Thin Layer Chromatography.ppt

Thin Layer Chromatography 1

Thin Layer Chromatography

Henry K.S.,M.Si.,Apt.


Thin Layer Chromatography

TLC ?????


Metode TLC merupakan metode yang banyak digunakan untuk pemisahan dan identifikasi obat/zat

Penggunaan TLC:

Senyawa obat murni (uji kemurnian)

Hasil ekstraksi produk obat jadi

Senyawa2 yang tidak diperkenankan dalam sediaan (mis: bahan kimia dalam jamu)

Sampel biologis


Dibandingkan dengan HPLC dan GC, TLC memiliki keunggulan:SederhanaMurahDapat langsung digunakan tanpa menunggu waktu flushing/pemanasan (warm-up time)Preparasi sampel sederhana (tdk perlu clean up)Dapat digunakan untuk analisa beberapa sampel sekaligusFleksibilitas dalam pemilihan fase diam dan fase gerak Analit yang dipisahkan tidak hilang


Kekurangan TLC dibanding HPLC / GC:

Sensitivitas lebih rendah

Resolusi / pemisahan lebih rendah

HPTLC


Thin Layer Chromato-graphy / Kromatografi Lapis Tipis merupakan metode kromatografi / pemisahan di mana fase gerakfase gerak bergerak berdasarkan daya kapilaritas melalui fase fase diamdiam (adsorben) yang dilekatkan pada suatu lapisan tipis.


Mekanisme pemisahan

Pemisahan dipengaruhi:

Kelarutan analit

Harga pKa

Daya adsorpsi

Ikatan hidrogen

Polaritas

Molecular weight


Fase Diam

Plate TLC dapat terbuat dari:- Kaca- Aluminium- Plastik

Fase diam diikatkan pada plate TLC dengan menggunakan “binding agent” (mis: kalsium sulfat)


Fase diam:

Silica gel (silica gel G/GF254)

Alumina (aluminium oksida)

Kieselguhr

Magnesium silicate (florisil)

Pemisahan terjadi karena interaksi analit dengan permukaan fase diam

}


Fase diam lain:Cellulose mekanisme pemisah-an: partisi Reversed Phase plate silica yang ditambah dengan minyak atau parafin cairNormal PhaseResin Penukar IonImpregnated plate


Fase gerak

Fase gerak dapat berupa pelarut tunggal atau campuran dan bergantung pada zat yang akan dipisahkan dan fase diam yang digunakan.

Dapat pula ditambahkan larutan dapar untuk pemisahan senyawa berdasarkan pertukaran ion.


Syarat fase gerak

MurahMudah didapatStabil di udara luar, dalam campuran asam atau basaMudah dihilangkan dari plate setelah selesai proses eluasiTidak bereaksi dengan analit yang akan dipisahkan


Teknik pelaksanaan

Penyiapan plate

Penotolan sampel

Proses eluasi

Proses deteksi


Penyiapan plate


Penotolan sampel



Nanomat

Linomat


Automatic TLC Sampler


Proses eluasi


Pour solvent into the beaker to a depth of just less than 0.5 cm.

To aid in the saturation of the TLC chamber with solvent vapors, line part of the inside of the beaker with filter paper


Cover the beaker with a watch glass, swirl it gently, and allow it to stand while you prepare your TLC plate.


5’ 10’ drying


Deteksi


Metode deteksi

Destruktif (disemprot penampak noda)

(misal: asam sulfat, iodine, dragendorf, dll)


Non destruktif (dengan sinar tampak untuk zat berwarna dan sinar UV untuk zat tidak berwarna)


TLC Scanner (Densitometri)


Performance TLC

Mi g

rati

on d

ista

nce


Retardation Factor

Rf =Jarak migrasi sampel

Jarak migrasi pelarut pengembang

hRf = 100 Rf

Bgm kalau noda tidak bulat ?


Faktor yang mempengaruhi reprodusibilitas Rf

Fase diam

Fase gerak

Kejenuhan chamber

Suhu

Jarak eluasi

Jumlah sampel

Flow ConstantThe flow constant or velocity constant (K) is a measure

of the migration rate of the solvent front. It is an important parameter for TLC users and can be used to calculate,

The flow constant is given by the following equation:

K =ZF2/twhere

K= flow constant [mm2/s]

ZF = distance between the solvent front and the solvent level [mm]

t = development time [s]



Start line

Solvent level

ZF

Zo

The following example illustrates the usefulness of the flow constant in laboratory work. In a TLC, if the development time for a migration distance of 10 cm was 30 min and the Z0 distance is 5 mm, the K value is 6.125 mm2/s.

Question: How much time is required to develop a 15-cm migration distance if the sorbent,solvent system, Z0 and laboratory temperature remain constant?



Faktor retensi

k’ =1 – dR/dM

dR/dM

k’ =1 - Rf

Rf


Separation Number (SN)

Separation Number or Spot capacity, indicates the maximum number of spots that can be separated with Rs=1 over a given separation distance, between Rf = 0 and Rf = 1.


Z = The migration distance from the origin to the solvent frontb0 = width of spot with Rf = 0b1 = width of spot with Rf = 1Widths are measured at half height from a densitogram of a mixture of substances having different Rf values spread over the entire chromatogram

110

bb

ZSN


Aplikasi TLC

Preparatif

Kualitatif

Kuantitatif


TLC preparatif

Digunakan untuk isolasi komponen dari campuran agar dapat diperoleh senyawa murni.

Plate yang digunakan lebih tebal dibandingkan plate untuk analisis (Tebal: 0,5 – 2 mm; plate untuk analisis: 100 – 250 µm)

Jumlah sampel: 10 – 100 mg

Sampel ditotolkan dalam bentuk band


Kalau ditotol bentuk spot bagaimana?


Deteksi : harus dengan metode non destruktif

Hasil pemisahan di ambil dan diekstraksi untuk memisahkan analit dengan fase diam


High Performance Thin layer Chromatography (HPTLC)

Lebih cepat

Lebih reprodusibel

Lebih sensitif

Lebih akurat


Typical condition TLC HPTLC

Plate dimension (cm)

Particle size (µm)

Layer thickness (µm)

Sample volume (µl)

Spot (d) before running (mm)

Spot (d) after running (mm)

Running distance (cm)

Running time (min)

Number of sample/plate

Detection limit (absorption)(ng)

Detection limit (fluorescence)(ng)

Reproducibility of Rf values

Reproducibility of quantification

20x20

20

100-250

1-10

< 4

5-10

10-15

30-120

10-15

10-100

0.1-1

3%

5%

10x10

5

150-200

< 0.1

< 1.5

2-5

3-6

5-15

30-40

0.5-5

0.01-0.1

1%

2-3%


TLC 2 dimensi

Sol

vent

A

Solvent B


Uji Kualitatif

Berdasarkan harga RF

Butuh standar

Dikombinasi dengan spektrum UV, IR, MS atau NMR


Uji Kuantitatif

Hasil pemisahan diambil dan diekstraksi serta dianalisa dengan metode tertentu.

Dilakukan scanning dengan densito-meter (TLC Scanner)


TLC Scanner (Densitometer)

Butuh standar zat yang dianalisa

Untuk analisa kuantitatif dapat digunakan tinggi puncak atau luas area puncak


Latihan soal

1. Pada penetapan kadar campuran parasetamol dan ibuprofen dalam sampel, mula-mula ditimbang 100 mg sampel dan diekstraksi dengan 4 ml methanol sebanyak 2 kali. Hasil ekstraksi dimasukkan labu takar 10 ml dan ditambahkan methanol sampai garis tanda. Hasil ekstraksi ditotolkan sebanyak 2µl pada plate KLT dan dieluasi dengan fase gerak tertentu.


Hasil pemisahan diamati dengan densito-meter dan diperoleh data sbb: Luas area parasetamol = 2150, luas area ibuprofen = 725. Sebagai larutan baku dibuat campuran parasetamol dan ibuprofen dg konsentrasi tertentu dan ditotol 2 µl serta dieluasi dengan fase gerak yang sama dengan sampel, diperoleh hasil sebagai berikut:


Kons parac

(µg/ml)

Area parac Kons ibup

(µg/ml)

Area ibup

300 525 100 340

600 1045 200 695

900 1580 300 1025

1200 2140 400 1330

1500 2675 500 1690

Hitung kadar parasetamol dan ibuprofen dalam sampel !


2. Pada penetapan kadar zat X dalam sirup, mula-mula dipipet 5 ml sampel dan diekstraksi dengan 5 ml etil asetat, hasil ekstraksi dimasukkan labu takar dan di tambah etil asetat hingga tepat 5 ml. Dipipet 1 ml dan diencerkan hingga tepat 5 ml dengan etil asetat. Kemudian ditotolkan sebanyak 4 µl pada plate KLT dan dieluasi dengan fase gerak tertentu.


Hasil eluasi diamati dengan densitome-ter dan didapat luas area noda = 1045. Untuk larutan baku dibuat larutan zat x dalam etil asetat dengan konsentrasi 250 µg/ml dan ditotolkan pada plate KLT dengan volume tertentu, kemudian dieluasi dengan fase gerak tertentu dan diamati luas area nodanya dengan densitometer, diperoleh hasil sbb:


Volume totolan baku

(µl)

Luas Area

2 420

4 850

6 1275

8 1690

10 2125

Hitunglah kadar zat X dalam sampel !

Thin Layer Chromatography.ppt

Documents