Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoidesdigilib.its.ac.id/public/ITS-Undergraduate-15282-Presentation... · dibuat grafik regresi linier antara log konsentrasi sampel

Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides

Terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Secara In Vitro

SIDANG TUGAS AKHIR

Hani Tenia Fadjri 1506 100 017

DOSEN PEMBIMBING:

Awik Puji Dyah Nurhayati, S.si, M.Si Prof. Dr. Drs. Sukardiman. Apt. M.Sc.

Latar Belakang

Tiga besar kanker yang melanda wanita Indonesia:

Kanker serviks, Kanker payudara, Kanker colon

(Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002 dalam

Heti, 2008)

Existing condition of antineoplastik:

Kemoterapi: menimbulkan efek samping

Pembedahan : tidak dapat dilakukan jika telah metastesis

Alternatif: Herbal Spons Menghasilkan Metabolit Sekunder

Aaptos suberitoides berpotensi sebagai obat antikanker

aaptamin

(Nurhayati et al, 2008).

Aaptamin (alkaloid)

berpotensi sebagai obat anti

kanker

Uji in vivo Brine Shrimp Lethality Test (BST)

LC50 sebesar 134 ± 36.6 ppm (Nurhayati et al., 2008).

Uji Sitotoksisitas

Potensi Sitotoksik ekstrak spons laut

A. suberitoides.

Coutinho, 2002; Tsukamoto, 2010

Mengetahui aktivitas

Aaptos suberitoides

dalam menghambat

pertumbuhan sel-sel

kanker

BST

(Studi pendahuluan)

Aaptos suberitoides

memiliki senyawa

bioaktif paling potensial

untuk antikanker dengan

nilai LC50 134.1362 ±

36.6114 ppm

Bagaimana mengukur

kemampuan ekstrak

spons Aaptos suberitoides

dalam menghambat

pertumbuhan sel kanker

HeLa

Sitotoksisitas in

vivo

Sitotoksisitas in

vitro

??

Permasalahan

Uji apoptosis sel jumlah sel hidup dan sel yang mengalami apoptosis dimana sel

hidup tampak berwarna hijau sedangkan sel yang mengalami

apoptosis berwarna orange

Manfaat

Sebagai dasar pengembangan dalam upaya pemanfaatan sumber daya hayati laut di Jawa Timur

Sebagai produk farmasi untuk

dasar pengembangan obat antikanker

baru

untuk melakukan evaluasi in vitro toksisitas ekstrak spons laut Aaptosis suberitoides terhadap pertumbuhan

sel kanker serviks (HeLa)

Skema Kerja

4

3

2

1

Pembuatan Medium Kultur (Penumbuh) RPMI 1640

Penentuan Konsentrasi Eksrtrak spons dan cisplatin

Propagasi Sel HeLa

Pemanenan Sel Kanker

Doubling

Time

Uji Sitotoksisitas MTT

Tabel Hasil uji sitotoksisitas ekstrak terhadap sel kanker menggunakan metode MTT

Konsentrasi sampel

(µg/mL) ABSORBANSI

TOTAL RERATA (C ) A-B C-B % mati 1 2 3

7.5 1.092 1.111 1.139 3.342 1.114 0.864 0.709 17.940 15 1.105 1.149 1.085 3.339 1.113 0.708 18.056 30 1.150 1.097 1.071 3.318 1.106 0.701 18.866 60 1.120 1.073 1.064 3.257 1.086 0.681 21.219 120 1.036 1.054 1.021 3.111 1.037 0.632 26.852 240 0.959 1.033 0.926 2.918 0.973 0.568 34.298 480 0.744 0.802 0.755 2.301 0.767 0.362 58.102 960 0.432 0.432 0.433 1.297 0.432 0.027 96.836 1440 0.423 0.431 0.430 1.284 0.428 0.023 97.338 1920 0.502 0.46 0.495 1.457 0.486 0.081 90.664

K.SEL (A) 1.299 1.264 1.244 3.807 1.269

K.MEDIA (B) 0.407 0.405 0.402 1.214 0.405

Tabel Hasil uji sitotoksisitas Cisplatin terhadap

sel kanker menggunakan metode MTT

Konsentrasi

Cisplatin

(µg/mL)

Absorbansi Total Rerata

(C ) A-B C-B % Mati 1 2 3

2 1.254 1.173 1.18 3.607 1.202 1.056 0.915 13.321

4 1.17 1.135 1.107 3.412 1.137 0.850 19.476

8 1.071 1.09 1.036 3.197 1.066 0.779 26.263

16 0.687 0.688 0.654 2.029 0.676 0.389 63.131

K.SEL (A) 1.374 1.335 1.321 4.03 1.343

K.MEDIA (B) 0.264 0.288 0.31 0.862 0.287

Hasil uji doubling time dengan perlakuan ekstrak spons A. suberitoides terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi

Waktu

Inkubasi

(Jam)

Konsentrasi sampel

(µg/mL)

Absorbansi Total Rerata

(C ) A-B C-B % Hidup 1 2 3

24

134 0.823 0.819 0.846 2.488 0.829 0.954 0.501 52.551 67 0.841 0.879 0.852 2.572 0.857 0.529 55.486

33.5 0.953 0.930 0.892 2.775 0.925 0.597 62.579 K.SEL (A) 1.244 1.289 1.313 3.846 1.282

K.MEDIA (B) 0.328 0.329 0.327 0.984 0.328

48

134 0.769 0.725 0.736 2.230 0.743 1.019 0.390 38.306 67 0.924 0.869 0.871 2.664 0.888 0.535 52.502

33.5 0.926 0.888 0.934 2.748 0.916 0.563 55.250 K.SEL (A) 1.346 1.372 1.397 4.115 1.372

K.MEDIA (B) 0.352 0.356 0.350 1.058 0.353

72

134 0.819 0.800 0.814 2.433 0.811 1.128 0.413 36.613 67 0.991 0.990 0.972 2.953 0.984 0.586 51.980

33.5 1.008 0.999 0.965 2.972 0.991 0.593 52.541 K.SEL (A) 1.539 1.524 1.515 4.578 1.526

K.MEDIA (B) 0.394 0.390 0.410 1.194 0.398

Hasil uji doubling time dengan perlakuan cisplatin terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi

Waktu Inkubasi (jam) Konsentrasi

sampel (µg/mL) ABSORBANSI

TOTAL RERATA

(C ) A-B C-B % hidup 1 2 3

24

13.062 0.923 0.883 0.900 2.706 0.902 0.958 0.484 50.522 6.531 0.954 0.927 0.896 2.777 0.926 0.508 52.992

3.2655 0.960 0.917 0.916 2.793 0.931 0.513 53.549 K.SEL (A) 1.378 1.333 1.416 4.127 1.376

K.MEDIA (B) 0.399 0.409 0.446 1.254 0.418

48

13.062 0.852 0.813 0.836 2.501 0.834 0.991 0.497 50.118 6.531 0.890 0.798 0.805 2.493 0.831 0.494 49.849

3.2655 0.837 0.843 0.839 2.519 0.840 0.503 50.723 K.SEL (A) 1.33 1.33 1.323 3.983 1.328

K.MEDIA (B) 0.335 0.329 0.346 1.010 0.337

72

13.062 0.786 0.721 0.682 2.189 0.730 1.052 0.395 37.516 6.531 0.894 0.806 0.855 2.555 0.852 0.517 49.113

3.2655 0.959 0.822 0.832 2.613 0.871 0.536 50.951 K.SEL (A) 1.391 1.393 1.377 4.161 1.387

K.MEDIA (B) 0.33 0.328 0.347 1.005 0.335

Hasil uji doubling time dengan perlakuan DMSO terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi

Waktu

Inkubasi (jam) Persentase DMSO

(%) Absorbansi

TOTAL RERATA

(C ) A-B C-B % hidup 1 2 3

24

0.067 1.269 1.33 1.315 3.914 1.305 0.958 0.887 92.554 0.033 1.294 1.279 1.332 3.905 1.302 0.884 92.241 0.017 1.356 1.324 1.367 4.047 1.349 0.931 97.182

K.SEL (A) 1.378 1.333 1.416 4.127 1.376 K.MEDIA (B) 0.446 0.409 0.399 1.254 0.418

48

0.067 1.217 1.244 1.291 3.752 1.251 0.960 0.914 0.952 0.033 1.241 1.238 1.301 3.780 1.260 0.923 0.961 0.017 1.241 1.278 1.337 3.856 1.285 0.948 0.988

K.SEL (A) 1.293 1.275 1.323 3.891 1.297 K.MEDIA (B) 0.335 0.329 0.346 1.010 0.337

72

0.067 1.255 1.251 1.302 3.808 1.269 1.052 0.934 88.815 0.033 1.303 1.292 1.283 3.878 1.293 0.958 91.033 0.017 1.362 1.381 1.364 4.107 1.369 1.034 98.289

K.SEL (A) 1.391 1.393 1.377 4.161 1.387 K.MEDIA (B) 0.33 0.328 0.347 1.005 0.335

HASIL PENELITIAN

Persentase kematian sel HeLa kemudian dikonversikan ke dalam table probit

dibuat grafik regresi linier antara log konsentrasi sampel uji dengan persen kematian sel, sehingga dapat dihitung LC50

Nilai LC50 pada uji sitotoksisitas dengan metode MTT adalah 133.968 µg/mL.

sesuai dengan pendapat Meyer et al., 1982 yang menyatakan bahwa suatu senyawa bersifat sitotoksik jika mempunyai LC50 lebih kecil dari 1000 µg/mL

kadar DMSO tidak akan berpengaruh terhadap persen kematian sel pada seri kadar yang lain di bawah ekstrak seri ke-8 yaitu dibawah kadar DMSO 0,475 %.

Sebagai kontrol positif digunakan Cisplatin. Cisplatin atau Cisplatinum atau cis diamminedichloroplatinum (II) adalah obat kemoterapi kanker yang berbasis logam platinum. Cisplatin merupakan pilihan pertama obat yang digunakan dalam terapi karsinome serviks (Rose, 2006).

Grafik Regresi Linier Nilai Probit Ekstrak dan Cisplatin

Sitotoksisitas Cisplatin terhadap Sel Hela

y = 1.734x + 3.065

R2 = 0.9242

0

1

2

3

4

5

6

0.0 0.5 1.0 1.5

log konsentrasi

pro

bit

HeLa

y = 1.2287x + 2.3877

R2 = 0.7825

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

log konsentrasi

pro

bit

cisplatin Ekstrak Spons A. suberitoides Perhitungan LC50 Y = 1,228x + 2,387 5 = 1,228x + 2,387 1.228x = 2,613 X = 2,12785 Antilog 2,12785 = 133,967 LC50 = 133,967 µg/mL

Perhitungan LC50 Y = 1,734x + 3,065 antilog 1,115917 = 5 = 1,734x + 3,065 LC50 = 13,062 µg/mL 1,734x = 1,935 x = 1,115917

Proses Pewarnaan Apoptosis

Integritas membran sel tetap utuh

Interaksi sel dengan ekstrak atau cisplatin selama inkubasi

Terwarnai oleh acridine orange (hijau)

acridine orange dengan gugus kationnya Mampu berinteraksi dengan DNA yang bersifat anionik

Sel hidup Sel mati

Membran sel tidak mampu ditembus oleh ethidium bromide Membran sel mampu ditembus oleh ethidium bromide

Terjadi penurunan integritas membran

Permeabilitas menurun Permeabilitas tetap utuh

Membentuk garam terdisosiasi

Hijau

Inti sel terwarnai

Sel nekrosis Sel apoptosis

Berwarna orange dan bentuk inti sel normal

Inti sel Berwarna orange Terfragmentasi dan

terkondensasi

Mekanisme Kerja Ekstrak Terhadap Sel Kanker

senyawa aaptamin yang terkandung dalam ekstrak di lingkungan sel

restriction point pada fase G1

Pada kanker serviks (sel HeLa) mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7.

E6 akan berikatan dengan p53 untuk mendegradasi p53 sehingga sel tidak mengalami apoptosis

Dengan Pemberian Ekstrak

Protein 21 tidak mengaktifasi kompleks cyclin D/cdk 4,6 sehingga mencegah fosforilasi protein Rb

E7 berikatan dengan pRb yang menyebabkan sel berproliferasi terus-menerus

menginduksi ekspresi dari protein p21 induksi ekspresi protein p21

menahan siklus sel fase G2/M

berperan seperti cyclin/ cdk inhibitor di bawah control gen p53 kerusakan DNA

Perbaikan DNA gen p53 memicu terjadinya apoptosis

Kesimpulan

• Nilai IC50 ekstrak spons A. suberitoides sebesar 153,006 µg/ml menunjukkan bahwa senyawa sebagai ini bersifat kurang toksik terhadap sel kanker HeLa

• Pada uji apoptosis diketahui bahwa ekstrak spons A.suberitoides dapat memacu apoptosis pada sel kanker HeLa