pascavaksinasi tidak terdapat perbedaan yang nyata (P>0.05) antar perlakuan,

namun kenaikan signifikan kadar hematokrit ditemukan perlakuan B yaitu minggu

ke-2 pascavaksinasi berbeda nyata (P<0.05) dengan kontrol dan perlakuan lain.

Gambar 19 Kadar hematokrit ikan gurame pasca vaksinasi dengan berbagai

sediaan vaksin. (A) koktail 25Mf:75Ah, (B) koktail 50 Mf:50Ah,

(C) koktail 75Mf:25Ah, (D) monovalen A. hydrophila, (E)

monovalen M. fortuitum, (F) kontrol

Kadar hematokrit merupakan perbandingan antara komposisi plasma darah

dan sel darah. Plasma darah terdiri atas protein yang memiliki variasi berat

molekul dan fungsi. Menurut Satchell (1991) plasma darah ikan trout

mengandung fibrinogen, globulin, cerutoplasma, protein spesifik yang berikatan

dengan copper, besi dan iodin, transferin, glikoprotein, lipoprotein, fosfolipid,

albumin dan immunoglobulin. Clark et al. (1976) dalam Kori-Siakpere et al

(2005) menyatakan bahwa nilai hematokrit ikan biasanya berkisar antara 20 –

35% dan jarang sekali mencapai 50%. Hal ini dikarenakan jaringan hematopoetik

memproduksi eritrosit muda untuk mengganti eritrosit yang tua. Eritrosit muda

memiliki inti yang lebih besar dibandingkan dengan sitoplasmanya sehingga

Page 76: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

50

menyebabkan volume eritrosit muda lebih besar daripada eritrosit yang sudah tua

(Nabib dan Pasaribu , 1989).

6. Indeks fagositosis

Aktivitas fagositosis diukur dari nilai persentase fagositosis dan indeks

fagositik. Hasil penelitian menunjukkan peningkatan persentase fagositosis

setelah 1 minggu pascavaksinasi selanjutnya menurun setelah 2 minggu

pascavaksinasi dan kembali meningkat setelah 3 minggu pascavaksinasi (Gambar

20). Nilai persentase fagositosis pada perlakuan vaksin koktail 50Mf:50Ah

menunjukkan persentase yang lebih tinggi dibanding kelompok perlakuan lain dan

kontrol (P<0.05).

Gambar 20 Persentase fagositosis ikan gurame pasca vaksinasi dengan

berbagai sediaan vaksin. (A) koktail 25Mf:75Ah, (B) koktail 50

Mf:50Ah, (C) koktail 75Mf:25Ah, (D) monovalen A. hydrophila,

(E) monovalen M. fortuitum, (F) kontrol

Indek fagositik ikan gurame pascavaksinasi dengan vaksin monovalen dan

koktail M. fortuitum dan A. hydrophila menunjukkan penurunan pada minggu ke

– 2 dan meningkat kembali pada minggu ke – 3 (Gambar 21). Hasil analisis indek

fagosit dari perlakuan vaksin monovalen dan koktail berbeda nyata (P<0.05)

dibanding dengan kontrol.

Aktifitas fagositosis dari perlakuan vaksin menunjukkan perbedaan nyata

(P<0.05), hal tersebut menunjukkan bahwa pemberian vaksin mampu

meningkatkan kemampuan bakterisidal serum ikan terhadap invasi antigen vaksin.

Page 77: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

51

Fagositosis adalah proses penelanan partikel solid oleh fagosit membentuk

fagosom internal. Fagositosis adalah bentuk spesifik dari endositosis yang

melibatkan internalisasi vesikular terhadap partikel padat, seperti bakteri dan

bentuk lain yang cukup berbeda dengan fagositosis adalah pinositosis yaitu

internalisasi vesikular terhadap berbagai cairan. Fagositosis bertanggung jawab

terhadap akuisisi nutrisi pada beberapa sel dan di dalam sistem imunitas.

fagositosis adalah mekanisme utama untuk menghilangkan patogen dan serpihan

sel.

Gambar 21 Indek fagositik ikan gurame pasca vaksinasi dengan berbagai

sediaan vaksin. (A) koktail 25Mf:75Ah, (B) koktail 50 Mf:50Ah,

(C) koktail 75Mf:25Ah, (D) monovalen A. hydrophila, (E)

monovalen M. fortuitum, (F) kontrol

Vaksin yang diberikan merupakan komponen bakteri yang telah

diinaktifasi akan masuk ke dalam aliran darah akan dikenali sebagai antigen yang

akan merangsang respon imun spesifik dan apabila terpapar dalam jangka lama

akan membentuk suatu memori. Menurut Skinner et al. (2010) bahwa respon

imun non spesifik akan mengalami fluktuasi sesaat setelah invasi antigen dalam

hitungan hari, sedangkan respon imun spesifik terbentuk dalam hitungan minggu.

Kedua respon imun tersebut berperan penting dalam mekanisme tanggap kebal

ikan terhadap serangan patogen. Sugiani (2012) menyatakan bahwa aktifitas

fagositosis dapat terjadi apabila ada reaktif oksigen yang bekerja sendiri maupun

bersama-sama dengan enzim lisosim dalam membunuh bakteri sebagai sel asing.

Page 78: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

52

7. Diferensial leukosit

Jenis leukosit pada ikan gurame terdiri dari limfosit, monosit, neutrofil

namun jarang ditemukan basofil dan eosinofil sebagaimana yang diungkapkan

oleh Mulyani (2006). Rataan persentase limfosit minggu ke – 1, ke – 2 dan ke – 3

dari masing – masing perlakuan berkisar antara 84 – 98 % (Gambar 22).

Gambar 22 Persentase total limfosit sel darah putih ikan gurame pasca

vaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3%

Rataan persentase limfosit pada perlakuan vaksin monovalen dan koktail

pada darah ikan gurame tidak berbeda nyata (P>0.05) pada minggu ke – 1, ke – 2

maupun ke – 3 pasca vaksinasi. Jumlah limfosit pada ikan lebih banyak daripada

neutrofil maupun monosit karena limfosit merupakan penghasil antibodi untuk

kekebalan tubuh. Produksi antibodi adalah suatu proses yang terjadi dalam

limfosit sebagai reaksi terhadap kehadiran bahan protein asing (antigen), termasuk

sel – sel bakteri.

Persentase jumlah monosit pada perlakuan vaksin pascavaksinasi minggu

ke – 1 hingga ke – 3 terlihat fluktuatif (Gambar 23), di mana meningkat pada

minggu ke – 1 pascavaksinasi, menurun pada minggu ke – 2 dan kembali

meningkat pada minggu ke – 3. Peningkatan jumlah monosit pada perlakuan

vaksin merupakan kondisi respon imun yang alamiah terhadap antigen yang akan

dikenali tubuh sebagai benda asing. Monosit berfungsi sebagai fagosit terhadap

benda asing yang masuk ke dalam tubuh. Monosit akan bergerak ke arah luka

Page 79: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

53

untuk melakukan fagositosis. Masa hidup monosit sangat cepat hanya berkisar 10

– 20 jam setelah diproduksi (Guyton dan Hal, 1997).

Gambar 23 Persentase total monosit sel darah putih ikan gurame pasca

vaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3%

Persentase jumlah neutrofil mengalami fluktuasi, di mana terjadi

peningkatan pada minggu ke – 3 pascavaksinasi (Gambar 24). Peningkatan

jumlah neutrofil yang terlihat pada perlakuan vaksin pada minggu ke – 3

pascavaksinasi mengindikasikan bahwa vaksin bekerja menginduksi sistem imun

tubuh ikan.

Gambar 24 Persentase total neutrofil sel darah putih ikan gurame pasca

vaksinasi dengan vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi

dengan neutral buffer formalin 3%

Neutrofil merupakan komponen darah putih yang pertama kali akan

meninggalkan pembuluh darah dan berkomplemen dengan lisosom (vakuola berisi

enzim) yang akan digunakan sel untuk menghancurkan benda asing. Menurut

Page 80: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

54

Ellis et al. (1978) neutrofil pada ikan sama seperti pada mamalia tetapi memiliki

proporsi yang cenderung lebih sedikit yaitu 6 – 8%. Rendahnya persentase

neutrofil pada minggu ke – 2 dibanding jenis sel darah putih yang lain

dikarenakan umumnya neutrofil ditemukan dan terakumulasi di daerah infeksi,

mengingat neutrofil bergerak aktif menuju daerah infeksi pada saat terjadinya

luka.

Tahap 4

Proteksi silang vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila pada

ikan gurame (O. gouramy)

Kematian ikan akibat infeksi A. hydrophila mulai terjadi pada hari ke – 2

sampai hari ke – 14, dimana rata – rata kematian tertinggi terjadi pada hari ke – 4

sampai hari ke – 7 (Gambar 25). Kematian ikan akibat infeksi M. fortuitum

terjadi pada hari ke 11 – 28, jumlah kematian tertinggi mulai terjadi pada hari ke

21 – 25 (Gambar 26).

Gambar 25 Kematian kumulatif harian ikan gurame yang divaksinasi dengan

vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi dengan neutral

buffer formalin 3% setelah diuji tantang dengan bakteri A.

hydrophila

Page 81: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

55

Gambar 26 Kematian kumulatif harian ikan gurame yang divaksinasi dengan

vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi dengan neutral

buffer formalin 3% setelah diuji tantang dengan bakteri M.

fortuitum

Pola infeksi kedua jenis bakteri tersebut berbeda, A. hydrophila

menyebabkan infeksi akut sedangkan M. fortuitum menyebabkan infeksi yang

bersifat kronis. A. hydrophila pada kondisi optimum hanya membutuhkan waktu

dalam hitungan jam untuk menyebabkan infeksi pada inang berbeda halnya

dengan M. fortuitum yang membutuhkan waktu lebih lama. Berdasarkan analisa

sidik ragam menunjukkan bahwa perlakuan vaksin monovalen A. hydrophila

maupun M. fortuitum berbeda nyata (P<0.05) dengan kontrol ketika diuji tantang

dengan bakteri yang homolog .

Kematian ikan gurame setelah diuji tantang dengan ko-infeksi M.

fortuitum dan A. hydrophila terjadi pada hari ke – 15 sampai hari ke – 28,

dengan jumlah kematian tertinggi terjadi pada hari ke – 22 sampai hari ke – 25

(Gambar 27). Perlakuan vaksin monovalen A. hydrophila dan M. fortuitum

menunjukkan kematian yang lebih tinggi daripada perlakuan vaksin koktail M.

fortuitum dan A.hydrophila. Kondisi demikian menunjukkan bahwa vaksin koktail

mampu memberikan proteksi silang lebih baik dibanding vaksin monovalen

terhadap ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila. Vaksin koktail dengan

komposisi 50% M. fortuitum dan 50% A. hydrophila mampu memberikan proteksi

terbaik terhadap uji tantang bakteri A. hydrophila, M. fortuitum dan ko-infeksi

keduanya.

Page 82: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

56

Gambar 27 Kematian kumulatif harian ikan gurame yang divaksinasi dengan

vaksin monovalen dan koktail yang diinaktifasi dengan neutral

buffer formalin 3% setelah diuji tantang dengan ko-infeksi bakteri

M. fortuitum dan A. hydrophila

Rata – rata kematian harian ikan gurame yang divaksin dengan vaksin

monovalen A. hydrophila yang diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila

menunjukkan kematian yang lebih rendah sebesar 3.33% dibanding perlakuan

vaksin lain dan kontrol (P<0.05). Namun sebaliknya jika diuji tantang dengan M.

fortuitum dan ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila menunjukkan tingkat

kematian yang tinggi. Hal yang sama juga pada perlakuan vaksin monovalen M.

fortuitum menunjukkan kematian yang rendah jika ditantang dengan bakteri M.

fortuitum dan komulatif kematian yang tinggi jika ditantang dengan bakteri A.

hydrophila. Hal tersebut membuktikan bahwa vaksin monovalen hanya

memberikan proteksi terhadap infeksi bakteri yang homolog dan tidak

memberikan proteksi silang terhadap infeksi bakteri yang lain. Shieh (1987)

mengungkapkan bahwa Atlantic salmon yang divaksinasi melalui injeksi intra

muskular dengan vaksin sediaan ekstraselular protease dari A. hydrophila dapat

melindungi dari uji tantang dengan bakteri yang homolog dan beberapa isolat

bakteri yang heterolog dari A. hydrophila.

Page 83: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

57

Hematologi dan respon imun ikan gurame setelah diuji tantang

Vaksinasi merupakan salah satu upaya untuk melindungi tubuh ikan

terhadap infeksi patogen tertentu. Pemberian vaksin diharapkan dapat merangsang

respon imun spesifik dan non spesifik pada ikan. Keberhasilan vaksinasi pada

ikan dapat dilihat dari beberapa parameter pendukung antara lain nilai hematokrit,

hemoglobin, indek fagositik, persentase fagositik, titer antibodi, uji respiratory

burst (NBT), aktivitas komplemen dan diferensial leukosit. Perubahan parameter

pendukung efikasi vaksin monovalen dan koktail setelah diuji tantang dengan

bakteri A. hydrophila, M. fortuitum dan gabungan keduanya dapat dilihat

selengkapnya pada Tabel 8, 9 dan 10.

Tabel 8 Parameter hematologi dan respon imun efikasi vaksin monovalen dan

koktail setelah diuji tantang dengan A. hydrophila

Perlakuan He

(%)

Hb

(g %)

IP PP

Ab

(log

2)

NBT C (%)

Diferensial leukosit

(%)

L M N

Kok. 25 Mf:75 Ah 27.2±

0.95

4.7±0.3 1.5±

0.05

79.0

±2

5 0.3±

0.04

61.36 87±

0.0

2.0±

0.0

11.5

±0.5

Kok.50 Mf :50 Ah 26.2±

2.15

6.25±0.25 1.8±

0.4

74.5

±6.5

5 0.38

±0.0

49.66 94±

0.0

4.5±

0.5

1.5±

0.5

Kok.75Mf : 25 Ah 41.3±

4.97

6.5±0.5 2.4±

0.45

70.0

±3

6 0.35

±0.0

3

63.81 91±

8.0

5.5±

4.5

3.5±

3.5

Mono A.

hydrophila

29.7±

1.17

5.4±0.4 1.55±

0.45

68.0

±1

8 0.78

±0.0

1

43.40 91±

0.0

4.5±

1.5

4.5±

1.5

Mono M.

fortuitum

28.4±

0.98

6.0±0.1 1.3±

0.1

74.0

±14

4 0.36

±0.1

68.84 86±

1.0

3.5±

0.5

10.5

±0.5

Kontrol 21.1±

1.66

4.3±0.7 1.05±

0.05

43.4

±3.5

1 0.2±

0.01

80.41 78±

2.0

7.0±

3.0

13±

3.0

Kok (koktail), Mono (Monovalen), He (hematokrit), Hb (hemoglobin), IP (indek

fagositik), PP (persentase fagositosis), Ab (Antibodi), NBT (Uji respiratory burst), C

(komplemen), L (Limfosit), M (Monosit), N (Neutrofil)

Ada korelasi yang kuat antara hematokrit dan jumlah hemoglobin,

semakin rendah jumlah sel – sel darah merah maka semakin rendah pula

kandungan hemoglobin dalam darah (Fujaya, 2004). Kadar hematokrit dan

hemoglobin pada ikan gurame perlakuan vaksin monovalen dan koktail setelah

diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila , M. fortuitum dan gabungan keduanya

menunjukkan nilai lebih tinggi dan berbeda nyata (P<0.05) dibanding dengan

kontrol (Tabel 8, 9 dan 10). Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa vaksin yang

diberikan mampu membantu tubuh ikan untuk mempertahankan diri dan

Page 84: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

58

mencegah berkembangnya patogen dalam tubuh sehingga tidak menyebabkan

sakit. Infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila tidak berpengaruh nyata terhadap

kadar hematokrit dan hemoglobin pada perlakuan vaksin.

Tabel 9 Parameter hematologi dan respon imun efikasi vaksin monovalen dan

koktail setelah diuji tantang dengan M. fortuitum

Perlakuan He (%)

Hb

(g %)

IP PP

Ab

(log

2)

NBT C (%)

Diferensial leukosit

(%)

L M N

Kok. 25 Mf:75Ah 39.28±

2.91

4.6±0.4 3.1±

0.3

64.5

±3.5

5 0.12±

0.01 58.23 85±4 5.5±

4.5

9.5±

0.5

Kok. 50 Mf :50Ah 31.38±

1.38

4.1±0.3 2.65

±0.0

5

67±

3.0

6 0.16±

0.04

49.52

87±1 9±1 4±0

Kok. 75Mf :25Ah 38.16±

1.12

4.8±0.2 1.95

±0.0

5

64.5

±2.5

6 0.10±

0.01

56.33

89.5

±0.5

3.5±

2.5

7±3

Mono A. hydrophila 29.72±

0.63

4.1±0.1 2.1±

0.1

57±

3.0

2 0.13±

0.02

65.03

87.5

±1.5

2.5±

0.5

10±2

Mono M. fortuitum 42.23±

2.60

4.7±0.15 2.85

±0.1

5

68±

2.0

7 0.12±

0.01

45.99

86.5

±3.5

7.5±

2.5

6±1

Kontrol 21.1±1.

66

3.6±0.2 1.3±

0.1

48.5

±7.5

1 0.09±

0.01 102.31 82±2 3.5±

0.5

14.5

±2.5

Kok (koktail), Mono (Monovalen), He (hematokrit), Hb (hemoglobin), IP (indek

fagositik), PP (persentase fagosit), Ab (Antibodi), NBT (Uji respiratory burst), C

(komplemen), L (Limfosit), M (Monosit), N (Neutrofil)

Tabel 10 Parameter hematologi dan respon imun efikasi vaksin monovalen dan

koktail setelah diuji tantang ko-infeksi dengan M. fortuitum dan A

hydrophila

Perlakuan He

(%)

Hb

(g %)

IP PP

Ab

(log

2)

NBT C (%)

Diferensial leukosit

(%)

L M N

Kok. 25 Mf: 75 Ah 29.57±

0.26

4.5±0.5 1.45±

0.35

75.5

± 2.5 6 0.144±

0.02

72.11 84±1 3.5±

3.5

12.5

±2.5

Kok. 50 Mf: 50 Ah 33.02±

0.94

4.5±0.5 1.75±

0.05

70.5

± 3.5 6 0.244±

0.01

64.49 86.5

±2.5

14±1 4.5±

1.5

Kok. 75Mf :25 Mf 37.03±

1.44

4.6±0.2 1.1±0.1 67±3 6 0.136±

0.01

73.61 81±1 6.5±

1.5

12.5

±2.5

Mono A. hydrophila 33.34±

0.62

4.5±0.5 1.1±0.1 61±3 5 0.129±

0.00

76.46 82±2 11±1 7±3

Mono M. fortuitum 34.83±

0.35

4.8±0.1 0.45±

0.05

62±3 4 0.38±0.

06

86.80 80.5

±0.5

14±1 5.5±

0.5

Kontrol 28.31±

1.52

3.9±0.1 0.4±

0.1

44±4 1 0.107+

0.01

104.22 72.5

±2.5

8.5±

3.5

19±1

Kok (koktail), Mono (Monovalen), He (hematokrit), Hb (hemoglobin), IP (indek

fagositik), PP (persentase fagosit), Ab (Antibodi), NBT (Uji respiratory burst), C

(komplemen), L (Limfosit), M (Monosit), N (Neutrofil)

Kemampuan fagositosis pada ikan gurame yang divaksin dengan vaksin

monovalen dan koktail setelah diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila , M.

Page 85: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

59

fortuitum dan gabungan keduanya menunjukkan berbeda nyata (P<0.05)

dibandingkan kontrol (Tabel 8, 9 dan 10). Aktivitas fagositosis yang tinggi

mengindikasikan vaksin mampu meningkatkan komponen respon imun non

spesifik pada ikan sehingga mampu menghancurkan bakteri yang masuk sebagai

benda asing ke dalam tubuh ikan.

Respon imun spesifik ikan diekspresikan dengan adanya aglutinasi

terhadap antigen dan presipitasi terhadap antigen terlarut (Kamiso et al., 1993).

Pemberian vaksin pada ikan menstimulasi terbentuknya antibodi dalam jumlah

banyak yang teridentifikasi dengan terjadinya penggumpalan yang dikenal dengan

titer antibodi. Titer antibodi ikan gurame yang divaksin dengan vaksin monovalen

dan koktail menunjukkan nilai titer antibodi log 2 yang berbeda nyata (P<0.05)

dibandingkan dengan kontrol setelah ditantang dengan bakteri A. hydrophila, M.

fortuitum dan gabungan keduanya (Tabel 8, 9 dan 10). Pada perlakuan vaksin

monovalen menunjukkan nilai titer yang lebih tinggi daripada vaksin koktail dan

kontrol setelah ditantang dengan bakteri homolog, namun sebaliknya jika

ditantang dengan bakteri yang tidak homolog menunjukkan nilai titer yang lebih

rendah. Imunoglobulin pada ikan hanya menyerupai IgM (IgM like) sehingga

pembentukan antibodi pascavaksinasi pada ikan tidak seoptimal pada hewan

tingkat tinggi.

Perubahan dalam kadar komplemen menunjukkan adanya proses penyakit.

Pada saat antibodi tersangkut pada permukaan mikroorganisme yang menyerang,

serangkaian protein plasma yang disebut komplemen akan teraktifasi. Protein

komplemen ini mampu menghancurkan penyerang tersebut. Proses ini dimulai

oleh perubahan konformasional pada daerah Fc suatu antibodi pada saat berikatan

dengan antigen. Jika antigen tersebut melayang bebas dalam sirkulasi sebagai

molekul tunggal, kompleks imun yang terbentuk dapat berikatan pula dengan

komplemen. Komplemen dalam kompleks tersebut kemudian dapat membantu

menarik sel-sel fagosit, yang akan menelan dan membuang antigen yang

diinaktivasi dari sirkulasi. Menurut Sugiani (2012) bahwa pemberian vaksin

monovalen dan koktail dapat mempengaruhi respons imun, diduga dengan adanya

antibodi akan menginisiasi aksi berantai komplemen sehingga lisozim serum

Page 86: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

60

dapat masuk ke dalam lapisan peptidoglikan bakteri dan menyebabkan kematian

sel.

Persentase total limfosit pada perlakuan vaksin monovalen maupun koktail

pasca uji tantang dengan bakteri A. hydrophila, M. fortuitum dan ko-infeksi

keduanya menunjukkan nilai yang berbeda nyata (P<0.05) dengan kontrol. Hal

tersebut menandakan bahwa pemberian vaksin monovalen dan koktail dapat

meningkatkan jumlah limfosit untuk menghasilkan antibodi. Proporsi komponen

sel darah putih yaitu limfosit, monosit dan neutrofil merupakan indikator respon

imun non spesifik. Limfosit tidak bersifat fagositik namun memegang peranan

penting dalam pembentukan antibodi. Kekurangan jumlah limfosit dapat

menurunkan konsentrasi antibodi dan menyebabkan meningkatnya serangan

penyakit.

Neutrofil berperan pada aktifitas fagositik dan sitotoksik, bermigrasi ke

tempat inflamasi dan infeksi atas pengaruh faktor kemotaktik. Peran utama

neutrofil adalah sebagai pertahanan awal imun non spesifik terhadap infeksi

bakteri. M. fortuitum dan A. hydrophila adalah tipe bakteri yang menghasilkan

produk ekstraselular, di mana toksin yang dihasilkan akan dinetralkan dan bakteri

yang masuk akan dieliminasi oleh sel fagosit yaitu neutrofil, monosit dan

makrofag. Faktor virulensi A. hydrophila melibatkan adhesi, lapisan protein

permukaan (S layer) dan beberapa enzim ekstraseluler termasuk protease,

hemolysin, enterotoksin, serta acetycholinesterase (Liu & Bi, 2006).

Lipopolisakarida dalam dinding bakteri A. hydrophila dapat mengaktifasi

komplemen jalur alternatif tanpa adanya antibodi. Hasil aktifasi ini adalah

komplemen (C3b) yang mempunyai efek opsonisasi, lisis bakteri melalui serangan

komplek membran dan respons inflamasi akibat pengumpulan serta aktifasi

leukosit. Endotoksin juga merangsang makrofag dan sel lain seperti endotel

vaskular untuk memproduksi sitokin seperti interleukin (IL-1, IL-6 dan IL-8).

Dinding bakteri M. fortuitum mengandung suatu komponen lipid yang

dapat menghambat pengabungan fagosom dengan lisosom sehingga menyebabkan

respon imun terhadap infeksi dan pembentukan respons imun spesifik yang

diperantarai sel – sel limfosit juga menjadi terhambat. Perbedaan dalam dinding

Page 87: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

61

sel strain mikobakteri bisa menjadi alasan untuk memicu sitokin yang berbeda

terhadap respon inflamasi yang berbeda. Beberapa sitokin ,seperti interleukin-4

(IL-4) dan interferon-g (IFN-g) menginduksi pembentukan sel raksasa dari

makrofag . Dengan bantuan IL-3 atau granulocyte macrofag colony stimulating

factor (GM-CSF), IL-4 menginduksi sel raksasa yang sangat besar sampai dengan

285 inti, sedangkan IFN-g cenderung menginduksi sel yang relatif kecil raksasa

(misalnya 16 inti per sel) (Talaat et al, 1999).

Nilai RPS perlakuan vaksin monovalen dan koktail setelah diuji tantang

dengan infeksi tunggal maupun ko-infeksi terlihat pada Tabel 11. Vaksin

monovalen A. hydrophila menunjukkan nilai RPS sebesar 92.32% berbeda nyata

dengan perlakuan vaksin lain (P<0.05) setelah uji tantang dengan bakteri A.

hydrophila dan nilai RPS 42.86% setelah diuji tantang dengan M. fortuitum.

Vaksin monovalen M. fortuitum menunjukkan nilai RPS 78.57% berbeda nyata

(P<0.05) dari perlakuan vaksin lain setelah ditantang dengan M. fortuitum.

Tabel 11 Tingkat RPS ikan gurame yang divaksinasi dengan vaksin monovalen

dan koktail M. fortuitum dan A. hydrophila

Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak

berbeda nyata pada taraf uji P>0,05

Vaksin koktail 25 Mf : 75 Ah menunjukkan nilai RPS yang rendah dan

berbeda nyata (P<0.05) dengan perlakuan vaksin lain setelah diuji tantang dengan

M. fortuitum, hal ini diduga disebabkan jumlah antibodi terhadap M. fortuitum

yang terbentuk tidak cukup untuk mengantisipasi infeksi M. fortuitum.

Berdasarkan hasil tersebut menunjukkan vaksin monovalen efektif memberikan

proteksi terhadap mono infeksi bakteri homolog dan proteksi silang yang sangat

rendah terhadap bakteri lain dan ko-infeksi. Vaksin koktail dengan komposisi

50Mf : 50Ah menunjukkan nilai RPS terbaik terhadap mono infeksi dan ko-

infeksi dibanding kedua vaksin koktail lainnya. Walaupun menurut Ellis (1988)

Perlakuan Relative Percent Survival (RPS) setelah diuji tantang

A. hydrophila M. fortuitum Ko-infeksi

M. fortuitum dan A. hydrophila

Koktail 25 Mf :75 Ah 61.54b 28.57c 39.13a

Koktail 50 Mf : 50 Ah 61.53b 57.14b 39.13a

Koktail 75Mf : 25 Ah 53.843b 57.14b 30.44b

Monovalen Ah 92.32a 42.86b 26.09b

Monovalen MF 30.76c 78.57a 17.39c

Page 88: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

62

suatu vaksin dikatakan efektif apabila nilai RPS ≥ 50%, tingkat kematian pada

kontrol paling sedikit 60%, sedangkan tingkat kematian pada ikan yang divaksin

kurang dari 24% namun jika komposisi koktail 50Mf : 50Ah diaplikasikan pada

budidaya ikan gurame akan mampu menekan kerugian yang jauh lebih besar jika

terserang penyakit Mycobacteriosis dan MAS dalam waktu bersamaan dibanding

jika tidak divaksin.

Perlakuan vaksin koktail dalam penelitian ini memberikan level proteksi

terhadap mono infeksi bakteri A. hydrophila dengan tingkat kelangsungan hidup

sebesar 80 – 83.33% atau M. fortuitum dengan tingkat kelangsungan hidup

sebesar 66.67 – 80 % namun tidak memberikan proteksi yang optimum terhadap

ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila, sehingga perlu dicari solusi aplikatif

untuk meningkatkan level proteksi salah satunya dengan penggunaan adjuvan.

Efikasi vaksin secara injeksi intraperitoneal memberikan hasil yang lebih

baik dalam membentuk respons humoral antibodi dibanding dengan pemberian

vaksin melalui rendam atau semprot (Thune dan Plumb, 1982). Keberhasilan

vaksin koktail dipengaruhi oleh konsentrasi antigen , reaksi silang dan kompetisi

di antara antigen yang berbeda. Penelitian yang dilakukan oleh Nikoskelainen et

al. (2007) menunjukkan bahwa vaksin koktail sel utuh memberikan proteksi yang

lebih baik daripada vaksin monovalen pada ikan rainbow trout dan salmon

Atlantik (Salmo salar). Bastardo et al. (2012) mengemukakan vaksin koktail L.

garvieae dan A. hydrophila memberikan level proteksi sebesar 76.5% setelah

ditantang dengan L. garvieae dan 85% setelah ditantang dengan A. hydrophila dan

terhadap gabungan infeksi keduanya sebesar 70%. Dalam penelitian ini diperoleh

hasil bahwa vaksin monovalen A. hydrophila dan M. fortuitum memberikan

proteksi terhadap infeksi bakteri homolog dan tidak memberikan proteksi silang

terhadap jenis yang berbeda sebaliknya vaksin koktail mampu memberikan

proteksi silang terhadap ko-infeksi lebih baik dari vaksin monovalen.

Faktor pendukung keberhasilan efikasi selama masa induksi dan setelah

uji tantang dipengaruhi oleh kondisi lingkungan perairan yang sesuai untuk

pertumbuhan ikan gurame. Nilai kualitas air selama penelitian disajikan pada

Tabel 12.

Page 89: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

63

Tabel 12 Kisaran Hasil Pengukuran Kualitas Air Selama Penelitian

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap kualitas air media pemeliharaan

ikan uji menunjukkan bahwa kisaran kualitas air media pemeliharaan dari empat

parameter yaitu suhu, pH, DO dan TAN tersebut sesuai untuk pemeliharaan ikan

uji yaitu gurame. Hal ini menunjukkan bahwa hasil penelitian yang diperoleh

disebabkan adanya perbedaan perlakuan dan bukan merupakan pengaruh dari

kualitas air.

Parameter Kisaran Satuan

Temperatur 30 -32 °C

pH 6,5 - 7 -

TAN 0,014 - 0,106 ppm

Oksigen terlarut 5 - 8 mg/L

Page 90: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

64

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1. Patogenitas ko-infeksi pada ikan gurame menunjukkan bakteri M.

fortuitum menyebabkan infeksi kronis di mana kematian mulai terjadi hari

ke – 18 pascainfeksi sedangkan infeksi A. hydrophila bersifat akut di

mana kematian terjadi 48 jam pascainfeksi.

2. Antigen M. fortuitum dan A. hydrophila pada sediaan vaksin koktail

memiliki sinergitas dan kompetensi sehingga dapat meningkatkan respon

imun spesifik dan non spesifik pada gurame yang ditunjukkan dari nilai –

nilai parameter respon imun spesifik dan non spesifik yang berbeda nyata

(P<0.05) dari kontrol.

3. Sediaan vaksin koktail dengan komposisi 50Mf:50Ah mampu

menginduksi respon imun spesifik dan non spesifik terbaik terhadap ko-

infeksi daripada vaksin monovalen pada ikan gurame.

SARAN

Penelitian lanjutan dengan menggunakan adjuvan perlu dilakukan untuk

mengoptimalkan respon imun spesifik dan non spesifik yang terbentuk dari

pemberian sediaan vaksin koktail M. fortuitum dan A. hydrophila dengan

komposisi terbaik yang telah diperoleh dalam penelitian ini pada ikan gurame

sehingga mampu meningkatkan level proteksi yang optimum terhadap ko-infeksi

penyakit Mycobacteriosis dan MAS dengan mempertimbangkan aspek

karakteristik antigen, reaksi silang dan immunokompetisi antigen pada ikan

gurame.

Page 91: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

65

DAFTAR PUSTAKA

Alagappan KM, Deivasigamani B, Kumaran S, Sakthive M. 2009.

Histopathological alterations in Estuarine Catfish (Arius maculatus;

Thunberg, 1792) due to Aeromonas hydrophila infection. Journal of Fish

and Marine Sciences 1 (3): 185-189.

Aly TM. 1981. Studies on the effect of different adjuvant on the efficiency of

FMD vaccine in farm animal. Ph. D. faculty of Vet. Med. Zagazig

University - Egypt.

Anderson DP. 1974. Fish immunology. T.F.H. Publication, Inc. Ltd. Hongkong.

Hlm 239.

Anderson DP. 2004. Immunostimulants, vaccines, and environmental stressors in

aquaculture: NBT assays to show neutrophil activity by these

immunomodulators. Di dalam: Suarez C et al., editor. Avances en

nutricion acuicola VII. Memorias del Simposium Internacional de

Nutricion Acuicola. 16-19 Nov 2004, Sonora Mexico.

Anderson RS, 1999. Perkinsus marimus sectretory product modulated superoxide

anion production by oyster (Crassastrea Virginia) hemocytes. Fish

immunology 9: 51-60.

Anderson DP, Siwicki AK. 1995. Basic hematology and serology for fish health

programs. Di dalam: Shariff M, Arthur JR, Subasinghe RP, editor. Fish

Health Section. Asia Fisheries Society (eds), Disease in Asian Aquaculture

II. Manila, Philippines. hlm 185-202.

Anderson DP, Capstiek PB, Mowat GN. 1970. In vitro method for safety of

FMD. J. hyg. Gamd. 68: 159-172.

[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 1990. Official methods of

analysis. 15th

Ed Association of Official Analytical Chemists Inc. Virgnia,

USA.

Austin B, Austin DA. 1987. Bacterial fish pathogens: disease in farmed and wild

fish, 1st edition, John Wiley and Son Publisher, Ontario, Canada.

Baba T, Imamura J, Izawa K, Ikeda K. 1988. Immune protection in carp, Cyprinus

carpio L., after immunization with Aeromonas hydrophila crude

lipopolysaccharide. Journal of Fish Diseases 11: 237-244.

Bangkit I. 2011. Efektivitas vaksin Mycobacterium fortuitum yang diinaktivasi

dengan formalin untuk pencegahan Mycobacteriosis pada ikan gurami

(Osphronemus gouramy). Skripsi. Jurusan Perikanan Fakultas Perikanan

dan Ilmu Kelautan. Universitas Padjadjaran. Jatinangor. Hal. 58

Page 92: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

66

Bastardo A, Ravelo C, Castro N, Calheiros J, Romalde JL. 2012. Effectiveness of

bivalent vaccines against A. hydrophila and Lactococcus garvieae

infections in Rainbow Trout, Oncorhynchus mykiss (walbaum). Journal

Fish & Shellfish Immunology 32: 756-761.

Briken V, Porcelli SA, Besra GS, Kremer L. 2004. Mycobacterial

lipoarabinomannan related lipoglycans from biogenesis to modulation of

the immune response. Mol. Microbial 53: 391-403.

Brook GF, Bufel JS, Ornston LN. 1989. Medical microbiology, 19th Edition, A

Large Medical Book, San Matters, California, USA.

Burke V et al. 1983. The microbiology of childhood gastroenteritis: Aeromonas

species and other infective agents. J.Infect.Dis.148:68-74.

Chen SC, Adams A, Richards RH. 1997. Extracellular products from

Mycobacterium spp. in fish. Journal of Fish Diseases 20 ; 19 – 25.

Chen SC, Adams A, Thomson KD, Richard RH. 1998. Electron microscope

studies of the in vitro phagocytosis of Mycobacterium spp. by rainbow

trout Oncorhynchus mykiss head kidney macrophages. Journal Diseases

of Aquatic Organism 32: 99-110.

Darwish A, Plumb JA, Newton JC. 2000. Histopathology and pathogenesis of

experimental infection with Edwardsiella tardain channel catfish. Journal

of Aquatic Animal Health 12:255-266.

Dopongtonung A. 2008. Gambaran Darah Ikan Lele (Clarias spp.) yang Berasal

Dari Daerah Laladon-Bogor. [Skripsi]. Departemen Budidaya Perairan,

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. hlm 20

Ellis AE, Roberts RJ, Tytler P. 1978. The anatomy and physiology of teleosts.

Didalam : Robeets RJ. Fish Pathology. Balliere Tindall, London. Hlm 32

– 46.

Ellis AE. 1988. General principles of fish vaccination. Di dalam: Ellis AE, editor.

Fish vaccination. Academic Press, London, hlm 1- 19.

Ellis AE. 2001. Innate host defense mechanisms of fish against viruses and

bacteria. Developmental and Comparative Immunology 25: 827-39.

Encheva V. SE Gharbia. R. wait. S. Begum and HN Shah. 2006. Comparison of

extraction procedures for proteome analysis of Streptococcus pneumoniae

and a basic reference map. John Wiley. Hlm. 112 - 115

Fujaya Y. 2004. Fisiologi Ikan, Dasar Pengembangan Teknik Perikanan. Rineka

Cipta, Jakarta, hlm 95-99.

Page 93: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

67

Fulton SA, Reka SM, Martin TD, Boom WH. 2002. Neutrophil-mediated

mycobacteriocidal immunity in the lung during Mycobacterium bovis

BCG infection in C57BL/6 mice. Infect. Immun. 70(9):5322-5327.

Gassent MDE, Fouz B, Amaro C. 2004. Efficacy of bivalent vaccine against eel

diseases caused by Vibrio vulnificus after its administration by four

different routes. Fish and Shellfish Immunology 16: 93 – 105.

Gesti A. 2011. Efektivitas vaksin Mycobacterium fortuitum sediaan ekstracelluler

pruduct (ECP) yang diinaktivasi dengan formaline killed untuk

pencegahan Mycobacteriosis pada ikan gurami (Osphronemus gouramy).

Skripsi. Jurusan Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.

Universitas Padjadjaran. Jatinangor.

Gudding R, Lillehaug A, Evensen O. 1999. Recent development in fish

vaccinology. Veterinary Immunology and Immunopathology 72: 203-212.

Guyton AC, Hall JE. 1997. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi 9. Penerbit

Buku Kedokteran EGC

Hasser EF. 1960. Methods for routine fish hematology. Progressive Fish Culturist

(22): 164-170.

Hoel K, Salonius K, Lillehaug A. 1997. Vibrio antigens of polyvalent vaccine

enhance the humoral immune responsse to Aeromonas salmonicida

antigens in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish and Shellfish

Immunology 7: 71 – 80.

Holand MC, Lambris JD. 2002. The complement system in teleosts fish. Shellfish

immunology 12(5): 339-420.

Ibrahem M, Mostafa M, Arab RMH, Rezk MA. 2008. Prevalence of Aeromonas

hydrophila infection in wild cultured Tilapia Nilotica (O. niloticus) in

Egypt. 8th

International Symposium on Tilapia in Aquaculture 2008. hlm

1257-1271.

Irianto A. 2005. Patologi ikan teleostei. Gadjah Mada University Press.

Yogjakarta. Hal. 256.

Ismail NDA, Atta NS, Aziz AE. 2010. Oral Vaccination of Nile Tilapia

(Orechromis niloticus) against Motile Aeromonas Septicaemia. Nature

and Science 2010. 6 hlm.

Jawad LA, Al-Mukhtar MA, Ahmed HK. 2004. The Relationship between

haematocrit and some biological parameters of Indian Shad, Tenualosa

illisha (Family Clupeidae). Animal Biodiversity Conservation 27(2): 47-

52.

Jawetz E, Melnick LJ, Adelberg AE. 1996. Microbiologi Kedokteran, Edisi-20,

alih bahasa Edi Nugroho, R.F. Maulany, C.V EGC, Jakarta:236-237.

Page 94: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

68

Kamiso HN et al. 1993. Deskripsi hama dan penyakit ikan karantina golongan

bakteri, Pusat Karantina Perikanan, Jakarta. hlm 20

Kurnia DR. 2010. Mycobacteriosis. http://drkurnia.wordpress.com/2010/

02/13/mycobacteriosis.html [6 Maret 2011].

Kori-Siakpere O, Ake JEG, Idoge E. 2005. Haematological characteristics of the

African Snakehead, Parachanna obscura. Departement of Zoology. Delta

State University, Abraka, Nigeria. Afican journal of biotechnology 4(6):

527-530.

Kwon CJ and Choon YH. 1996. Determination of formaldehyde residue &

histopathological observation in formalin and neutral formalin treated

Korean Rockfish (Sebastes schlegeli), Journal of fish Pathology 9(2): 157

– 168.

LaFrentz BR, Patra SL, Jones GR, Cain KD. 2004. Protective immunity in

rainbow trout Oncorhynchus mykiss following immunization with

distinct molecular mass fractions isolated from Flavobacterium

psychrophium. Disease of Aquatic Organism 59: 17-26.

Lagler KF, Bardach JE, RR miller, Passino DRM. 1977. Icthyology. John Willey

and Sons. Inc. London. hlm 56.

Liu Y and Bi Z. 2007. Potential use of a transposom Tn916-generated mutant of

Aeromonas hydrophila J-1 defective in some exoproducts as a live

attenuated vaccine. Journal of Veterinary medicine 78 : 79-84.

Lucky Z. 1977. Methods for the diagnosis of fish diseases. Hoffenana. G.L.

Amerind Publisih Co. Put. Ltd. New Delhi.

Minaka A, Sarjito, Hastuti S. 2012. Identifikasi agensia penyebab dan profil darah

ikan gurame (Osphronemus gouramy). Journal of Aquaculture

Management and Technology 1(1): 249-263.

Mulyani S. 2006. Gambaran darah ikan gurame (Osphronemus gouramy) yang

terinfeksi cendawan Achlya sp pada kepadatan 320 dan 720 spora pel ml

[Skripsi]. Bogor. Institut Pertanian Bogor.

Nabib R, Pasaribu FH. 1989. Patologi dan penyakit ikan. Departemen Pendidikan

dan Kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Pusat Antar

Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor.

Najiah M, Lee KL, Noorasikin H, Nadirah M, Lee SW. 2011. Phenotypic and

genotypic characteristics of Mycobacterium isolates from fighting fish

Betta spp in Malaysia. Journal Reseach in Veterinary Science 91: 342-

345.

Page 95: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

69

Nikoskelainen S et al. 2007. Multiple whole bacterial antigens in polyvalent

vaccine may result in inhibition of specific responses in rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss). Fish and Shellfish Immunology 22: 206-217.

Nitimulyo KH, Isnansetyo A, Triyanto, Murdjani M, Sholichah L. 2005.

Effetiveness of polyvalen vaccine to control vibriosis in Humback

Grouper (Cromileptes altivelis). Journal Of Fisheries Sciences 2(7) : 16-

21.

Noga EJ. 1997. Fish Disease : Diagnosis and treatment. Mosby Electronic

Publishing Co.Missouri. hlm 367

Press CM, Evensen O. 1999. The morphology of the immune system in teleost

fishes. Fish and Shellfish Immunology 9: 309-18.

Purwaningsih U, A.M Lusiastuti dan Taukhid. 2009. Studi patologi – anatomi

penyakit Mycobacteriosis pada ikan gurami (Ospronemus gouramy).

Prosiding Forum inovasi Teknologi Akuakultur. Hal 1139 – 1142.

Purwaningsih U, AM Lusiastuti dan Taukhid. 2012. Pengembangan berbagai jenis

sediaan vaksin M. fortuitum untuk mencegah penyakit Mycobacteriosis

pada gurame (Osphronemus gouramy). Seminar Hasil Riset 2012. Balai

Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar.

Purwaningsih U dan AM Lusiastuti. 2012. Insidensi ko-infeksi penyakit

Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia (MAS) pada

budidaya ikan gurame. Unpublised paper.

Purwoko T. 2007. Fisiologi mikroba. PT Bumi Aksara. Edisi 1. hlm 285.

Rajeswari S, Shome BR, Ram N. 1999. Study of virulence factors of Aeromonas

hydrophila isolates causing acute abdominal dropsy and ulcerative

diseases in Indian major carps. Indian J. Fish., 46(2) : 133-140

Robbins LS, Kumar V. 1995. Buku Ajar Patologi, Edisi-4, alih bahasa: Staff Pengajar Laboratorium Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran

Airlangga, C.V EGC, Jakarta: 69.

Ronning DR et al., 2000. Crystal structure of the secreted form of antigen 85 kDa

reveals potential targets for mycobacterial drugs and vaccines. Nat.

Struct. Biol. 7(2):141-146.

Rukmono D. 2010. Deteksi cepat dan akurat penyakit Mycobacteriosis pada ikan

gurame (Osphronemus gouramy) melalui metode PCR (polymerase chain

reaction) [disertasi]. Yogyakarta. Sekolah Pascasarjana Universitas

Gadjah Mada.

Page 96: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

70

Sakai M, Soliman MK, Yoshida T, Kobayashi M. 1993. Identification of

pathogenic fish bacteria using APIZYM system. Cand. J. Fish Sci. 50:

1137-1141.

Saraswati TR, Indraswati, Nurani. 2009. Pengaruh formalin, diazepam dan

minuman beralkohol terhadap konsumsi pakan, minum dan bobot tubuh

Mus musculus. Jurnal Sains dan Matematika 17(3): 141-144.

Sastradipraja D, et al. 1989. Penuntun Praktikum Fisiologi Veteriner. Depdikbud.

Dirjen pendidikan Tinggi. PAU. Ilmu Hayati. IPb. Hlm 329.

Satchell GH. 1991. Physiology and Form of Fish Circulation. Cambridge

University Press. Hlm 235.

Shieh HS. 1987. Protection of Atlantic salmon against motile aeromonad

septicaemia with Aeromonas hydrophila protease. Microbios Letters 36:

133 – 138.

Shotts EB, Rimler R. 1973. Medium for the isolation of Aeromonas hydrophila.

Journal of Applied Microbiology 26: 550-553.

Silva BC et al. 2009. Hematological and immunological responsses of Nile

Tilapia after polyvalent vaccine by different routes1. Pesq. Vet. Bras.

29(11): 874-880.

Sirirat T, Intuseth J, Chanphong J, Thompson K. 1999. Characterization of

Aeromonas hydrophila extracellular products with reference to toxicity,

virulence, profil protein and antigenicity. Asian Fisheries Science 12: 371

– 379.

Skinner LA, Schulte PM, Balfry SK, McKinley RS, LaPatra SE. 2010. The

association between metabolic rate, immune parameters, and growth

performance of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum),

following the injection of DNA vaccine alone and concurrently with a

polyvalent, oil-adjuvanted vaccine. Fish & Shellfish Immunology 28: 387

– 393.

Smith HA, Jones TC. 1961. Veterinary Pathology, Lea and Febingeer,

Philadelpia. pp. 884.

Stuart M. 1999. Immunology Spring 1999. Department of Mycrobiology/

Immunology. Kirkville College of Osteopathic Medicine.

http://www.kcom.cdu/faculty/chamberlain/msimn [2 Juni 2013]

Sugiani D, Komarudin O, Wadjdi EF, Mikadarullah, Wibawa BM. 2010.

Efektifitas aplikasi rendaman ulang sediaan produk vaksin Hydrovac.

Cibinong: Seminar Nasional Ikan VI & Kongres Masyarakat Ikhtiologi

Indonesia III. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, 08-

09 Jun 2010.

Page 97: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

71

Sugiani D. 2012. Vaksin bivalen untuk pencegahan penyakit Motile Aeromonas

Septicemia dan Streptococcosis pada ikan nila (Oreochromis niloticus)

[disertasi]. Bogor. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Svobodova Z, Vykusova B. 1991. Diagnostic, Prevention and Therapy of Fish

Diseases and Intoxication. Reseach Institut of Fish Culture and

Hydrobiology Vodnany. Czechoslovakia. http://www.fao.org/docrep

/field/003/AC160E/AC160E00.htm. [12 Juni 2013].

Takayama K, et al., 2005. Pathway to synthesis and processing of mycolic acids

in Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 18(1):81-101.

Talaat AM, Trucksis M, Kane AS, Reimshuessel R. 1999. Pathogenicity of

Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium smegmatis to goldfish,

Carrasius auratus. Journal of Veterinary microbiologi 66 : 151-164.

Tappin RA. 2007. Mycobacteriosis in rainbowfish, (online), (http://PetClub UK-

Mycobacteriosis in rainbowfish.htm, diakses 9 Maret 2010.

Thomson RG. 1978. General Veterinary Pathology, W.B Sounders Company,

Philadelphia, London, Toronto. pp. 102.

Thune RL, Plumb JA. 1982. Effect of delivery method and antigen preparation on

the production of antibodies against Aeromonas hydrophila in channel

catfish. Progressive Fish-Culturist 44: 53 - 54.

Toranzo AE, Santos TB, Nieto, Barja JL. 1986. Evaluation of different assay

systems of environmental Aeromonas strains. Appl. Environ.

Microbiology 51: 652-656.

Toranzo AE, Romalde JL, Magarinos B, Barja JL. 2009. Present and future of

aquaculture vaccines against fish bacterial diseases. The use of veterinary

drugs and vaccines in Mediterranean aquaculture. Options

Mediterraneennes A 86: 155 – 176.

Vivas J, Riano J, Carracedo B, Razquin BE, Fierro PL, Naharri G, Villena AJ.

2004. The auxotrophic aroA mutant of Aeromonas hydrophila as a live

attenuated vaccine against A. salmonicida infections in rainbow trout

(Oncorhrynchus mykiss). Journal of Fish and Shellfish Immunology 16:

193-206.

Vivas J, Razquin B, Lopez-Fierro P, Villena AJ. 2005. Modulation of the

immune responsse to an Aeromonas hydrophila aroA live vaccine in

rainbow trout: effect of culture media on the humoral immune responsse

and complement consumption. Fish and Shellfish Immunology 18: 223-

233.

Page 98: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

72

Wedenmeyer GA, Yasutake WT. 1977. Clinical methods for the assessment of the

effect on environmental stress on fish health. Technical Papers of the U.S.

Fish and Wildlife Service. US depert. of the Interior. Fish and Wildlife

Service 89:1-17.

Yang D, Lin TS, Liu FG. 2005. Studies on the formalin toxicity and formaldehyde

residues in common carp (Cyprinus carpio). Korean Journal of toxicology

13(1): 25-30.

Zhang J, Zou W, Yan Q. 2008. Non-Specific immune responsse of Bullfrog Rana

catesbeiana to intraperitoneal injection of bacterium Aeromonas

hydrophila. Chinesse Journal of Oceanology and Limnology 26(3): 248-

255.

.

Page 99: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

73

LAMPIRAN 1 Karakteristik Morfologi, Fisik dan Biokimia Bakteri M.

fortuitum

Tabel 1. Karakteristik bakteri M. fortuitum pada ikan menurut Najiah et al.

(2011) Karakteristik Hasil karakteristik Hasil

Morfologi Uji Biokimia

Batang sedang (3-6µ) + Aktivitas enzim

Batang pendek (kurang dari 2µ) + Arylsulfatase (3 hari) +

Koloni penuh + Arylsulfatase (14 hari) +

Photochromogenik - Tween hydrolisis (7 hari) -

Scotochromogenik - Tween hydrolisis (14 hari) +

Nonphotochromogenik + Reduksi nitrat (6 jam) +

Fisiologi Reduksi nitrat (24 jam) +

Tingkat pertumbuhan Cepat tumbuh Reduksi tellurit (3 hari) +

Tumbuh pada 28°C + Reduksi tellurit (9 hari) +

Tumbuh pada 37°C + Katalase setelah 68°C +

Tumbuh pada 42°C - Katalase +

Tumbuh pada 45°C - Urease -

Tumbuh pada 52°C - Iron uptake +

Tumbuh pada media Ogawa + Pemanfaatan karbohidrat sebagai

satu-satunya sumber karbon

(nitrogen amoniak)

Tumbuh pada media Lowenstain Jenssen + Acetat +

Tumbuh pada media Sauton Agar + Suksinat +

Tumbuh pada TSA + Piruvat +

Tumbuh pada BHI + Glukosa +

Tumbuh pada NA + Fruktosa +

Tumbuh pada Middlebrook 7H10 + Sukrosa +

Tumbuh pada media Baird Parker Agar + Ethanol -

Tumbuh pada Agar darah + 2-propanol -

Tumbuh pada media MacConkey tanpa

kristal violet

+ Pemanfaatan karbohidrat sebagai

satu-satunya sumber karbon

(nitrogen glutamat)

Tumbuh pada media TCBS + Glukosa +

Tumbuh pada media EMB + Asetat +

Tumbuh pada NaCl 3% + Suksinat +

Tumbuh pada NaCl 5% + Piruvat +

Tumbuh pada Tween 80 1% + Pemanfaatan senyawa nitrogen

sebagai satu-satunya sumber

nitrogen

Tumbuh pada p-nitrobenzoic acid + L-serin +

Tumbuh pada NH2OH.HCl (125 µg/ml) + Urea +

Tumbuh pada NH2OH.HCl (250 µg/ml) + Nitrat +

Tumbuh pada NH2OH.HCl (500 µg/ml) + Nitrit +

Tumbuh pada pH 6 + Pembentukan asam

Tumbuh pada pH 8 + Glukosa +

Toleran pada 0,1% picrid acid - D-mannosa +

Toleran pada 0,2% picrid acid + D-galaktosa -

Toleran pada 0,1% NaNO2 + L-arabinosa +

Toleran pada 0,2% NaNO2 + D-xylosa -

Toleran pada 0,01% malachite green + L-rhamnosa -

Toleran pada 0,01% kristal violet + Trehalosa +

Toleran pada 0,1% phenol red + Inositol -

Toleran pada 0,1% iodin + Mannitol +

Sorbitol -

Page 100: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

74

LAMPIRAN 2 Pengujian Kadar Formalin dengan Metode AOAC (1990)

Pengujian ini menggunakan beberapa tahapan proses penetapan seperti pembuatan

larutan baku formalin, penetapan formalin dan penghitungan kadar formalin.

a. Pembuatan larutan baku formalin 100 g/mL

1. Larutan formaldehyde 37% bj 1,08 kg/L dipipet 5 ml dan dilarutkan

dengan akuades dalam labu takar 100 ml (larutan a)

2. Larutan a dipipet 5 mL dan diencerkan kembali dengan akuades dalam

labu takar 100 mL (larutan b)

3. Larutan b sebanyak 25 mL diencerkan kembali dengan akuades dalam

labu takar 100 mL (larutan c). Larutan ini mengandung 100 g/mL

(ppm)

4. Pereaksi Nash : dilarutkan 150 g amonium asetat, 3 mL asam asetat

dan 2 mL asetilaseton dalam akuades, ditepatkan sampai volume 1 liter

b. Penetapan formalin

1. Contoh ditimbang dengan teliti 10 g, dimasukkan kedalam erlenmeyer

dan ditambah akuades, kemudian disuling

2. Hasil sulingan ditampung dalam labu takar 100 mL dan diencerkan

dengan akuades sampai garis penanda

3. Hasil sulingan dipipet 1 mL, dimasukkan kedalam tabung reaksi dan

ditambahkan 1 mL akuades dan 2 ml pereaksi nash dan dipanaskan

pada penangas air suhu 37 oC untuk membentuk warna

4. OD ditentukan dengan spektrofotometer pada 415 nm. Dilakukan

pengerjaan pada no 3 dan pembacaan yang sama untuk larutan standar

4, 8, 12, 16, dan 20 ppm dan akuades sebagai blanko.

c. Penghitungan kadar formalin

Kadar formalin (ppm)

Keterangan :

Ca : Mikrogram formalin dari kurva

W : berat contoh (gram)

F : faktor pengenceran

Page 101: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

75

LAMPIRAN 3 Tahapan Pewarnaan Silver Hasil SDS-PAGE

Larutan fiksasi 250 mL : metanol 125 mL+asam asetik 25

mL+formalin 0,125 mL+99,85 mL

H2O

Larutan pencuci 250 mL : etanol 87,5 mL+162,5 mL H2O

Enhancer/sensitisasi 250 mL : Na2S2O3 0,05 g+H2O 250 mL

Staining 50 mL (fresh) : AgNO3 0,1 g+formalin 38 L+

H2O 49-50 mL

Developer 50 mL (fresh) : Na2CO3 3 g+formalin 25 L+H2O

50 mL

Stopper 250 mL : metanol 125 mL+asam asetat 25

mL+H2O 100 mL

Silver staining (Metoda Vorum)

Larutan fiksasi, 2 jam agitasi perlahan-lahan

Etanol 35%, 20 menit (3x)

Enhancer/sensitisasi, 2 menit

ddH2O, 5 menit (3x)

larutan staining 20 menit. Dingin (dalam refrigerator)

ddH2O, 20 menit (2x)

developer sampai pita muncul

stop dengan larutan fiksasi

cuci dengan ddH2O (2x)

packing dan scanning

simpan dalam 1% asam asetet 4oC

Page 102: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

76

LAMPIRAN 4 Berat Protein Vaksin

Tabel Berat protein sediaan vaksin monovalen M. fortuitum dan A. hydrophila

yang diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3%

Gambar Kurva standar protein

y = 0.001x + 0.0359

R² = 0.9859

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 200 400 600 800

Ab

sorb

an

si 5

95 n

m

Konsentrasi BSA ugram/ml

Kode

Sampel

Absorbansi 595 nm pada

Sampel

Absorbansi 595 nm pada

Blanko S - B a b

Konsentrasi

Protein

Ulangan

1

Ulangan

2

Rataan Ulangan

1

Ulangan

2

Rataan

ppm g/mL

A.

hydrophila 0,435 0,425 0,43 0,35 0,359 0,3545 0,0755 0,001 0,035 40,5 0,00081

M.

fortuitum 0,823 0,827 0,825 0,35 0,359 0,3545 0,4705 0,001 0,035 435,5 0,00871

Page 103: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

77

LAMPIRAN 5 Hasil SDS-PAGE Protein Vaksin

Tabel Karakter protein hasil SDS-PAGE vaksin koktail M. fortuitum dan A.

hydrophila yang diinaktifasi dengan neutral buffer formalin 3%

Sampel No Jarak Rf Log BM BM(kDa)

koktail 25Mf:75Ah a 4,5 0,284810127 2,014803275 103,4673379

b 5,4 0,341772152 1,923047436 83,76207661

c 6,5 0,411392405 1,810901409 64,69957224

d 8 0,506329114 1,65797501 45,49618799

e 10,1 0,639240506 1,44387805 27,78932836

koktail 50Mf:50Ah a 3,7 0,234177215 2,096364022 124,8429499

b 4,5 0,284810127 2,014803275 103,4673379

c 5,4 0,341772152 1,923047436 83,76207661

d 6,5 0,411392405 1,810901409 64,69957224

e 7,3 0,462025316 1,729340663 53,62171042

f 7,5 0,474683544 1,708950476 51,16234905

g 9 0,569620253 1,556024077 35,97692798

h 10,1 0,639240506 1,44387805 27,78932836

i 11 0,696202532 1,352122211 22,4968758

j 12,3 0,778481013 1,219585998 16,58005617

koktail 75Mf:25Ah a 3,7 0,234177215 2,096364022 124,8429499

b 4,5 0,284810127 2,014803275 103,4673379

c 5,4 0,341772152 1,923047436 83,76207661

d 6 0,379746835 1,861876876 72,75735055

e 7,3 0,462025316 1,729340663 53,62171042

f 8,1 0,512658228 1,647779916 44,44060028

g 9 0,569620253 1,556024077 35,97692798

h 10,1 0,639240506 1,44387805 27,78932836

i 12,3 0,778481013 1,219585998 16,58005617

Page 104: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

78

LAMPIRAN 6 Persentase dan Indek Fagositosis

Tabel Persentase fagositosis (%)

Tabel Indek fagositik (%)

Perlakuan vaksin Pengamatan mgg ke -

1 2 3

koktail 25Mf:75Ah 1,75 1,7 1,8

koktail 50Mf:50Ah 2,1 1,85 2

koktail 75Mf:25Ah 1,95 1,25 1,9

mono A. hydrophila 1,75 1,45 1,6

mono M. fortuitum 1,8 1,4 1,6

kontrol 1,25 1,45 1,4

Perlakuan vaksin Pengamatan mgg ke -

1 2 3

koktail 25Mf:75Ah 32 38,5 35,5

koktail 50Mf:50Ah 37,5 34 45

koktail 75Mf:25Ah 34,5 32 35,5

mono A. hydrophila 37 28,5 36

mono M. fortuitum 35,5 29 32

kontrol 36 38,5 40,5

Page 105: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

79

LAMPIRAN 7 Nilai NBT-Assay

Tabel Uji aktifitas Respiratory burst (NBT-Assay)

Perlakuan vaksin Pengamatan mgg ke -

1 2 3

koktail 25Mf:75Ah 0,2165 0,262 0,3495

koktail 50Mf:50Ah 0,38 0,3995 0,433

koktail 75Mf:25Ah 0,248 0,319 0,4135

mono A. hydrophila 0,4785 0,4265 0,5265

mono M. fortuitum 0,3235 0,346 0,3885

kontrol 0,2515 0,234 0,2905

Page 106: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

80

LAMPIRAN 8 Aktifitas Komplemen

Tabel Aktifitas komplemen minggu ke-1

Perlakuan vaksin Pengenceran

1x 2x 4x 8x 16x 32x

koktail 25 Mf :75 Ah 81,4966 49,2517 19,0476 8,70748 2,85714 0

koktail 50 Mf : 50 Ah 80 35,9184 12,9252 5,71429 3,53741 0

koktail 75Mf : 25 Mf 82,7211 48,5714 19,5918 8,70748 2,85714 0

Monovalen Ah 76,8707 31,9728 9,93197 2,85714 0 0

Monovalen Mf 75,9184 44,7619 14,5578 2,85714 2,44898 0

Kontrol 102,449 51,0204 24,7619 8,43537 2,85714 0

Tabel Aktifitas komplemen minggu ke-2

Perlakuan vaksin Pengenceran

1x 2x 4x 8x 16x 32x

koktail 25 Mf :75 Ah 78,2313 37,415 13,1973 2,85714 0 0

koktail 50 Mf : 50 Ah 68,4354 25,5782 4,62585 2,85714 0 0

koktail 75Mf : 25 Mf 77,2789 34,5578 23,5374 3,12925 1,08844 0

Monovalen Ah 62,8571 22,7211 6,2585 2,72109 0 0

Monovalen Mf 75,3741 35,9184 20,6803 7,21088 1,4966 0

Kontrol 102,857 40,4082 22,8571 6,2585 2,85714 0

Tabel Aktifitas komplemen minggu ke-3

Perlakuan vaksin Pengenceran

1x 2x 4x 8x 16x 32x

koktail 25 Mf :75 Ah 63,8095 32,1088 4,35374 0 0 0

koktail 50 Mf : 50 Ah 57,6871 28,0272 2,85714 0 0 0

koktail 75Mf : 25 Mf 61,9048 31,1565 10,3401 2,85714 0 0

Monovalen Ah 56,7347 27,0748 9,2517 3,53741 0 0

Monovalen Mf 72,7891 43,2653 12,6531 4,4898 1,4966 0

Kontrol 99,7279 45,8503 15,3741 7,21088 2,85714 1,4966

Page 107: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

81

LAMPIRAN 9 Titer Antibodi

Tabel Titer antibodi perlakuan vaksin terhadap A. hydrophila (log 2)

Perlakuan vaksin

masa induksi vaksin mgg ke

-

Masa uji tantang hari

ke -

1 2 3 3 7 14

koktail 25 Mf:75 Ah 1 2 5 5 4 5

koktail 50 Mf: 50 Ah 1 2 5 4 5 5

koktail 75Mf:25 Ah 1 5 5 4 5 6

Monovalen Ah 2 2 7 7 5 8

Monovalen Mf 1 2 3 2 3 4

Kontrol 1 1 1 1 1 1

Tabel Titer antibodi perlakuan vaksin terhadap M. fortuitum (log 2)

Perlakuan vaksin masa induksi vaksin mgg ke - Masa uji tantang mgg ke -

1 2 3 4 5 6 7

koktail 25 Mf:75 Ah 2 5 5 4 5 5 5

koktail 50 Mf: 50 Ah 2 3 4 2 5 6 6

koktail 75Mf:25 Ah 2 5 4 3 5 6 6

Monovalen Ah 1 1 1 1 2 3 2

Monovalen Mf 4 5 5 3 5 6 6

Kontrol 1 1 1 1 2 2 1

Tabel Titer antibodi perlakuan vaksin terhadap A. hydrophila dan M. fortuitum

(log 2)

Perlakuan vaksin masa induksi vaksin mgg ke - Masa uji tantang mgg ke -

1 2 3 4 5 6 7

koktail 25 Mf:75 Ah 7 8 8 7 8 8 6

koktail 50 Mf: 50 Ah 7 8 8 4 9 8 6

koktail 75Mf:25 Ah 7 6 7 6 7 7 6

Monovalen Ah 2 6 8 5 6 6 5

Monovalen Mf 6 6 5 2 6 7 4

Kontrol 1 1 2 1 2 3 1

Page 108: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

82

LAMPIRAN 10 Relative Percent Survival (RPS)

Tabel nilai RPS perlakuan vaksin monovalen dan koktail

No Perlakuan

Komponen

uji tantang

% kematian

ikan yang

divaksin

% kematian

ikan kontrol

a/b (1-c) x 100 RPS

(a) (b) (c)

1

koktail

25Mf:75Ah A. hydrophila 16,667 43,33 0,3846527 61,5347 61,5347

2

koktail

50Mf:50Ah A. hydrophila 16,67 43,33 0,3847219 61,5278 61,5278

3

koktail

75Mf:25Ah A. hydrophila 20 43,33 0,461574 53,8426 53,8426

4

mono A.

hydrophila A. hydrophila 3,33 43,33 0,0768521 92,3148 92,3148

5

mono M.

fortuitum A. hydrophila 30 43,33 0,692361 30,7600 30,7600

6

koktail

25Mf:75Ah M. fortuitum 33,33333333 46,66666667 0,7142857 28,571429 28,571429

7

koktail

50Mf:50Ah M. fortuitum 20 46,66666667 0,4285714 57,142857 57,142857

8

koktail

75Mf:25Ah M. fortuitum 20 46,66666667 0,4285714 57,142857 57,142857

9

mono A.

hydrophila M. fortuitum 26,66666667 46,66666667 0,5714286 42,857143 42,857143

10

mono M.

fortuitum M. fortuitum 10 46,66666667 0,2142857 78,571429 78,571429

11

koktail

25Mf:75Ah ko-infeksi 46,6667 76,6670 0,608693 39,130699 39,130699

12

koktail

50Mf:50Ah ko-infeksi 46,6670 76,6670 0,6086974 39,130265 39,130265

13

koktail

75Mf:25Ah ko-infeksi 53,3333 76,6670 0,6956491 30,435085 30,435085

14

mono A.

hydrophila ko-infeksi 56,6667 76,6670 0,7391272 26,087278 26,087278

15

mono M.

fortuitum ko-infeksi 63,3333 76,6670 0,8260829 17,391707 17,391707

Page 109: VAKSIN KOKTAIL SEL UTUH UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT ... · pada permukaan tubuh, ... Patologi anatomi . ... diukur dari beberapa parameter imunologi untuk mengetahui keamanan dan level

83

LAMPIRAN 11 Komposisi Kandungan Media

Brain Heart Infussion (BHI) Oxoid : 37 g/L

- Brain infussion solid : 12,5 g

- Beef heart infussion solid : 5,0 g

- Protease peptone : 10,0 g

- Glucose : 2,0 g

- Sodium chloride : 5,0 g

- Di-sodium phosphate : 2,5 g

Sauton Broth

- Glycerol : 50 ml

- Sodium glutamat : 4 g

- Kalium dihidrogen posphat : 0,5 g

- Magnesium sulfat : 0,5 g

- Sodium citrat : 2 g

- Ferric Amonium citrat : 0,05 g

- Akuades : 950 ml