Thesis Miftahul Ilmi 6304042034

1

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINOLITIK DARI BAKTERI

ASAL LIMBAH PENGOLAHAN UDANG

MIFTAHUL ILMI

6304042034

UNIVERSITAS INDONESIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

DEPARTEMEN BIOLOGI

DEPOK

2007

2

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINOLITIK DARI BAKTERI

ASAL LIMBAH PENGOLAHAN UDANG

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Magister Sains

Oleh:

MIFTAHUL ILMI

6304042034

UNIVERSITAS INDONESIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

DEPARTEMEN BIOLOGI

DEPOK

2007

3

JUDUL : ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINOLITIK

DARI BAKTERI ASAL LIMBAH PENGOLAHAN UDANG

NAMA : MIFTAHUL ILMI

NPM : 6304042034

MENYETUJUI

1. Komisi Pembimbing

Dr. Ekowati Chasanah Dr. Wibowo MangunwardoyoPembimbing I Pembimbing II

2. Penguji

Ariyanti Oetari, Ph.D. Dr. Amarila Malik, Apt., M.Si.Penguji I Penguji II

3. Ketua Program Studi Biologi 4. Ketua Program PascasarjanaFMIPA UI

Dr. Noviar Andayani, M.Sc. Dr. Adi Basukriadi, M.Sc

Tanggal lulus : 12 Juli 2007

i

Name : Miftahul Ilmi

Title : ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF CHITINOLYTIC

ENZYME FROM SHRIMP PROCESSING WASTE BACTERIA

Thesis supervisors: I. Dr. Ekowati Chasanah II. Dr. Wibowo Mangunwardoyo

SUMMARY

Chitinolytic enzyme is an enzyme which hydrolyzes chitin and release

N – acetylglucosamine (Patil et al. 2000). The roles of chitinolytic enzyme in

biocontroling pathogenic fungi and insects and producing single cell protein

and chitin oligosaccharide have been studied for several years (Patil et al.

2000; Huang et al. 2005; Sørbotten et al. 2005).

Bacteria have been recognized as chitinolytic enzyme producers, and

they have been studied intensively since many years ago. However, a large

number of species are as yet unexplored (Gohel et al. 2006). Chitinolytic

bacteria can be found in chitin-rich habitats; one of them is marine processing

waste, i.e. exoskeleton of shrimp and crab (Johnson 1931; Vogan et al.

2002). The waste contains more than 80,000 metric tons of chitin (Patil et al.

2000), hence it becomes a good habitat for chitinolytic bacteria. As one of

major producers of marine products, Indonesia also produces a great amount

of marine processing waste (Nasution et al. 2004). However, studies on such

habitat to isolate chitinolytic bacteria are rarely conducted. Therefore, it is

necessary to carry out the study in order to isolate Indonesian indigenous

ii

chitinolytic bacteria from marine processing waste, especially shrimp

processing waste.

This thesis is divided into two papers. First paper was entitled

“Isolation and Screening of Chitinolytic Bacteria from Shrimp

Processing Waste”. The purpose of this study was to isolate chitinolytic

bacteria from shrimp processing waste and to obtain optimum condition for

producing chitinolytic enzyme. The title of second paper was

“Characterization of Escherichia coli-inactive KPU 2.1.8 Chitinolytic

Enzyme from Shrimp Processing Waste”. The purpose of this study was

to investigate the effect of pH, temperature, and metal ions on the activity of

E. coli-inactive KPU 2.1.8 chitinolytic enzyme.

Samples were taken from shrimp processing plant and seafood

restaurant in Jakarta. Direct isolation method was carried out according to

Hunter-Cevera et al. (1989) on agar medium containing colloidal chitin and

resulted in 106 chitinolytic bacteria isolates. Screening of the obtained

isolates for chitinolytic activity was done by evaluating Chitinolytic Index using

method developed by Cody in 1989 (Gohel et al. 2006) and specific

chitinolytic activity using Schales reagent according to Nasran et al. (2003). A

KPU 2.1.8 isolate produced the highest chitinolytic activity (0.134 ± 0.004

U/mg) after 24 hours incubation. Identification using Microbact Identification

System 12E/A showed that the isolate has 77.67% similarity with strain E.

coli-inactive. Conditions for chitinolytic production from isolate KPU 2.1.8 was

optimized by measuring specific chitinolytic activity of the enzyme produced in

iii

various pH (4 – 9), temperature (20 – 60 oC), and substrates (colloidal chitin,

powdered chitin, glucose, powdered chitin with glucose). The results showed

that the enzyme production was optimum at pH 5 and temperature 25 oC for

30 hours using colloidal chitin as substrate.

Optimum activity of chitinolytic enzyme from strain KPU 2.1.8 was

determined by measuring activity of the enzyme using chitin medium broth in

various pH (4-10) and temperature (10 – 70 oC). The enzyme was optimally

active at pH 4 – 8 and temperature 40 – 55 oC. The enzyme was able to

maintain their residual activity above 50% for six hours at 40 oC, four hours at

45 oC, and one hour at 50 oC. The enzyme lost its activity after one hour

incubation at 55 oC. Effect of metal ions was studied by measuring activity of

the enzyme using chitin medium broth which was added with Mg2+, Ca2+,

Cu2+, Zn2+, Fe2+, Ba2+, Mn2+ (as chloride salts) dan EDTA at 1 mM and 5 mM

final concentration. Fe2+ ion increased activity of the enzyme by 12.1% and

17% at 1 mM and 5 mM concentration respectively, while Zn2+, Ca2+, and

Mn2+ ion increased activity by 17.8, 11, and 14.7%, respectively, at 5 mM

concentration. Cu2+ ion decreased activity of the enzyme by 25.3% and

43.6% at 1 mM and 5 mM concentration, respectively, while EDTA decreased

activity by 59.1% at 5 mM concentration.

In conclusion, E. coli-inactive KPU 2.1.8 which was isolated from

shrimp waste could be used as chitinolytic enzyme producer. It produced

chitinolytic enzyme in a short production time (30 hours) at average

temperature of 25 oC and pH of 5. The chitinolytic enzyme was active and

iv

stable at high temperature (40 – 55 oC) and wide range of pH (5 – 8) and

could only be inhibited by Cu2+ ion and EDTA at relatively high concentration

(5mM).

The results of this study add to the knowledge of diversity of chitinolytic

bacteria in Indonesia. Further study to determine other characteristics of pure

chitinolytic enzyme from strain KPU 2.1.8 was suggested.

ix + 80 pp.; 1 append.; 13 plates; 5 tables

Bibl.: 47 (1931 – 2006)

v

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur bagi Allah SWT atas nikmatNya sehingga

penulis dapat menyelesaikan tesis ini.

Penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada Ibu Dr.

Ekowati Chasanah dan Bapak Dr. Wibowo Mangunwardoyo yang telah

memberikan ilmu dan membimbing dengan penuh kesabaran selama

penelitian dan penyusunan tesis ini.

Ucapan terima kasih kepada Balai Besar Riset Pengolahan Produk

dan Bioteknologi, Departemen Kelautan dan Perikanan RI yang telah

mendanai penelitian ini. Terima kasih juga disampaikan pada Ibu Prof. Dr.

Endang Sri Heruwati, Ibu Dra. Ninoek Indriati, Ibu Yusro Nuri Fawzya, M.Si.,

Bapak Sugiyono, M.Si., serta peneliti dan teknisi Laboratorium Mikrobiologi

dan Laboratorium Bioteknologi pada instansi tersebut

Terima kasih kepada Bapak dan Ibu tercinta yang telah memberikan

segala bentuk dukungan yang tak terkira banyaknya, kepada Kak Ina, Kak

Ides, Mamah, Om Balun, dan Zizi yang selalu menasehati dan mengingatkan,

dan kepada Dian yang setia menemani dalam penyelesaian tesis ini.

Untuk Phia, Lily, Joice, Titis, dan Heni, penulis mengucapkan terima

kasih telah mau berbagi suka dan duka pada penelitian yang panjang. Dan

untuk berbagai pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, penulis

mengucapkan banyak terima kasih.

Penulis, 2007

vi

DAFTAR ISI

Halaman

SUMMARY ................................................................................................. i

KATA PENGANTAR ................................................................................... v

DAFTAR ISI ................................................................................................ vi

DAFTAR TABEL ......................................................................................... vii

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. ix

PENGANTAR PARIPURNA ....................................................................... 1

MAKALAH I ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI KITINOLITIK DARILIMBAH PENGOLAHAN UDANG ......................................... 5Pendahuluan ......................................................................... 5Bahan dan cara kerja ............................................................ 9Hasil dan pembahasan ......................................................... 14Kesimpulan dan saran .......................................................... 31Daftar acuan ......................................................................... 32

MAKALAH I KARAKTERISASI ENZIM KITINOLITIK Escherichia coli-inactiveKPU 2.1.8 DARI LIMBAH PENGOLAHAN UDANG .............. 43Pendahuluan ......................................................................... 43Bahan dan cara kerja ............................................................ 46Hasil dan pembahasan ......................................................... 50Kesimpulan dan saran .......................................................... 59Daftar acuan ......................................................................... 60

DISKUSI PARIPURNA ............................................................................... 66

RANGKUMAN KESIMPULAN DAN SARAN .............................................. 72

DAFTAR ACUAN ........................................................................................ 74

vii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

I.1. Beberapa bakteri kitinolitik yang telah diteliti ................................... 8

I.2. Isolat bakteri kitinolitik hasil isolasi .................................................. 15

I.3. Isolat-isolat dengan IK > 2 hasil skrining medium padat ................. 18

I.4. Aktivitas spesifik tujuh isolat dengan IK > 2 pada skriningmedium cair ..................................................................................... 18

II.1. Karakteristik beberapa enzim kitinolitik yang dihasilkan bakteri ...... 45

viii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Struktur kitin ................................................................................... 1

2. Posisi pemotongan enzim kitinolitik pada polimer kitin .................. 2

I.1. Hasil skrining medium kitin padat tujuh isolat dengan IK > 2 ......... 17

I.2. Diagram aktivitas spesifik tujuh isolat dengan IK >2 padaskrining medium cair ....................................................................... 19

I.3. Pengecatan Gram isolat KPU 2.1.8 ................................................ 22

I.4. Aktivitas spesifik enzim kitinolitik KPU 2.1.8 pada berbagai variasipH medium produksi ....................................................................... 24

I.5. Aktivitas spesifik enzim kitinolitik KPU 2.1.8 pada berbagaisuhu produksi .................................................................................. 25

I.6. Aktivitas enzim kitinolitik KPU 2.1.8 pada berbagai substratproduksi ........................................................................................... 26

I.7. Kurva aktivitas enzim kitinolitik KPU 2.1.8 selama 72 jam produksi . 29

II.1. Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 padaberbagai pH ...................................................................................... 51

II.2. Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 padaberbagai suhu .................................................................................. 52

II.3. Aktivitas residu enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 setelahpemaparan dengan berbagai suhu selama tujuh jam ..................... 53

II.4. Aktivitas residu enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 218 padaaktivasi dengan penambahan berbagai ion logam .......................... 57

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

I.1. Hasil identifikasi isolat KPU 2.1.8 menggunakan MicrobactIdentification System 12E/A ............................................................. 42

1

PENGANTAR PARIPURNA

Kitin adalah biopolimer alami kedua terbanyak setelah selulosa,

merupakan komponen utama penyusun eksoskeleton Arthropoda (Jeuniaux

et al. 1989; Merzendorfer & Zimoch 2003) dan dinding sel Fungi (Gooday

1989; Cabib et al. 1991). Kitin tersusun atas monomer 2-asetamido-2-deoksi-

β-D-glukosa (N-asetilglukosamin) yang dihubungkan ikatan β-1,4-glikosida

(Gambar 1.) (Sandford 1989; Shahidi et al. 1999). Monomer dari kitin

dimanfaatkan oleh mikroorganisme di alam, antara lain bakteri, sebagai

sumber karbon dan nitrogen untuk nutrisi (Donderski & Brezezinska 2003).

Gambar 1. Struktur kitin [Sumber: www.langara.bc.ca/biology/mario/Assets]

Degradasi kitin menjadi monomernya melibatkan hidrolisis ikatan β-

1,4-glikosida oleh enzim kitinolitik. Enzim tersebut dikelompokkan menjadi

dua, yaitu enzim 1,4-β-poli-N-asetilglukosaminidase (EC 3.2.1.14) yang juga

2

disebut endokitinase; dan enzim β-N-asetilheksosaminidase (EC 3.2.1.52)

yang juga disebut enzim eksokitinase. Enzim endokitinase menghidrolisis

secara acak ikatan β-1,4-glikosida pada rantai kitin dan menghasilkan

diasetilkitobiosa, sedangkan enzim eksokitinase menghidrolisis ikatan β-1,4-

glikosida gula non-pereduksi pada ujung rantai kitin dan diasetilkitobiosa

serta menghasilkan N-asetilglukosamin (Gambar 2.) (Bade & Hickey 1989;

Gooday 1990; Gohel et al. 2006).

Gambar 2. Posisi pemotongan enzim kitinolitik pada polimer kitin: (A) Enzimβ-N-asetilheksosaminidase; (B) Enzim 1,4-β-poli-N-asetilglukosaminidase[Sumber : www.sigmaaldrich.com/img/assets/19500]

Pengetahuan tentang peran kitin sebagai komponen struktural

Arthropoda dan Fungi juga sebagai sumber karbon alami serta mekanisme

hidrolisis biopolimer tersebut mendasari berbagai aplikasi dari enzim

kitinolitik. Aplikasi tersebut antara lain penggunaan enzim kitinolitik sebagai

agen biokontrol terhadap Fungi dan Insekta yang merugikan (Chernin et al.

3

1995; Chien-Jui Huang et. al 2005), serta pembuatan oligomer kitin dan

protein sel tunggal (Patil et al. 2000; Sørbotten et al. 2005).

Enzim kitinolitik dihasilkan oleh berbagai kelompok organisme dan

memiliki peran yang beragam. Bakteri memproduksi enzim tersebut untuk

pengambilan nutrisi (Yu et al. 1991; Berkenheger & Fischer 2004), Fungi dan

Insekta menggunakannya dalam morfogenesis (Elango et al. 1982; Gooday

1989; Mersendorfer & Zimoch 2003), sedangkan pada Tumbuhan dan

Vertebrata enzim tersebut berperan dalam pertahanan diri terhadap serangan

patogen (Escott & Adams 1995; Bishop et al. 2000; Boot et al. 2001).

Penelitian tentang bakteri penghasil enzim pendegradasi kitin (bakteri

kitinolitik) telah banyak dilakukan. Kemudahan dalam pemeliharaan,

pengembangan strain, serta manipulasi tingkat genetik dari bakteri membuat

mikroorganisme tersebut menjadi salah satu penghasil enzim kitinolitik yang

potensial (Gohel et al. 2006). Habitat dari bakteri kitinolitik umumnya adalah

lingkungan yang mengandung kitin dalam jumlah tinggi, seperti kompos

dengan kandungan kitin (Sakai et.al. 1998), eksoskeleton Arthropoda (Vogan

et al. 2002), air dan sedimen laut (Donderski & Trzebiatowska 1999), dan

tanah (Chernin 1995). Eksplorasi habitat-habitat tersebut untuk mencari

bakteri-bakteri kitinolitik terus dilakukan dengan tujuan mendapatkan bakteri

yang mampu menghasilkan enzim kitinolitik yang lebih baik (Gohel et al.

2006).

Indonesia merupakan negara yang mempunyai keragaman

mikroorgansime yang tinggi, namun isolasi bakteri penghasil kitinolitik dari

4

limbah pengolahan udang masih jarang dilakukan, sehingga potensi dari

bakteri-bakteri tersebut belum sepenuhnya diketahui dan dimanfaatkan. Oleh

sebab itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui potensi kitinolitik dari

isolat bakteri-bakteri di Indonesia.

Makalah pertama berjudul "Isolasi dan Skrining Bakteri Kitinolitik dari

Limbah Pengolahan Udang" bertujuan mencari bakteri kitinolitik dari limbah

pengolahan udang serta mengetahui kemampuan produksi enzim kitinolitik

dari bakteri tersebut. Makalah kedua berjudul "Karakterisasi Enzim kitinolitik

Escherichia coli-inactive KPU 2.1.8 dari Limbah Pengolahan Udang"

bertujuan mengetahui pengaruh pH, suhu, dan ion logam terhadap aktivitas

enzim kitinolitik dari bakteri E. coli-inactive KPU 2.1.8 yang berhasil diisolasi.

Hasil penelitian diharapkan dapat menjadi tambahan informasi bakteri

kitinolitik di Indonesia khususnya dari limbah pengolahan udang serta

menjadi data awal bagi penelitian lanjutan untuk aplikasi enzim kitinolitik dari

bakteri yang telah berhasil diisolasi.

5

Makalah I

ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI KITINOLITIK DARI LIMBAH

PENGOLAHAN UDANG

Miftahul IlmiProgram Pascasarjana Biologi

Gedung E Lt. 2, FMIPA UI, Depok

ABSTRACT

Chitinolytic enzyme has attracted many attention because of its biotechnologicalapplications. The purposes of this study were to isolate chitinolytic bacteria from shrimpprocessing waste from Indonesia and to obtain its optimum condition for producingchitinolytic enzyme. Isolation was carried out on agar medium containing colloidal chitin.Screenings were done by evaluating Chitinolytic Index using chitin agar medium and specificchitinolytic activity using chitin broth medium. The selected isolate was identified usingMicrobact Identification System 12E/A. The isolate was cultured under variation of pH,temperature, and substrates to optimize the enzyme production. The screening of 106chitinolytic isolates showed that isolate KPU 2.1.8 produced the highest chitinolytic activity(0.134 ± 0.004 U/mg) after 24 hours incubation. Identification showed that isolate KPU 2.1.8has 77.67% similarity with strain Escherichia coli-inactive. Optimum production of KPU 2.1.8chitinolytic enzyme was at pH 5 and temperature 25

oC for 30 hours using colloidal chitin as

substrate. Further study to investigate the effect of pH, temperature, and metal ions on theactivity of E. coli-inactive KPU 2.1.8 chitinolytic enzyme was suggested.

Keywords: chitinolytic bacteria, colloidal chitin, Escherichia coli-inactive, isolation,optimization, shrimp processing waste

PENDAHULUAN

Enzim kitinolitik adalah kelompok enzim yang mampu mendegradasi

kitin, biopolimer kedua terbanyak di alam setelah selulosa, menjadi

monomernya yang berupa 2-asetamido-2-deoksi-β-D-glukosa (N-

asetilglukosamin) (Patil et al. 2000). Aplikasi dari enzim kitinolitik antara lain

penggunaan enzim tersebut sebagai agen biokontrol terhadap Fungi dan

Insekta yang merugikan (Chernin et al. 1995; Chien-Jui Huang et. al 2005),

6

serta pembuatan oligomer kitin dari polimer kitin dan protein sel tunggal dari

khamir (Patil et al. 2000; Sørbotten et al. 2005).

Enzim kitinolitik dihasilkan oleh berbagai kelompok organisme, salah

satunya bakteri (Gohel et al. 2006). Bakteri penghasil enzim kitinolitik, atau

bakteri kitinolitik, dapat ditemukan pada habitat-habitat yang mengandung

kitin yang tinggi, antara lain kompos yang mengandung kitin (Sakai et.al.

1998), eksoskeleton Crustacea (Johnson 1931; Vogan et al. 2002), air dan

sedimen laut (Donderski & Trzebiatowska 1999), dan tanah (Chernin et al.

1995). Enzim kitinolitik dihasilkan bakteri untuk mendegradasi kitin dari

habitatnya sehingga menghasilkan N-asetilglukosamin yang digunakan

bakteri tersebut sebagai sumber nutrisi karbon dan nitrogen (Donderski &

Brzezinska 2003).

Bakteri kitinolitik memiliki berbagai peran di alam, antara lain

mempertahankan siklus karbon pada lingkungan yang kaya kitin, seperti

ekosistem perairan (Donderski & Trzebiatowska 1999; Donderski &

Brzezinska 2001; Metcalfe et al. 2002). Selain itu bakteri kitinolitik juga

menyebabkan penyakit pada Crustacea, terutama udang dan kepiting.

Bakteri tersebut mendegradasi eksoskeleton Crustacea sehingga terjadi

kerusakan dan mempermudah terjadinya infeksi pada jaringan tubuh yang

berada di bawah eksoskeleton (Guzman & Valle 2000; Vogan et al. 2002).

Mekanisme degradasi kitin oleh bakteri kitinolitik di alam berlangsung

dalam tiga tahap: (i) terpaparnya bakteri pada kitin, (ii) pelekatan bakteri pada

kitin, dan (iii) degradasi kitin oleh enzim kitinolitik (Yu et al. 1991). Yu et al.

7

(1991) menyatakan bahwa bakteri kitinolitik yang berperan sebagai

dekomposer di ekosistem akuatis terpapar kitin dalam bentuk butiran-butiran

yang melayang dan mengendap ke dasar perairan, sedangkan pada bakteri

kitinolitik yang menyebabkan penyakit pada Crustacea, pemaparan kitin akan

didahului perusakan lapisan protein dan lemak pada eksoskeleton oleh enzim

protease dan lipase yang dihasilkan bakteri tersebut (Vogan et al. 2002).

Setelah bakteri terpapar pada kitin, bakteri akan melekat di permukaan

polimer tersebut dengan mediasi chitin-binding protein (CBP) (Yu et al. 1991;

Montgomery & Kirchman 1994). Dan, selanjutnya, kitin akan menginduksi

sistem sensor/kinase dua komponen pada bakteri sehingga enzim kitinolitik

dihasilkan (Xibing Li & Roseman 2004).

Isolasi dan penelitian terhadap bakteri kitinolitik telah lama dilakukan.

Isolasi bakteri kitinolitik tertua dilaporkan oleh Benecke pada tahun 1905

yang menemukan bakteri Bacillus chitinovorus perusak eksoskeleton kepiting

(lihat Johnson 1931). Tabel I.1. menunjukkan beberapa bakteri kitinolitik

yang telah berhasil diisolasi dan dipublikasikan. Umumnya bakteri kitinolitik

berasal dari genus Vibrio dan Bacillus, dan spesies yang paling sering diteliti

adalah Serratia marcescens. Namun, menurut Gohel et al. (2006), masih

banyak bakteri kitinolitik di alam belum diketahui dan dilaporkan potensinya.

Indonesia memiliki iklim tropis sehingga mampu menopang

keanekaragaman mikroorganisme. Eksplorasi untuk mencari bakteri kitinolitik

di Indonesia telah dilakukan oleh beberapa peneliti, antara lain oleh Purwani

et al. (2002) dan Purwani et al. (2004) yang telah mengisolasi bakteri

8

kitinolitik dari sumber air panas di Tompaso, Manado, dan Malik et al. 2003

yang telah mengisolasi bakteri kitinolitik dari ladang lada hitam di Pulau

Bangka. Namun masih banyak habitat-habitat lain belum dieksplorasi, salah

satunya adalah limbah pengolahan udang. Pengolahan udang, baik untuk

industri maupun konsumsi, menghasilkan limbah mengandung kitin (Shahidi

et al. 1999; Nasution et al. 2004). Limbah tersebut diduga menjadi habitat

bagi bakteri-bakteri yang mampu menghasilkan enzim kitinolitik.

Tabel I.1. Beberapa bakteri kitinolitik yang telah diteliti

No Genus Acuan

1. AeromonasBrzezinska & Donderski 2001; Malik et al.2003; Ueda et al. 2003

2. Bacillus sp. 13.26 Purwani et.al. 2002; Purwani et al. 2004

3. Bacillus sp. MH-1 Sakai et al. 1998

4. Bacillus cereus 28-9 Chien-Jui Huang et al. 2005

5. Chromobacterium violaceum Chernin et al. 1998

6. Clostridium aminovalericum Simunek et al. 2004

7. Enterobacter sp. NRG4 Dahiya et al. 2005

8. Haloanaerobacter chitinovorans Liaw & Mah 1992

9. Paenibacillus sp. 300 Singh et al. 1999

10. Pseudomonas aeruginosa Folders et al. 2001

11. Serratia marcescensSuzuki et al. 1999; Suzuki et al. 2002;Sǿrbotten et al. 2005

12. Stenotrophomonas maltophilia C3 Zhang & Yuen 1999; Zhang et.al. 2001

13. Streptomyces sp. 385 Singh et al. 1999

14. Streptomyces griseus HUT6037 Itoh et al. 2002

15. Vibrio charcariae Suginta et al. 2000

16. Vibrio furnisii Yu et al. 1991

17. Vibrio harveyiSvitil et al. 1997; Svitil & Kirchman 1998;Nasran et al. 2003

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan bakteri kitinolitik dari

limbah pengolahan udang. Bakteri tersebut diharapkan memiliki kemampuan

9

potensial dalam menghasilkan enzim kitinolitik sehingga dapat digunakan

dalam berbagai aplikasi.

LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium

Bioteknologi, Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi, Badan

Riset Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan RI, pada

bulan Agustus 2005—Mei 2006.

BAHAN DAN CARA KERJA

Sampel dan mikroorganisme

Sampel limbah pengolahan udang diambil dari pabrik pengolahan

udang di Muara Baru, Jakarta, dan rumah makan di wilayah Jakarta. Isolat

Bacillus sp. K-2914 sebagai kontrol positif merupakan koleksi Laboratorium

Mikrobiologi dan Bioteknologi, PAU Institut Pertanian Bogor.

Bahan kimia

Bahan kimia: K2HPO4 [Merck], MgSO4.7H2O [Merck], NaCl [Merck],

(NH4)2SO4 [Merck], yeast extract [Oxoid], kitin bubuk [Sigma], agar [Oxoid],

Reagen Schales, Reagen Lowry, dan Reagen Folin Ciocalteu [Merck].

10

Alat

Alat yang digunakan dalam proses isolasi adalah alat-alat yang umum

digunakan di laboratorium Mikrobiologi. Alat-alat khusus yang digunakan:

Shaking Inkubator ShelLab [Sheldon Manufacturing], Waterbath Shaker GFL

1086 [GFL], Spektrofotometer UV-1201 [Shimadzu], Microfuge 22R

Centrifuge [Beckman Coulter], Acura 825 [Socorex], dan Finnpipette

[Labsystems].

Pembuatan koloidal kitin

Koloidal kitin dibuat berdasarkan metode yang dilakukan Nasran et al.

(2003). Sebanyak 10 g kitin dilarutkan dalam 200 ml HCl pekat, kemudian

diinkubasi semalam pada suhu 4 oC. Larutan tersebut kemudian disaring

menggunakan glass-wool lalu ditambah 100 ml akuades dingin. Keasaman

larutan dinetralkan menggunakan NaOH 12 N, kemudian dilakukan

sentrifugasi 8.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Endapan yang

terbentuk dikumpulkan dan dicuci menggunakan akuades dingin, selanjutnya

disentrifugasi kembali dilakukan. Penyucian diulang beberapa kali hingga

didapatkan endapan berwarna putih yang merupakan koloidal kitin.

Pembuatan medium kitin

Medium kitin agar dibuat berdasarkan Nasran et al. (2003). Komposisi

medium kitin agar adalah sebagai berikut: K2HPO4 0,1% (b/v), MgSO4.7H2O

11

0,01% (b/v), NaCl 0,1% (b/v), (NH4)2SO4 0,7% (b/v), Yeast Extract 0,05%

(b/v), koloidal kitin 2% (b/v), dan agar 1% (b/v). Medium kitin cair memiliki

komposisi yang sama dengan medium kitin agar, namun tidak ditambahkan

agar dan konsentrasi koloidal kitin yang digunakan 1% (b/v).

Isolasi bakteri kitinolitik

Isolasi bakteri kitinolitik menggunakan metode direct isolation

berdasarkan metode Hunter-Cevera et al. (1986). Sebanyak 10 g sampel

dicampur dengan 90 ml aquades NaCl 0,9% dengan 3 kali ulangan.

Campuran diencerkan hingga 1.000 kali, kemudian sebanyak 0,1 ml

suspensi dari tiap pengenceran disebar di atas medium kitin agar. Medium

diinkubasi selama 48 jam pada suhu 30 oC dan setiap 24 jam koloni tunggal

yang membentuk zona bening dipindahkan ke medium NA. Isolat dimurnikan

dan disimpan sebagai stock culture dan working culture pada medium NA.

Skrining bakteri kitinolitik

Skrining dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama (skrining medium

kitin padat) dilakukan dengan mengukur Indeks Kitinolitik (IK) isolat-isolat

yang didapat dari hasil isolasi pada medium kitin agar berdasarkan metode

Cody tahun 1989 (lihat Gohel et al. 2006) dengan kontrol positif Bacillus sp.

K-2914. Isolat berumur 24 jam dalam medium NA diinokulasikan ke medium

kitin agar dengan metode titik (Nasran et al. 2003), kemudian diinkubasi

selama 72 jam pada suhu 30 oC. Pengamatan dilakukan tiap 24 jam dengan

12

mengukur diamater koloni (DK) serta zona bening (DZ). Indeks Kitinolitik (IK)

dihitung dengan rumus IK = DZ/DK (Gohel et al. 2006).

Tahap kedua (skrining medium kitin cair) dilakukan terhadap isolat

yang memiliki nilai IK tinggi dengan mengukur aktivitas spesifik enzim pada

medium kitin cair. Isolat terpilih berumur 24 jam dalam medium NA miring

disuspensikan dengan 5 ml aquades (A600 = 1,138 ± 0,245). Kemudian 5 ml

suspensi sel tersebut dimasukkan ke dalam 50 ml medium kitin cair dalam

labu Erlenmeyer 250 ml, diinkubasi selama 4 hari pada suhu 30 oC dengan

agitasi 100 rpm. Setiap hari, 1 ml medium diambil dan disentrifugasi dengan

kecepatan 6.000 x g selama 10 menit pada suhu 4 oC. Supernatan diuji

aktivitas relatifnya menggunakan reagen Scahles (Nasran et.al. 2003) serta

ditentukan kadar proteinnya menggunakan metode Lowry (Bollag & Edelstein

1991). Aktivitas spesifik enzim adalah perbandingan aktivitas relatif dengan

kadar protein yang terdapat dalam sampel dan memiliki satuan Unit/mg. Satu

unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 μmol

N-asetilglukosamin tiap menit (Nasran et al. 2003). Medium kitin cair tanpa

isolat digunakan sebagai kontrol negatif. Isolat dengan aktivitas spesifik

terbaik diidentifikasi serta digunakan lebih lanjut dalam penelitian.

Identifikasi isolat terpilih

Identifikasi isolat terpilih dilakukan menggunakan Microbact

Identification System 12E/A [Oxoid].

13

Optimasi produksi enzim kitinolitik

Optimasi produksi enzim kitinolitik dari isolat terpilih dilakukan dengan

melakukan kultivasi isolat pada medium dengan berbagai variasi pH, suhu,

dan substrat. Metode optimasi produksi mengikuti metode skrining medium

cair, sedangkan waktu pemanenan mengikuti kurva aktivitas spesifik enzim

yang didapat dari skrining tersebut.

Optimasi pH produksi ditentukan dengan menguji aktivitas enzim

kitinolitik tertinggi pada pH medium produksi 4, 5, 6, 7, 8, dan 9

menggunakan suhu produksi 30 oC. Suhu optimum ditentukan dengan

menguji aktivitas kitinolitik pada suhu produksi 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,

dan 60 oC menggunakan pH produksi optimum.

Optimasi medium produksi dilakukan terhadap jenis substrat. Aktivitas

kitinolitik tertinggi ditentukan pada produksi menggunakan substrat koloidal

kitin (1% b/v), glukosa (1% b/v), kitin bubuk (1% b/v), dan campuran kitin

bubuk (0,5% b/v) dan glukosa (0,5% b/v) pada suhu dan pH produksi

optimum.

Profil produksi enzim kitinolitik

Profil produksi enzim kitinolitik ditentukan pada kondisi dan medium

optimum dengan mengukur aktivitas spesifik enzim pada jam ke-0, 6, 12, 18,

24, 30, 36, 42, 48, 54, dan 72.

14

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi bakteri kitinolitik

Isolasi bakteri kitinolitik dari sampel limbah pengolahan udang

dilakukan berdasarkan metode Hunter-Cevera et al. (1986) menggunakan

medium kitin agar berdasarkan Nasran et al. (2003). Isolasi menghasilkan

106 isolat bakteri yang mampu membentuk zona bening pada medium kitin

agar (Tabel I.3.).

Isolasi bakteri kitinolitik umumnya dilakukan pada sampel-sampel yang

mengandung kitin dengan konsentrasi yang tinggi. Menurut Patil et al.

(2000), limbah pengolahahan hasil laut, yang terdiri dari eksoskeleton dan

sefalotoraks Crustacea, mengandung kitin hingga 55% dari berat keringnya.

Monomer dari kitin, yaitu N-asetilglukosamin, merupakan sumber karbon dan

nitrogen bagi bakteri kitinolitik. Bakteri yang tumbuh pada lingkungan dengan

kandungan kitin yang tinggi akan menghasilkan enzim kitinolitik untuk

mendegradasi polimer kitin menjadi monomernya (Donderski & Brzezinska

2003), sehingga kitin tersebut siap digunakan sebagai nutrisi. Beberapa

penelitian yang bertujuan mengisolasi bakteri kitinolitik dari eksoskeleton

Crustacea telah dilakukan, antara lain oleh Johnson (1931) yang mengisolasi

Bacillus chitinovorus dari eksoskeleton Cancer magister, dan Vogan et. al.

(2002) yang mengisolasi 22 isolat Vibrio dari eksoskeleton Cancer pagurus.

Jumlah isolat yang didapat dari sampel asal rumah makan (KLU 2.1

dan KPU 2.1), sebanyak 65 isolat, lebih banyak dibandingkan isolat yang

15

didapat dari sampel asal pabrik pengolahan udang (KLU 1.1 dan KPU 1.1),

yaitu sebanyak 41 isolat. Diduga pengolahan udang di pabrik lebih higienis

dibandingkan pengolahan udang di rumah makan. Pengolahan hasil laut

umumnya menggunakan disinfektan, antara lain klorin, untuk membunuh

bakteri (FAO & WHO 2000), sehingga bakteri-bakteri yang terdapat di limbah

pengolahan akan mati dan berkurang jumlahnya.

Tabel I.2. Isolat bakteri kitinolitik hasil isolasi

Sampel Jenis sampel Lokasi pHSuhu

sampel(oC)

Berat(g)

Jumlahisolat

KPU 1.1Sefalotoraks

UdangPT. Sentral PertiwiBahari, Muara Baru

8 10 30 21

KLU 1.1Eksoskeleton

UdangPT. Sentral PertiwiBahari, Muara Baru

8 20 30 20

KPU 2.1Sefalotoraks

udangPondok Sari Laut,

Klender8 21 30 25

KLU 2.1Eksoskeleton

UdangPondok Sari Laut,

Klender8 21 30 40

Keterangan: KLU = Kulit udang; KPU = Kepala udang

Isolat yang didapat dari sampel kepala udang (KPU 1.1 dan KPU 2.1)

lebih banyak jumlahnya, yaitu 60 isolat, dibandingkan jumlah isolat yang

berasal dari sampel kulit udang (KLU 1.1 dan KLU 2.1), yaitu 46 isolat.

Sampel kepala udang masih mengandung protein dalam jumlah tinggi,

sehingga memungkinkan lebih banyak bakteri dapat hidup pada sampel

tersebut. Protein merupakan sumber N utama bagi pertumbuhan bakteri

(Madigan et al. 1997). Selain itu protein juga berperan sebagai sumber

energi saat sumber energi yang lebih mudah digunakan, seperti

16

monosakarida, tidak terdapat di lingkungan. Menurut Moat et al. (2002),

asam amino akan diubah menjadi metabolit antara, seperti piruvat dan

oksaloasetat, yang kemudian memasuki jalur metabolisme penghasil energi.

Proses tersebut akan berlangsung hingga sel bakteri mampu membentuk

enzim, seperti enzim kitinolitik, yang memungkinkan bakteri mendapatkan

monosakarida sebagai sumber energi.

Skrining bakteri kitinolitik

Skrining dilakukan dalam medium padat dan cair. Skrining medium

padat dilakukan menggunakan metode yang dikembangkan Cody pada tahun

1989 (lihat Gohel et al. 2006) dengan medium kitin agar berdasarkan Nasran

et al. (2003). Tujuh isolat dengan IK>2 dipilih dari 79 isolat tersebut untuk

skrining medium cair (Gambar I.1) (Tabel I.4.).

Koloidal kitin merupakan hasil degradasi kimiawi polimer kitin serta

mengandung oligomer kitin. Substrat tersebut digunakan dalam skrining

sebagai komponen dalam medium kitin sebab mampu menginduksi produksi

kelompok enzim kitinolitik, seperti eksokitinase dan endokitinase (Chernin et

al. 1998).

Metode skrining menggunakan medium kitin agar dipilih karena cukup

praktis. Metode tersebut mampu menskrining isolat kitinolitik dalam jumlah

banyak dalam waktu singkat dan hasil dari skrining dapat dilihat secara

kualitatif maupun semikuantiatif (Suginta et al. 2000; Gohel et al. 2006).

Terjadinya degradasi koloidal kitin ditunjukkan oleh terbentuknya zona bening

17

di sekeliling isolat. Perbandingan antara diameter zona bening dengan

diameter koloni isolat, atau disebut Indeks Kitinolitik (IK), dijadikan ukuran

potensi kitinolitik isolat tersebut (Gohel et al. 2006).

Gambar I.1. Hasil skrining medium kitin padat tujuh isolat dengan IK > 2:(A) KLU 1.1.1 (kontrol negatif); (B) KLU 2.1.23; (C) KLU 1.1.21;(D) KLU 1.1.6; (E) KPU 2.1.8; (F) KPU 2.1.24; (G) KLU 1.1.5; (H) KLU 1.1.16;(I) Bacillus sp. K-2914 (kontrol positif); (a) zona bening.

Skrining menggunakan medium kitin agar merupakan metode yang

tidak spesifik karena degradasi koloidal kitin juga dapat dilakukan oleh enzim

selain enzim kitinolitik (Fukamizo 2000). Oleh sebab itu, dilakukan skrining

menggunakan medium kitin cair yang secara spesifik mengukur kadar N-

asetilglukosamin sebagai produk degradasi kitin oleh enzim kitinolitik

(Gooday 1990).

18

Tabel I.3. Isolat-isolat dengan IK > 2 hasil skrining medium padat

No Isolat Indeks kitinolitik

1. KLU 1.1.16 2,58 ± 0,52

2. KPU 2.1.24 2,53 ± 0,29

3. KLU 1.1.5 2,44 ± 0,17

4. KPU 2.1.8 2,39 ± 0,31

5. KPU 2.1.23 2,27 ± 0,02

6. KLU 1.1.6 2,21 ± 0,19

7. KLU 1.1.21 2,18 ± 0,4

Keterangan: KLU = Kulit udang; KPU = Kepala udang

Skrining medium cair dilakukan dengan mengukur aktivitas kitinolitik

tujuh isolat dengan IK > 2 pada medium kitin cair (Nasran et al. 2003).

Skrining medium cair menunjukkan isolat KPU 2.1.8 memiliki aktivitas spesifik

tertinggi (0,134 ± 0,004 U/mg) dan pada waktu tercepat (24 jam)

dibandingkan keenam isolat lainnya (Tabel I.5) (Gambar I.2.).

Tabel I.4. Aktivitas spesifik tujuh isolat dengan IK > 2 pada skrining mediumcair

Aktivitas spesifik (U/mg) pada jam ke-Isolat

0 24 48 72 96

KLU 1.1.5 0,006 ± 0,001 0,049 ± 0,009 0,066 ± 0,007 0,052 ± 0,020 0,063 ±0,008

KLU 1.1.16 0,013 ± 0,002 0,046 ± 0,019 0,049 ± 0,008 0,045 ± 0,010 0,051 ± 0,017

KPU 2.1.24 0,005 ± 0,004 0,115 ± 0,017 0,086 ± 0,012 0,067 ± 0,017 0,066 ± 0,019

KPU 2.1.8 0,006 ± 0,002 0,134 ± 0,004 0,105 ± 0,005 0,078 ± 0,018 0,044 ± 0,002

KPU 2.1.23 0,009 ± 0,007 0,089 ± 0,010 0,073 ± 0,006 0,082 ± 0,011 0,039 ± 0,016

KLU 1.1.21 0,007 ± 0,004 0,048 ± 0,024 0,031 ± 0,007 0,043 ± 0,011 0,021 ± 0,014

KLU 1.1.6 0,012 ± 0,004 0,096 ± 0,020 0,063 ± 0,021 0,062 ± 0,009 0,028 ± 0,002

Kontrol negatif 0,003 ± 0,002 0,002 ± 0,001 0,005 ± 0,004 0,004 ± 0,000 0,001 ± 0,000

Keterangan: KLU = Kulit udang; KPU = Kepala udang

19

Isolat terbaik yang dihasilkan skrining medium padat dan medium cair

berbeda. Skrining medium padat menunjukkan isolat KLU 1.1.16 memiliki IK

tertinggi (2,58 ± 0,52) sedangkan aktivitas pada skrining medium cair tidak

tinggi (0,051 ± 0,017 U/mg) setelah 96 jam. Skrining medium cair

menunjukkan isolat KPU 2.1.8 memiliki aktivitas spesifik tertinggi (0,134 ±

0,004 U/mg) setelah 24 jam, namun IK isolat tersebut bukan yang tertinggi

(2,39 ± 0,31).

0,000

0,050

0,100

0,150

0 24 48 72 96Waktu (jam)

Ak

tiv

ita

sS

pe

sif

ik(U

/mg

) KLU 1.1.5

KLU 1.1.16

KPU 2.1.24

KPU 2.1.8

KPU 2.1.23

KLU 1.1.21

KLU 1.1.6

Kontrol negatif

Gambar I.2. Diagram aktivitas spesifik tujuh isolat dengan IK >2 padaskrining medium cair. KLU = Kulit udang; KPU = Kepala udang

Isolat KLU 1.1.16 mampu membentuk IK terbesar diduga karena isolat

tersebut melakukan proses quorum sensing dalam mendegradasi substrat

koloidal kitin. Quorum sensing adalah proses beberapa bakteri menginduksi

bakteri lain disekitarnya, baik dari spesies yang sama maupun berbeda,

20

untuk mengekspresikan suatu protein (Moat et al. 2002). Fenomena tersebut

telah dilaporkan oleh Chernin et al. (1998) yang meneliti quorum sensing

pada degradasi kitin oleh bakteri Chromobacterium violaceum. Skrining

medium padat memungkinkan sel bakteri tumbuh berdekatan atau bahkan

saling menumpuk dalam kepadatan yang tinggi, sehingga proses quorum

sensing lebih mudah terjadi (Moat et. al 2002). Mekanisme tersebut akan

mempecepat proses degradasi koloidal kitin yang ada di substrat (Chernin et

al. 1998). Kemungkinan lain penyebab isolat KLU 1.1.16 memiliki IK terbesar

adalah adanya enzim pendegradasi kitin selain enzim kitinolitik yang

dihasilkan oleh bakteri tersebut saat skrining dilakukan. Produk dari enzim

tersebut tidak dapat terdeteksi saat dilakukan skrining medium cair, sehingga

aktivitas kitinolitik isolat KLU 1.1.16 rendah pada skrining tersebut.

Isolat KPU 2.1.8 menunjukkan aktivitas kitinolitik tertinggi (0,134 ±

0,004 U/mg) dalam waktu tercepat (24 jam) pada skrining medium cair diduga

karena sel bakteri KPU 2.1.8 mampu melekat lebih baik ke partikel kitin

dibandingkan isolat lainnya pada medium cair. Pelekatan sel ke partikel kitin

merupakan tahap kedua dalam degradasi kitin dan dibantu oleh suatu protein

yang disebut chitin-binding protein (CBP). Ekspresi protein tersebut berbeda

antar spesies bakteri (Yu et al. 1991). Menurut Montgomery & Kirchman

(1994), CBP bertindak sebagai jangkar bagi bakteri dalam proses degradasi

kitin di lingkungan perairan. Hal tersebut menyebabkan bakteri yang lebih

baik melekat pada kitin akan terinduksi ekspresi enzim kitinolitiknya dan

dapat menggunakan N-asetilglukosamin hasil degradasi lebih mudah

21

dibanding bakteri yang tidak mampu atau kurang mampu melekat pada kitin.

Agitasi pada skrining medium cair menyebakan medium teraduk sehingga

tanpa bantuan CBP bakteri tidak akan dapat melekat pada substrat dengan

baik.

Identifikasi isolat KPU 2.1.8

Pengecatan Gram isolat KPU 2.1.8 menunjukkan bahwa isolat

tersebut bersifat Gram negatif dan berbentuk batang pendek (Gambar I.3.).

Identifikasi isolat KPU 2.1.8 menggunakan Microbact Identification System

12E/A (Lampiran I.1.) menunjukkan bahwa isolat tersebut 77,67% identik

dengan strain Escherichia coli-inactive.

Strain E. coli-inactive merupakan biogroup dari spesies E. coli,

termasuk dalam famili Enterobacteriaceae (Subgrup 1) dan merupakan

anggota dari Grup 5 (bakteri Gram negatif berbentuk batang bersifat

anaerobik fakultatif) dalam sistem klasifikasi Bergey (Holt et.al. 1994). Strain

tersebut dibedakan dengan E. coli berdasarkan hasil uji biokimia, yaitu uji

penggunaan laktosa, pembentukan gas pada fermentasi monosakarida, lisin

dekarboksilase, arginin dihidrolase, dan ornitin dekarboksilase. Perbedaan

hasil uji tersebut mengakibatkan E.coli-inactive sulit dibedakan dari Shigella

dan Enterobacter agglomerans (Holt et al. 1994). Namun McIver & Tapsal

(1990) membuktikan bahwa menggunakan Microbact Identification System

12E/A strain E. coli-inactive dapat dibedakan dari bakteri-bakteri lainnya.

22

Gambar I.3. Pengecatan Gram isolat KPU 2.1.8 (1000x)

Bakteri kitinolitik dari Grup 5 yang telah diisolasi dan diteliti umumnya

berasal dari famili Vibrionaceae (Subgrup 2), antara lain Vibrio charcariae

(Suginta et al. 2000), Vibrio furnisii (Yu et al. 1991), Vibrio harveyi (Svitil et al.

1997; Svitil & Kirchman 1998; Nasran et al. 2003), dan Aeromonas

(Brzezinska & Donderski 2001; Malik et al. 2003; Ueda et al. 2003). Selain

itu, bakteri kitinolitik dari grup tersebut berasal dari famili Enterobacteriaceae

(Subgrup 1), antara lain Serratia marcescens (Suzuki et al. 1999; Suzuki et

al. 2002; Sǿrbotten et al. 2005), Enterobacter sp. (Dahiya et al. 2005), dan E.

aerogenes (Donderski & Trzebiatowska 1999), serta satu genus dari Subgrup

4 yaitu Chromobacterium (Chernin et al. 1998; Donderski & Brzeziñska

2001).

23

Bakteri kitinolitk dari famili Enterobacteriaceae umum ditemukan di

perairan dengan sumber kitin berasal dari eksoskeleton Arthropoda.

Donderski & Trzebiatowska (1999) telah melakukan perhitungan jumlah sel

bakteri kitinolitik dari Danau Jeziorak (Polandia) dan mendapatkan 3,01 x 106

sel bakteri kitinolitik tiap gram sampel. Sebanyak 21% dari jumlah sel

tersebut diidentifikasi sebagai Enterobacter aerogenes dan 7,5% diidentifikasi

sebagai Serratia sp. Penelitian yang serupa dilakukan oleh Donderski &

Brzezinska (2001) di distrik Danau Ilawskie, Polandia. Penelitian tersebut

menghasilkan 1,10 x 105 sel bakteri kitinolitik tiap cm3 sampel dan 48% dari

sel tersebut diidentifikasi sebagai famili Enterobacteriaceae. Namun laporan

tentang isolasi atau penelitian bakteri kitinolitik dari genus Escherichia,

terutama spesies E. coli, sulit ditemukan. Satu-satunya laporan yang berhasil

ditemukan adalah penelitian Keyhani & Roseman (1997) yang meneliti

pertumbuhan strain liar E. coli pada medium yang mengandung disakarida

kitin. Hal tersebut menunjukkan bahwa hanya sedikit strain E. coli dari alam

yang mampu menghasilkan enzim kitinolitik. Penelitian ini merupakan

laporan pertama tentang bakteri kitinolitik dari strain E. coli-inactive.

Optimasi pH, suhu, dan medium produksi

Optimasi pH, suhu, dan medium produksi dilakukan dengan mengukur

aktivitas enzim kitinolitik hasil dari produksi yang menggunakan pH, suhu,

dan jenis substrat yang berbeda-beda. Optimasi pH dan suhu menunjukkan

24

strain KPU 2.1.8 memproduksi enzim kitinolitik dengan aktivitas tertinggi pada

pH 5 (Gambar I.4.) dan suhu 25 oC (Gambar I.5.).

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

4 5 6 7 8 9

pH

Ak

tiv

ita

sS

pe

sif

ik(U

/mg

)

0,06 ± 0,01

0,09 ± 0,02

0,08 ± 0,00

0,06 ± 0,01 0,06 ± 0,01

0,04 ± 0,01

Gambar I.4. Aktivitas spesifik enzim kitinolitik KPU 2.1.8 pada berbagaivariasi pH medium produksi

Aktivitas enzim kitinolitik yang dihasilkan strain KPU 2.1.8 pada variasi

pH produksi berhubungan dengan aktivitas metabolisme bakteri tersebut.

Maier et al. (2000) menyatakan bahwa aktivitas enzimatik dapat dihubungkan

langsung dengan pertumbuhan mikroorganisme. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa strain KPU 2.1.8 mampu menghasilkan enzim kitinolitik

pada pH antara 4 hingga 9, sehingga diduga strain KPU 2.1.8 dapat tumbuh

dan melakukan proses metabolisme pada rentang pH tersebut. Menurut

Moat et al. (2002), E. coli merupakan bakteri neutralofil yang mampu tumbuh

pada rentang pH antara 5 hingga 8.

25

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

20 25 30 35 40 45 50 55 60

Suhu (0C)

Akti

vit

as

Sp

esif

ik(U

/mg

)

0,06 ± 0,01

0,11 ± 0,01

0,08 ± 0,01

0,04 ± 0,01

0,01 ± 0,00

0,01 ± 0,00

0,01 ± 0,00

0,01 ± 0,00

0,00

Gambar I.5. Aktivitas spesifik enzim kitinolitik KPU 2.1.8 pada berbagai suhuproduksi

Aktivitas enzim kitinolitik yang dihasilkan strain KPU 2.1.8 pada

berbagai suhu produksi mencerminkan kemampuan bakteri tersebut untuk

tumbuh dan melakukan proses metabolisme pada variasi suhu yang

digunakan. Strain KPU 2.1.8 memproduksi enzim kitinolitik pada rentang

suhu 20 – 35 oC dengan aktivitas enzim tertinggi diproduksi pada suhu 25 oC.

Hasil tersebut menunjukkan bahwa strain KPU 2.1.8 dapat tumbuh pada

rentang suhu 20 – 35 oC dan memiliki suhu pertumbuhan optimum pada 25

oC. Menurut Madigan et al. (1997), kisaran suhu tersebut masuk ke dalam

kisaran suhu pertumbuhan bagi bakteri mesofilik (20 – 40 oC) yang salah satu

anggotanya adalah E. coli.

Strain KPU 2.1.8 berasal dari sefalotoraks udang hasil limbah

pengolahan udang di rumah makan. Limbah tersebut memiliki suhu 21 oC

26

(Tabel I.2.), namun diduga pemrosesan udang tidak dilakukan pada suhu

konstan dan umumnya pada suhu kamar. Hal tersebut menjelaskan rentang

suhu pertumbuhan strain KPU 2.1.8 antara 20 – 35 oC yang sesuai dengan

suhu lingkungannya.

0,000

0,010

0,0200,030

0,040

0,050

0,060

0,0700,080

0,090

0,100

Koloidal Kitin Glukosa Kitin Bubuk Kitin Bubuk

Glukosa

Substrat

Akti

vit

as

Sp

esif

ik(U

/mg

) 0,088 ± 0,022

0,004 ± 0,002 0,004 ± 0,002 0,00

Gambar I.6. Aktivitas enzim kitinolitik KPU 2.1.8 pada berbagai substratproduksi

Hasil optimasi substrat produksi menunjukkan bahwa strain KPU 2.1.8

yang ditumbuhkan pada medium yang mengandung koloidal kitin mampu

memproduksi enzim kitinolitik dengan aktivitas tertinggi (0,088 ± 0,022 U/mg).

Koloidal kitin mengandung oligomer kitin hasil degradasi polimer kitin secara

kimiawi (Chernin et al. 1998). Penelitian yang dilakukan Xibing Li &

Roseman (2004) membuktikan bahwa oligomer kitin berperan sebagai

induser produksi enzim kitinolitik dari bakteri Vibrio furnisii dan Vibrio

cholerae. Diduga substrat koloidal kitin menjadi induser produksi enzim

27

kitinolitik dari strain KPU 2.1.8, enzim tersebut akan mendegradasi substrat

koloidal kitin menjadi bentuk monomer yang siap untuk digunakan.

Strain KPU 2.1.8 yang ditumbuhkan pada medium yang mengandung

glukosa tidak menghasilkan enzim kitinolitik, hal tersebut ditunjukkan oleh

rendahnya aktivitas enzim kitinolitik pada produksi yang menggunakan

substrat tersebut (0,004 ± 0,002 U/mg). Menurut Moat et al. (2002), glukosa

merupakan sumber karbon yang paling efisien bagi E. coli. Strain KPU 2.1.8

saat ditumbuhkan pada medium yang mengandung substrat glukosa akan

langsung menggunakan substrat tersebut untuk pertumbuhan dan

metabolisme. Hal tersebut menyebabkan produksi enzim-enzim

pendegradasi karbohidrat lainnya, antara lain enzim kitinolitik, tidak diinduksi.

Moat et al. (2002) menyebut fenomena tersebut sebagai catabolite

repression.

Aktivitas enzim kitinolitik hasil produksi dari strain KPU 2.1.8 pada

medium yang menggunakan substrat kitin bubuk sangat rendah (0,004 ±

0,0022 U/mg). Kitin bubuk dan koloidal kitin memiliki monomer yang sama,

yaitu N-asetilglukosamin. Namun kitin bubuk masih berupa polimer kitin yang

memiliki bentuk padat dan tidak larut dalam air, sedangkan koloidal kitin

merupakan oligomer kitin yang lebih larut dalam air. Menurut Xibing Li &

Roseman (2004), bakteri Vibrio furnisii dan Vibrio cholerae memiliki reseptor

pada permukaan sel yang spesifik terhadap oligomer kitin. Reseptor tersebut

akan menginduksi produksi enzim kitinolitik. Strain KPU 2.1.8 diduga

memiliki reseptor yang sama dengan kedua bakteri tersebut, sebab hasil

28

optimasi substrat produksi menunjukkan bahwa produksi enzim kitinolitik

menggunakan substrat kitin bubuk yang berupa polimer jauh lebih rendah

dibandingkan produksi enzim kitinolitik menggunakan substrat koloidal kitin

yang merupakan oligomer.

Aktivitas enzim kitinolitik pada optimasi medium produksi

menggunakan campuran kitin bubuk dengan glukosa tidak ada. Diduga

glukosa langsung digunakan oleh strainKPU 2.1.8 saat ditumbuhkan pada

medium tersebut dan substrat tersebut menghambat produksi enzim

kitinolitik. Ketika glukosa telah habis terpakai, kitin bubuk tidak dapat

menginduksi produksi enzim kitinolitik karena tidak memiliki induser, yaitu

oligomer kitin.

Profil produksi enzim kitinolitik KPU 2.1.8

Profil produksi enzim kitinolitik KPU 2.1.8 ditentukan dengan mengukur

aktivitas enzim kitinolitik yang diproduksi pada kondisi optimum selama 72

jam. Optimasi menunjukkan aktivitas enzim mulai meningkat pada jam

produksi ke-12 dan mulai stabil pada jam produksi ke-18 (Gambar I.7.).

Bentuk kurva aktivitas enzim kitinolitik pada produksi selama 72 jam

menyerupai kurva sigmoid pertumbuhan bakteri, sehingga diduga enzim

kitinolitik tersebut berperan penting bagi strain KPU 2.1.8 dalam pengambilan

nutrisi. Selama 12 jam pertama aktivitas enzim belum menunjukkan

peningkatan yang tajam, sehingga diasumsikan sel-sel dalam koloni berada

dalam fase lag. Pada fase tersebut, sel-sel bakteri mulai mengenali dan

29

melakukan pelekatan pada partikel oligomer kitin di dalam medium (Xibing Li

& Roseman 2004). Kitin tidak langsung menginduksi sekresi enzim kitinolitik.

Pada bakteri Vibrio harveyi, setelah pelekatan sel yang dilakukan oleh suatu

CBP dengan berat 53 kDa, kitin akan menginduksi sekresi CBP lainnya

(Montgomery & Kirchman 1994). Proses tersebut diduga juga terjadi pada

strain KPU 2.1.8 dan menyebabkan sedikitnya jumlah enzim kitinolitik yang

dihasilkan oleh sel bakteri pada awal produksi.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Waktu (jam)

Akti

vit

as

sp

esif

ik(U

/mg

)

Gambar I.7. Kurva aktivitas enzim kitinolitik KPU 2.1.8 selama 72 jamproduksi

Pada jam ke-12 hingga jam ke-18 terjadi peningkatan tajam aktivitas

enzim (Gambar I.7.) menunjukkan sel-sel bakteri memasuki fase

eksponensial dan mulai menghasilkan enzim kitinolitik dalam jumlah banyak.

Pada fase ini diduga pelekatan sel terhadap partikel sudah kuat sehingga

sekresi enzim kitinolitik terinduksi dengan baik. Enzim tersebut akan

30

mendegradasi kitin dan menghasilkan N-asetilglukosamin yang digunakan sel

bakteri untuk tumbuh dan membelah diri (Yu et al. 1991; Montgomery &

Kirchman 1994). Peningkatan jumlah sel akan menyebabkan semakin

banyak partikel kitin yang dilekati sehingga meningkatkan produksi enzim

kitinolitik.

Peningkatan aktivitas enzim mulai mengalami penurunan dari jam ke-

18 hingga jam ke-30. Pada fase tersebut, sel-sel bakteri mulai memasuki

fase stasioner yang disebabkan sel mencapai kepadatan maksimum

sedangkan jumlah substrat telah berkurang. Sebagian sel masih dapat

berlekatan dengan substrat kitin dan memproduksi enzim kitinolitik,

sedangkan sebagian sel lain tidak melekat pada kitin. Menurut Xibing Li &

Roseman (2004), sel yang tidak melekat pada kitin akan menonaktifkan

sistem ekspresi enzim kitinolitiknya.

Produksi enzim kitinolitik terhenti ketika semua substrat telah habis

didegradasi, sehingga jumlah enzim kitinolitik di dalam medium tetap dan

aktivitasnya juga menjadi tetap. Hal tersebut dapat dilihat pada kurva dari

jam produksi ke-30 hingga jam produksi ke-54. Penurunan aktivitas enzim

kitinolitik setelah produksi jam ke-54 disebabkan karena enzim kitinolitik yang

ada di dalam medium digunakan kembali oleh strain KPU 2.1.8. Moat et al.

(2002) menyatakan bahwa enzim tersebut didegradasi oleh enzim protease

dari sel-sel bakteri agar asam amino hasil degradasi dapat digunakan

sebagai nutrisi ketika tidak ada nutrisi lain di dalam medium.

31

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Sebanyak 106 isolat bakteri kitinolitik berhasil diisolasi dari limbah

pengolahan udang. Sampel dari rumah makan menghasilkan isolat lebih

banyak (65 isolat) dibandingkan isolat dari sampel pabrik pengolahan

udang (41 isolat). Sampel kepala udang menghasilkan isolat lebih banyak

(60 isolat) dibandingkan dengan isolat dari sampel kulit udang (46 isolat).

2. Skrining medium padat menghasilkan tujuh isolat dengan IK > 2: KLU

1.1.16 (2,58 ± 0,52), KPU 2.1.24 (2,53 ± 0,29), KLU 1.1.5 (2,44 ± 0,17),

KPU 2.1.8 (2,39 ± 0,31), KPU 2.1.23 (2,27 ± 0,02), KLU 1.1.6 (2,21 ±

0,19), dan KLU 1.1.21 (2,18 ± 0,4).

3. Isolat KPU 2.1.8 menunjukkan aktivitas tertinggi (0,134 ± 0,004 U/mg) dan

pada waktu tercepat (24 jam) dibandingkan keenam isolat terpilih lainnya

pada skrining menggunakan medium cair.

4. Isolat KPU 2.1.8 diidentifikasi sebagai strain Escherichia coli-inactive

menggunakan Microbact Identification System 12E/A.

5. Strain KPU 2.1.8 memproduksi enzim kitinolitik pada pH optimum 5 serta

suhu optimum 25 oC. Produksi enzim kitinolitk dari strain KPU 2.1.8

hanya dapat diinduksi oleh substrat koloidal kitin. Waktu pemanenan

terbaik pada produksi enzik kitinolitik dari strain KPU 2.1.8 pada jam

produksi ke-30.

32

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui pengaruh pH,

suhu, dan ion logam terhadap aktivitas enzim kitinolitik dari bakteri E. coli-

inactive KPU 2.1.8 yang berhasil diisolasi.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih disampaikan pada Yusro Nuri Fawzya, M.Si.,

Sugiyono, M.Si., Dra. Ninoek Indriati, Prof. Dr. Endang Sri Heruwati, serta

para peneliti dan teknisi Laboratorium Bioteknologi dan Laboratorium

Mikrobiologi, Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi,

Departemen Kelautan dan Perikanan RI, atas segala fasilitas dan bimbingan

yang diberikan.

DAFTAR ACUAN

Bollag, D.M. & S.J. Edelstein. 1991. Protein methods. John Wiley & Sons

Inc., New York: xii + 230 hlm.

Brzezinska, M.S. & W. Donderski. 2001. Occurrence and Activity of the

Chitinolytic Bacteria of Aeromonas Genus. Polish Journal of

Environmental Studies 10(1): 27 – 31.

Chernin, L.S., M.K. Winson, J.M. Thompson, S. Haran, B.W. Bycroft, I. Chet,

P. Williams & G.S.A.B. Stewart. 1998. Chitinolytic activity in

33

Chromobacterium violaceum: Substrate analysis and regulation by

quorum sensing. Journal of Bacteriology 180(17): 4435 – 4441.

Chernin, L.S, Z. Ismailov, S. Haran & I. Chet. 1995. Chitinolytic Enterobacter

agglomerans antagonistic to fungal plant pathogens. Applied and

Environmental Microbiology 61(5): 1720 –1726.

Chien-Jui Huang, Tang-Kai Wang, Shu-Chun Chung & Chao-Ying Chen.

2005. Identification of an antifungal chitinase from a potential biocontrol

agent, Bacillus cereus 28-9. Journal of Biochemistry and Molecular

Biology 38(1): 82 – 88.

Connon, S.A. & S.J. Giovannoni. 2002. High-throughput methods for culturing

microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine

isolates. Applied and Enviromental Microbiology 68(8): 3878 – 3885.

Costilow, R.N. 1981. Biophysical factors in growth. Dalam. Gerhardt, P.,

R.G.E. Murray, R.N. Costilow, E.W. Nester, W.A. Wood, N.R. Krieg &

G.B. Phillips (eds). 1981. Manual of methods for general bacteriology.

American Society of Microbiology, Washington D.C.: 66 – 78.

Dahiya, N., R. Tewari, R.P. Tiwari & G.S. Hoondal. 2005. Chitinase from

Enterobacter sp. NRG4: Its purification, characterization and reaction

pattern. Electronic Journal of Biotechnology 8(2): 134 – 145.

Donderski, W. & M.S. Brzeziñska. 2001. Occurrence of chitinolytic bacteria in

water and bottom sediment of eutrophic lakes in Iławskie Lake District.

Polish Journal of Environmental Studies 10(5): 331 – 336.

34

Donderski, W. & M. S. Brzezinska. 2003. The utilization of N-

acetyloglucosamine and chitin as sources of carbon and nitrogen by

planktonic and benthic bacteria in Lake Jeziorak. Polish Journal of

Environmental Studies 12(6): 685 – 692.

Donderski, W. & M. Trzebiatowska. 1999. Chitinase activity production by

planktonic, benthic and epiphytic bacteria inhabiting the moty bay of

the Jeziorak Lake (Poland). Polish Journal of Environmental Studies

8(4): 215 – 220.

FAO & WHO. 2000. The use of chlorine in fish processing: Safety and risks.

Infofish International 3: 58 – 62.

Folders, J., J. Algra, M.S. Roelofs, L.C. van Loon, J. Tommassen & W. Bitter.

2001. Characterization of Pseudomonas aeruginosa chitinase, A

gradually secreted protein. Journal of Bacteriology 183(24): 7044 –

7052.

Gohel, V., A. Singh, M. Vimal, P. Ashwini & H.S. Chhatpar. 2006.

Bioprospecting and antifungal potential of chitinolytic microorganisms.

African Journal of Biotechnology 5(2): 54 – 72.

Gooday, G.W. 1990. The ecology of chitin degradarion. Dalam: Marshall, K.C.

(ed). 1990. Advances in Microbial Ecology. Plenum Press, New York:

387 – 430.

Guzmán, G.A. & F.A. Valle. 2000. Infectious disease in shrimp species with

aquaculture potential. Resent Research and Development in

Microbiology 4: 333 – 348.

35

Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley & S.T. Williams. 1994.

Bergey’s manual of determinative bacteriology. 9th ed. Williams &

Wilkins, Baltimore: xviii + 787 hlm.

Hunter-Cevera, J.C., M.E. Fonda & A. Belt. 1986. Isolation of cultures. Dalam:

Demain, A.L. & N.A. Solomon (eds). 1986. Manual of industrial

microbiology and biotechnology. American Society of Microbiology,

Washington, D.C.: 3 – 23.

Itoh, Y., T. Kawase, N. Nokaidou, H. Fukada, M. Mitsutomi, T. Watanabe & Y.

Itoh. 2002. Functional analysis of chitin-binding domain of a family 19

chitinase from Streptomyces griseus HUT6037: Substrate-binding

affinity and cis-dominant increase of antifungal function. Bioscience of

Biotechnology and Biochemistry 66(5): 1084 – 1092.

Jeuniaux, C. 1966. Chitinase. Dalam: Neufeld, E.F. & V. Ginsburg (eds).

1966. Methods in Enzymology Volume III: Complex Carbohydrate.

Academic Press, New York: 644 – 650.

Johnson, D.E. 1931. Some observation on chitin-destroying bacteria. Journal

Series of the Minnesota Agricultural Experiment Station 1053: 335 –

340.

Keyhani, N.O. & S. Roseman. 1997. Wild-type Escherichia coli grows on the

chitin disaccharide, N,N’-diacetylchitobiose, by expressing the cel

operon. Proceeding of the National Academy of Science 94: 14367 –

14371.

36

Liaw, H.J. & R.A. Mah. 1992. Isolation and characterization of

Haloanaerobacter chitinovorans gen. nov., sp. nov., a halophilic,

anaerobic, chitinolytic bacterium from a solar saltern. Applied and

Enviromental Microbiology 58(1): 260 – 266.

Madigan, M.T., J.M. Martinko & J. Parker. 1997. Brock biology of

microorganism. 8th ed. Prentice Hall International, Inc., London: xviii +

1038 hlm.

Maier, R.M., I.L. Pepper & C.P. Gerba. 2000. Enviromental microbiology.

Academic Press, San Diego: xix + 585 hlm.

Malik, A., S. Wenuganen, A. Suwanto & B. Tjahjono. 2003. Cloning, DNA

sequance, and expression of Aeromonas caviae WS7b chitinase gene.

Molecular Biotechnology 23(1): 1 – 10.

McIver, C.J. & J.W. Tapsall. 1990. Assessment of conventional and

commercial methods for identification of clinical isolates of cysteine-

requiring strains of Escherichia coli and Klebsiella species. Journal of

Clinical Microbiology 28(9): 1947 – 1951.

Metcalfe, A.C., M. Krsek, G.W. Gooday, J.I. Prosser & E.M.H. Wellington.

2002. Molecular Analysis of a Bacterial Chitinolytic Community in an

Upland Pasture. Applied and Enviromental Microbiology 68(10): 5042 –

5050.

Moat, A.G., J.W. Foster & M.P. Spector. 2002. Microbial physiology. 4th ed.

Willey-Liss, Inc., New York: xx + 715 hlm.

37

Montgomery, M.T. & D.L. Kirchman. 1994. Induction of chitin-binding proteins

during the specific attachment of the marine bacterium Vibrio harveyi to

chitin. Applied and Environmental Microbiology 60(12): 4284 – 4288.

Nasran, S., F. Ariyani & N. Indriati. 2003. Produksi kitinase dan kitin

deasetilase dari Vibrio harveti. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia

9(5): 33 – 38.

Nasution, Z., Tazwir & D.S. Zilda. 2004. Potensi, pemanfaatan dan nilai

ekonomi limbah udang dan rajungan di propinsi Lampung. Warta

Penelitian Perikanan Indonesia 10(7): 2 – 5.

Patil, R.S., V. Ghormade & M.V. Deshpande. 2000. Chitinolytic enzymes: An

exploration. Enzyme and Microbial Technology 26: 473 – 483.

Purwani, E.Y., A. Toharisman, E. Chasanah, J.F. Laksmi, V. Welan, M.T.

Suhartono, T. Purwadaria, Jae Kwan Hwang & Yu Ryang Pyun. 2002.

Studi pendahuluan enzim kitinolitik ekstraseluler yang dihasilkan oleh

isolat bakteri asal Manado. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan 8(2):

111 – 117.

Purwani, E.Y., M.T. Suhartono, Y. Rukayadi, Jae Kwan Hwang & Yu Ryang

Pyun. 2004. Characteristics of thermostable chitinase enzymes from

the Indonesian Bacillus sp. 13.26. Enzyme and Microbial Technology

35: 147 – 153.

Saito, A., T. Fujii, T. Yoneyama & K. Miyashita. 1998. glkA is involved in

glucose repression of chitinase production in Streptomyces lividans.

Journal of Bacteriology 180(11): 2911 – 2914.

38

Sakai, K., A. Yokota, H. Kurokawa, M. Wakayama & M. Moriguchi. 1998.

Purification and Characterization of Three Thermostable

Endochitinases of a Noble Bacillus Strain, MH-1, Isolated from Chitin-

Containing Compost. Applied and Enviromental Microbiology 64(9):

3397 – 3402.

Shahidi, F., J.K.V. Arachi & Y.J. Jeon. 1999. Food applications of chitin and

chitosan. Trends in Food Science & Technology 10: 37 – 51.

Simunek, J., G. Tishchenko, K. Rozhetsky, H. Bartonova, J. Kopecny & B.

Hodrova. 2004. Chitinolytic enzymes from Clostridium aminovalericum:

Activity screening and purification. Folia Microbiol. 49(2): 194 – 198.

Singh, P.P., Yong Chuk Shin, Chang Seuk Park & Young Ryun Chung. 1999.

Biological control of Fusarium Wilt of cucumber by chitinolytic bacteria.

Phytopathology 89(1): 92 – 99.

Sørbotten, A., S.J. Horn, V.G.H. Eijsink & K.M. Vårum. 2005. Degradation of

chitosans with chitinase B from Serratia marcescens: Production of

chito-oligosaccharides and insight into enzyme processivity. FEBS

Journal 272: 538 – 549.

Suginta, W., P.A.W. Robertson, B. Austin, S.C. Fry & L.A. Fothergill-Gilmore.

2000. Chitinases from Vibrio: activity screening and purification of chiA

from Vibrio carchariae. Journal of Applied Microbiology 89: 76 – 84.

Suzuki, K., M. Taiyoji, N. Sugawara, N. Nikaidou, B. Henrissat & T.

Watanabe. 1999. The third chitinase gene (chiC) of Serratia

39

marcescens 2170 and the relationship of its product to other bacterial

chitinases. Biochemistry Journal 343: 587 – 596.

Suzuki, K., N. Sugawara, M. Suzuki, T. Uchiyama, F. Katouno, N. Nikaidou &

T. Watanabe. 2002. Chitinase A, B, and C1 of Serratia marcescens

2170 produced by recombinant Escherichia coli: Enzymatic properties

and synergism on chitin degradation. Bioscience of Biotechnology and

Biochemistry 66(5): 1075 – 1083.

Svitil, A.L. & D.L. Kirchman. 1998. A chitin-binding domain in a marine

bacterial chitinase and other microbial chitinases: implications for the

ecology and evolution of 1,4-β-glycanases. Microbiology 144: 1299 –

1308.

Svitil, A.L, S.M.N. Chadhain, J.A. Moore & D.L. Kirchman. 1997. Chitin

degradation proteins produced by the marine bacterium Vibrio harveyi

growing on different forms of chitin. Applied and Enviromental

Microbiology 63(2): 408 – 413.

Ueda, M., M. Kojima, T. Yoshikawa, N. Mitsuda, K. Araki, T. Kawaguchi, K.

Miyatake, M. Arai & T. Fukamizo. 2003. A novel type of family 19

chitinase from Aeromonas sp. No.10S-24: Cloning, sequence,

expression, and the enzymatic properties. European Journal of

Biochemistry 270: 2513 – 2520.

Vaidya, R.J, S.L.A. Macmil, P.R. Vyas & H.S. Chhatpar. 2003. The novel

method for isolating chitinolytic bacteria and its application in screening

40

for hyperchitinase producing mutant of Alcaligenes xylosoxydans.

Letters in Applied Microbiology 36: 129 – 134.

Vogan, C.L., C. Costa-Ramos & A.F. Rowley. 2002. Shell disease syndrome

in the edible crab, Cancer pagurus – isolation, characterization and

pathogenicity of chitinolytic bacteria. Microbiology 148: 743 – 754.

Xibing Li & S. Roseman. 2004. The chitinolytic cascade in Vibrios is regulated

by chitin oligosaccharides and a two-component chitin catabolic

sensor/kinase. Proceeding of the National Academy of Science

101(2): 627 – 631.

Yu, C., A.M. Lee, B. L. Bassler & S. Roseman 1991. Chitin utilization by

marine bacteria: A physiological function for bacterial adhesion to

immobilized carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry

266(36): 24260 – 24267.

Zhang, Z. & G.Y. Yuen. 2000. The role of chitinase production by

Stenotrophomonas maltophilia strain C3 in biological control of

Bipolaris sorokiniana. Phytopathology 90(4): 384 – 389.

Zhang, Z., G.Y. Yuen, G. Sarath & A.R. Penheiter. 2001. Chitinases from the

plant disease biocontrol agent, Stenotrophomonas maltophilia C3.

Phytopathology 91(2): 204 – 211.

41

LAMPIRAN

42

Lampiran I.1. Hasil identifikasi isolat KPU 2.1.8 menggunakan MicrobactIdentification System 12E/A

43

Makalah II

KARAKTERISASI ENZIM KITINOLITIK Escherichia coli-inactive KPU

2.1.8 DARI LIMBAH PENGOLAHAN UDANG

Miftahul IlmiProgram Pascasarjana Biologi

Gedung E Lt. 2, FMIPA UI, Depok

ABSTRACT

Applications of chitinolytic enzyme have been carried out in recent years.Information of the enzyme is important for industrial applications. The purpose of this studywas to investigate the effect of pH, temperature, and metal ions to the activity of chitinolyticenzyme from E. coli-inactive KPU 2.1.8. Thermostability of the enzyme was also determinedby incubating the enzyme at various temperature and the residual activity was assayed. Theoptimal pH of the chitinolytic enzyme from strain KPU 2.1.8 ranged from 4 – 8, and theoptimal temperature ranged from 40 – 55

oC. The enzyme was able to maintain its residual

activity above 50% for six hours at 40oC, for four hours at 45

oC, and for one hour at 50

oC.

The enzyme lost its activity after one hour incubation at 55oC. Fe

2+increased the enzyme

activity by 12.1% and 17% at 1 mM and 5 mM concentration, while Zn2+

, Ca2+

, and Mn2+

increased enzyme activity by 17.8, 11, and 14.7% at 5 mM concentration. Cu2+

decreasedenzyme activity by 25.3% and 43.6% at 1 mM and 5 mM concentration, while EDTAdecreased enzyme activity by 59.1% at 5 mM concentration. Further study to purify anddetermine further characteristics of chitinolytic enzymes from strain KPU 2.1.8 wassuggested.

Keywords: chitinolytic enzyme, colloidal chitin, Escherichia coli-inactive, metal ions, pH,stability, temperature

PENDAHULUAN

Enzim kitinolitik adalah enzim yang mampu menghidrolisis ikatan β-

1,4-glikosida pada rantai polimer kitin menjadi oligomer atau monomer

(Fukamizo 2000). Enzim kitinolitik dihasilkan oleh berbagai organisme,

antara lain bakteri, fungi, protozoa, invertebrata, serta beberapa tumbuhan

dan vertebrata (Patil et al. 2000). Menurut Bade & Hickey (1989) Gooday

44

(1990), dan Gohel et al. (2006), Nomenclature Commitee of International

Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) membagi kelompok

enzim kitinolitik menjadi dua, yaitu enzim 1,4-β-poli-N-asetilglukosaminidase

(EC 3.2.1.14) yang juga disebut endokitinase; dan enzim β-N-

asetilheksosaminidase (EC 3.2.1.52) yang juga disebut enzim eksokitinase.

Enzim endokitinase menghidrolisis secara acak ikatan β-1,4-glikosida pada

rantai kitin dan menghasilkan diasetilkitobiosa, sedangkan enzim

eksokitinase menghidrolisis ikatan β-1,4-glikosida gula non-pereduksi pada

diasetilkitobiosa dan menghasilkan N-asetilglukosamin. Henrisatt dan

Bairoch membagi enzim kitinolitik menjadi dua berdasarkan struktur

proteinnya, yaitu enzim kitinolitik Famili 18 yang umumnya dihasilkan oleh

bakteri, dan enzim kitinolitik Famili 19 yang umumnya dihasilkan oleh

tumbuhan (Fukamizo 2000; Patil et al. 2000).

Enzim kitinolitik dari bakteri telah banyak diaplikasikan, antara lain

sebagai agen biokontrol terhadap fungi dan serangga (Chernin et al. 1995;

Patil et al. 2000; Chien-Jui Huang et. al 2005), serta pembuatan oligomer kitin

dari polimer kitin dan pembuatan protein sel tunggal dari khamir (Patil et al.

2000; Sørbotten et al. 2005). Informasi karakteristik enzim, antara lain

pengaruh suhu, pH, dan ion logam, diperlukan dalam aplikasi enzim tersebut

(Reed 1975). Karakteristik beberapa enzim kitinolitik dari bakteri dapat dilihat

pada Tabel II.1.

Penelitian sebelumnya telah berhasil mengisolasi strain Escherichia

coli-inactive KPU 2.1.8 dari limbah pengolahan udang, namun karakeristik

45

enzim kitinolitik yang dihasilkan strain tersebut belum diketahui. Penelitian ini

dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh suhu, pH, dan ion

logam terhadap aktivitas enzim kitinolitik dari strain E. coli-inactive KPU 2.1.8

asal limbah pengolahan udang. Data yang didapat diharapkan menjadi dasar

bagi penelitian lebih lanjut untuk aplikasi enzim kitinolitik tersebut.

Tabel II.1. Karakteristik beberapa enzim kitinolitik yang dihasilkan bakteri

Keterangan: t.d. = tidak ada data

No Bakteri penghasilSuhu

optimum(oC)

pHoptimum

Inhibitor Aktivator Acuan

1.Vibrio sp.

98CJ1102745 6

Fe2+

Cu2+ t.d.

Shin HyePark et al.

2000

2. Bacillus sp. NCTU2 50 – 60 7Hg

2+

Cu2+ Ca

2+Chih-MinWen et al.

2002

3.Enterobacter sp.

NRG445 5,5

Hg2+

Cu2+

Co2+

Ag+

Mg2+

K+

Ca2+

Dahiya et al.2005

4.Enterobacteragglomerans

40 6,5 t.d. t.dChernin etal. 1995

5.Stentrophomonas

maltophila C350 6

Fe2+

Hg2+ t.d.

Zhang et al.2001

6. Bacillus sp. 13.26 60 7 – 8Mn

2+

Co2+

Ca2+

Mg2+

Ni2+

Purwani etal. 2004

7.Microbulbifer

degradans 2-4030 – 37 7,2 – 8

Ni2+

Sr2+

Cu2+

Hg2+

t.d.Howard etal. 2004

8.Pseudomonas

aeruginosa50 4,5 – 5 t.d. t.d.

Folders etal. 2001

9.Streptomyces

thermoviolaceusOPC-520

80 9

Ba2+

Sn2+

Cu2+

Hg2+

Cd2+

t.d.Tsujibo et al.

1993

46

LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium

Bioteknologi, Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi, Badan

Riset Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan RI, pada

bulan Mei 2006 – November 2007.

BAHAN DAN CARA KERJA

Mikroorganisme

Isolat Escherichia coli-inactive KPU 2.1.8 merupakan hasil isolasi dan

skrining bakteri kitnolitik dari limbah pengolahan udang yang telah dioptimasi

produksi enzim kitinolitiknya.

Bahan kimia

Bahan kimia yang digunakan: K2HPO4 [Merck], MgSO4.7H2O [Merck],

NaCl [Merck], (NH4)2SO4 [Merck], yeast extract [Oxoid], kitin bubuk [Sigma],

reagen Schales, reagen Lowry, reagen Folin [Merck], CaCl2 [Merck], CuCl2

[Merck], ZnSO4 [Merck], FeSO4 [Merck], BaCl2 [Merck], MnCl2 [Merck], dan

EDTA [Merck].

Alat

Alat-alat gelas yang digunakan merupakan alat-alat gelas yang umum

digunakan di laboratorium Bioteknologi. Alat-alat khusus yang digunakan:

47

Shaking Inkubator ShelLab [Sheldon Manufacturing], Microfuge 22R

Centrifuge [Beckman Coulter], UFP-10-C-3MA [Amersham], Acura 825

[Socorex], dan Finnpipette [Labsystems].

Pembuatan koloidal kitin

Koloidal kitin dibuat berdasarkan metode Nasran et al. (2003).

Sebanyak 10 g kitin dilarutkan dalam 200 ml HCl pekat, kemudian diinkubasi

semalam pada suhu 4 oC. Larutan tersebut kemudian disaring menggunakan

glass-wool lalu ditambah 100 ml akuades dingin. Keasaman larutan tersebut

dinetralkan menggunakan NaOH 12 N, kemudian dilakukan sentrifugasi

8.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Endapan yang terbentuk

dikumpulkan dan dicuci menggunakan akuades dingin, lalu sentrifugasi

kembali dilakukan. Penyucian diulang beberapa kali hingga didapatkan

endapan berwarna putih yang merupakan koloidal kitin.

Pembuatan medium kitin

Medium kitin cair dibuat berdasarkan Nasran et al. (2003). Komposisi

medium kitin cair adalah sebagai berikut: K2HPO4 0,1% (b/v), MgSO4.7H2O

0,01% (b/v), NaCl 0,1% (b/v), (NH4)2SO4 0,7% (b/v), Yeast Extract 0,05%

(b/v), koloidal kitin 1% (b/v).

48

Produksi dan preparasi enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 218

Starter produksi dibuat dengan menginkubasi 50 ml medium kitin cair

yang telah diinokulasikan dengan 5 ml suspensi sel bakteri E. coli-inactive

KPU 218 berumur 24 jam (A600 = 1,138 ± 0,245) dalam Erlenmeyer 125 ml

selama 16 jam pada suhu 25 oC dan pH 5 dengan agitasi 100 rpm.

Sebanyak 30 ml starter dimasukkan ke dalam 300 ml medium kitin cair dalam

Erlenmeyer 500 ml pada suhu 25 oC dan pH 5 dengan agitasi 100 rpm

diinkubasi selama 30 jam. Sel dan supernatan dipisahkan dengan cara

sentrifugasi pada kecepatan 6.000x g selama 10 menit. Supernatan

dipekatkan hingga tiga kali lipat konsentrasi awal menggunakan ultrafiltrasi

UFP-10-C-3MA (10 kDa).

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8 ditentukan dengan menguji aktivias enzim menggunakan bufer fosfat-

sitrat 0,2 M (pH 4, 5, 6), bufer fosfat 0,1 M (pH 6, 7, 8), dan bufer borat 0,2 M

(pH 8, 9, 10) pada suhu 30 oC. Aktivitas enzim diuji menggunakan reagen

Schales menurut Nasran et al. (2003), sedangkan konsentrasi protein diuji

menggunakan metode Lowry (Bollag & Edelstein 1991).

49

Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8

Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8 ditentukan dengan menguji aktivitas enzim pada suhu inkubasi 10, 15,

20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, dan 70 oC pada pH aktivitas optimal.

Ketahanan enzim terhadap suhu diuji dengan memaparkan enzim pada suhu

40, 45, 50, dan 55 oC selama tujuh jam. Setiap jam enzim tersebut diuji

aktivitasnya pada kondisi optimum. Aktivitas enzim diuji menggunakan

reagen Schales menurut Nasran et al. (2003), sedangkan konsentrasi protein

diuji menggunakan metode Lowry (Bollag & Edelstein 1991).

Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive

KPU 218

Ion logam yang digunakan dalam pengujian adalah Mg2+, Ca2+, Cu2+,

Zn2+, Fe2+, Ba2+, Mn2+, dan EDTA. Pengaruh ion logam diuji dengan menguji

aktivitas enzim pada suhu dan pH aktivitas optimum menggunakan substrat

yang telah ditambahi ion-ion logam tersebut dalam bentuk garam klorida

dengan konsentrasi akhir 1 mM dan 5 mM. Aktivitas enzim diuji

menggunakan reagen Schales menurut Nasran et al. (2003).

50

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8

Hasil karakteristik pH menunjukkan aktivitas enzim kitinolitik E. coli-

inactive KPU 2.1.8 memiliki rentang pH optimum yang luas, yaitu antara 5

hingga 8 (Gambar II.1.). Penelitian-penelitian sebelumnya menunjukkan

enzim kitinolitik dari bakteri memiliki rentang pH optimum yang sempit, antara

lain enzim kitinase yang dihasilkan Vibrio sp. 98J11027 (pH optimum 6) (Shin

Hye Park et al. 2000), Enterobacter sp. NRG4 (pH optimum 5,5) (Dahiya et

al. 2005), Enterobacter aglomerans (pH optimum 6,5) (Chernin et al. 1995),

Stentrophomonas maltophila C3 (pH optimum 6) (Zhang et al. 2001), dan

Pseudomonas aeruginosa (pH optimum 4,5 – 5) (Folders et al. 2001).

Luasnya rentang pH optimum enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8 diduga disebabkan adanya perlidungan dari substrat saat reaksi

katalitik terjadi. Menurut Fukamizo (2000) dan van Aalten et al. (2001),

pengikatan kitin dengan enzim kitinolitik dapat menyebabkan perubahan

konformasi enzim. Perubahan tersebut dapat meningkatkan ketahanan

enzim terhadap denaturasi oleh pH (Segel 1975).

Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 menurun

pada pH 4 dan 10 diduga karena struktur enzim mengalami denaturasi.

Creighton (1993) menyatakan bahwa denaturasi enzim umumnya terjadi

pada pH di bawah 5 dan di atas 10. Denaturasi tersebut disebabkan dua hal,

51

yaitu: (i) terionisasinya asam-asam amino penyusun struktur enzim yang

awalnya berada dalam kondisi tidak terionisasi, sehingga terjadi ketidak

stabilan elektrostatik pada struktur enzim; (ii) rusaknya ikatan ionik

penghubung dua asam amino yang terionisasi karena salah satu asam amino

tidak lagi terionisasi.

0,00

0,50

1,00

1,50

4 5 6 7 8 9 10

pH

Ak

tiv

ita

sS

pe

sif

ik(U

/mg

)

Bufer Phosphat sitratBufer PhosphatBufer Borat

0,10 ± 0,04

1,04 ± 0,07 1,05 ± 0,02

1,03 ± 0,001 1,03 ± 0,01

1,09 ± 0,04

1,01 ± 0,0040,91 ± 0,004

0,73 ± 0,004

Gambar II.1. Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 padaberbagai pH.

Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8

Hasil karakteristik suhu aktivitas menunjukkan enzim kitinolitik E. coli-

inactive KPU 2.1.8 memiliki suhu optimum 40 hingga 55oC (Gambar II.2.).

Hasil pengujian ketahanan terhadap suhu menunjukkan enzim tersebut

mampu mempertahankan aktivitas residu di atas 50% saat terpapar suhu

52

40oC selama enam jam, suhu 45oC selama empat jam, dan suhu 50oC

selama satu jam. Enzim kehilangan aktivitas setelah pemaparan pada suhu

55oC selama satu jam (Gambar II.3.).

Suhu optimum enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 berada pada

rentang 40 – 55 oC. Hasil tersebut sesuai dengan hasil penelitian lain yang

menunjukkan bahwa enzim kitinolitik umumnya memiliki suhu optimum di

atas 40 oC, antara lain enzim kitinase Vibrio sp. 98CJ11027 (45 oC) (Shin Hye

Park et al. 2000), Enterobacter sp. NRG4 (45 oC) (Dahiya et al. 2005),

Enterobacter aglomerans (40 oC) (Chernin et al. 1995), Stentrophomonas

maltophila C3 (50 oC) (Zhang et al. 2001), dan Pseudomonas aeruginosa (50

oC) (Folders et al. 2001).

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Suhu (0C)

Ak

tiv

ita

ss

pe

sif

ik(U

/mg

)

0,3 ± 0,05

0,42 ± 0,07

0,54 ± 0,02

0,6 ± 0,02

0,81 ± 0,01

0,96 ± 0,04

1,05 ± 0,01

1,07 ± 0,04

1,08 ± 0,08

1,04 ± 0,06

0,68 ± 0,00

0,38 ± 0,01

0,14 ± 0,01

Gambar II.2. Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 padaberbagai suhu.

53

Pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-

inactive KPU 2.1.8 memperlihatkan aktivitas enzim meningkat sejalan dengan

peningkatan suhu dari 10 – 40 oC. Energi aktivasi pada suhu 10 oC

diperkirakan telah tercapai karena aktivitas enzim dapat diukur pada suhu

tersebut. Apabila energi aktivasi belum tercapai, maka tidak akan ada

aktivitas karena komplek enzim-substrat tidak terbentuk (Segel 1975; Perez &

Tutor 1998). Aktivitas yang rendah pada suhu 10 oC disebabkan belum

tercapainya energi kinetik yang memungkinkan frekuensi tumbukan optimum

antara enzim dengan substrat (Segel 1975).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Waktu (jam)

Akti

vit

as

resid

u(%

)

40 oC

45 oC

50 oC

55 oC

Gambar II.3. Aktivitas residu enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8setelah pemaparan dengan berbagai suhu selama tujuh jam.

54

Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 mencapai optimum

pada suhu 40 oC dan bertahan hingga suhu 55 oC. Pada rentang suhu

tersebut diperkirakan terjadi frekuensi tumbukan optimum, namun karena

konsentrasi substrat dan enzim tetap maka frekuensi tersebut tidak

meningkat sehingga aktivitas enzim juga tidak meningkat. Menurut Segel

(1975), selain dipengaruhi oleh energi kinetik, frekuensi tumbukan antara

substrat dengan enzim juga dipengaruhi oleh konsentrasi reaktan.

Aktivitas stabil enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 pada suhu 40

– 55 oC disebabkan enzim tersebut mampu menjaga keseimbangan antara

rigiditas dengan fleksibilitas konformasi sehingga sisi aktif dapat merubah

bentuk untuk berlekatan dengan substrat dan melakukan aktivitas katalitiknya

(D’Amico et al. 2003; Zoldak et al. 2003). Keseimbangan antara rigiditas dan

fleksibilitas konformasi tersebut dapat diganggu oleh kenaikan suhu

lingkungan (Fields et al. 2001). Substrat koloidal kitin diperkirakan

memegang peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim kitinolitik E.

coli-inactive KPU 2.1.8. Ikatan antara substrat dan enzim akan memperkuat

struktur enzim, selain itu substrat juga menyerap energi dari lingkungan

sehingga melindungi enzim dari kelebihan energi yang dapat merusak

strukturnya (Segel 1975). Enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 dapat

bertahan terhadap kenaikan suhu, terutama pada suhu 50 dan 55 oC, ketika

substrat ada dalam reaksi tersebut. Ketika substrat ditiadakan dalam reaksi,

seperti terjadi pada uji ketahanan terhadap suhu, hasil uji menunjukkan

enzim kitinolitik hanya mampu mempertahankan aktivitas residunya di atas

55

50% selama satu jam pada suhu 50 oC, sedangkan aktivitas enzim hilang

setelah inkubasi selama satu jam pada suhu 55 oC.

Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 mengalami

penurunan drastis saat dipaparkan pada suhu di atas 55 oC. Hal tersebut

terjadi karena struktur enzim tersebut menyerap terlalu banyak energi

sehingga ikatan-ikatan yang mempertahankan konformasi, seperti ikatan

hidrogen dan ikatan nonkovalen, terputus dan enzim mengalami denaturasi

(Segel 1975; Vijayakumar et al. 1993).

Hasil pengujian ketahanan enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8

terhadap suhu menunjukkan enzim tersebut mampu mempertahankan

aktivitas residu di atas 50% selama enam jam pada suhu 40 oC, empat jam

pada suhu 45 oC, dan satu jam pada suhu 50 oC. Inkubasi pada suhu 55 oC

selama satu jam akan menghilangkan aktivitas enzim tersebut. Ketahanan

enzim pada suhu 40 oC dan 45 oC diduga disebabkan karena enzim kitinolitik

E. coli-inactive KPU 2.1.8 berada pada kondisi tidak murni, sehingga enzim

tersebut masih tercampur dengan protein lain yang ikut menyerap energi saat

suhu dinaikkan (Segel 1975). Hal tersebut menyebabkan enzim kitinolitik E.

coli-inactive KPU 2.1.8 tidak terpapar energi berlebihan yang dapat merusak

konformasinya.

56

Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive

KPU 2.1.8

Aktivitas residu enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 218 setelah

aktivasi dengan penambahan berbagai ion logam dapat dilihat pada Gambar

II.4. Ion Fe2+ meningkatkan aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8 sebesar 12.1% pada konsentrasi 1 mM dan 17% pada konsentrasi 5

mM, sedangkan ion-ion Zn2+, Ca2+, dan Mn2+ meningkatkan aktivitas enzim

tersebut sebesar 17.8, 11, dan 14.7% secara berurutan pada konsentrasi 5

mM. Ion Cu2+ menghambat aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8 sebesar 25.3 dan 43.6% pada konsentrasi 1 dan 5 mM secara

berurutan, sedangkan EDTA menghambat aktivitas enzim tersebut sebesar

59.1% pada konsentrasi 5 mM.

Ion logam dapat berperan sebagai aktivator bagi enzim dengan

melekat pada enzim dan meningkatkan aktivitas enzim tersebut (Segel 1975).

Ion Ca2+ telah dilaporkan mampu meningkatkan aktivitas enzim kitinolitik,

antara lain pada enzim kitinase Bacillus sp. NCTU2 (Chih-Min Wen et al.

2002) dan Enterobacter sp. NRG4 (Dahiya et al. 2005). Ion Fe2+, Zn2+, dan

Mn2+ tidak pernah dilaporkan mampu meningkatkan aktivitas enzim kitinase,

bahkan ion Fe2+ merupakan inhibitor enzim kitinase Vibrio sp. 98CJ11027

(Shin Hye Park et al. 2000) dan enzim kitinase Stentrophomonas maltophila

C3 (Zhang et al. 2001), sedangkan ion Mn2+ merupakan inhibitor enzim

kitinase Bacillus sp. 13.26 (Purwani et al. 2004).

57

74,7

117,0 117,8111,0

105,6

114,7

107,5103,5

94,9

102,9 106,2112,1

100,0 98,6

40,9

56,4

108,9

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

Kontrol Fe Zn Ca Cu Mg Ba Mn EDTA

Ion Logam

Ak

tiv

ita

sre

sid

u(%

)

1 mM

5 mM

Gambar II.4. Aktivitas residu enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 218 padaaktivasi dengan penambahan berbagai ion logam.

Ion-ion Fe2+, Zn2+, Ca2+, dan Mn2+ meningkatkan aktivitas enzim

kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 sebesar 17, 17.8, 11, dan 14.7% secara

berurutan pada konsentrasi 5 mM. Hal tersebut, menurut Smith et al. (1991),

disebabkan karena ion-ion logam divalen mempengaruhi konformasi pada

situs aktif enzim. Ion-ion logam divalent berperan sebagai ligan yang melekat

pada protein, pelekatan tersebut dapat menyebabkan perubahan struktur

pada protein (Creighton 1993). Perubahan tersebut dapat meningkatkan

aktivitas katalitik enzim tersebut.

Ion Cu2+ dilaporkan merupakan inhibitor enzim kitinolitik, antara lain

enzim kitinolitik Vibrio sp. 98CJ11027 (Shin Hye Park et al. 2000), Bacillus sp.

NCTU2 (Chih-Min Wen et al. 2002), Enterobacter sp. NRG4 (Dahiya et al.

58

2005), Microbulbifer degradans 2-40 (Howard et al. 2004), dan Streptomyces

thermoviolaceus OPC-520 (Tsujibo et al. 1993), sedangkan pengaruh EDTA

yang menghambat aktivitas enzim kitinolitik dilaporkan oleh Dahiya et al.

(2005) pada enzim kitinolitik Enterobacter sp. NRG4.

Ion Cu2+ menghambat aktivitas enzim kitinolitik sebesar 25.3% (1 mM)

dan 43.6% (5 mM). Hal tersebut diduga karena ion Cu2+ berlekatan dengan

asam aspartat dan asam glutamat yang terdapat di situs aktif. Kedua asam

amino tersebut dilaporkan mampu berikatan dengan beberapa ion logam

divalen, salah satunya Cu2+, sehingga mengubah konformasi situs aktif dan

menghambat aktivitas enzim kitinolitik (Shin Hye Park et al. 2000).

Ethylene diamine tetra acetate (EDTA) merupakan senyawa kimia

yang berperan sebagai chelator agent. Senyawa tersebut akan

mengadsorpsi ion-ion logam yang ada di dalam larutan (Erdem et al. 2001).

Hasil pengujian menunjukkan EDTA tidak memberikan pengaruh yang

signifikan pada aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 saat

diberikan dengan konsentrasi 1 mM, sedangkan pada pemberian EDTA

dengan konsentrasi 5 mM aktivitas enzim menurun hingga 59.1%. Hal

tersebut diduga terjadi karena EDTA mengikat ion K+, Na+, dan Mg2+ di

dalam larutan enzim. Ketiga ion tersebut merupakan komponen penyusun

medium produksi enzim kitinolitik, sehingga terdapat di dalam larutan enzim

saat uji aktivitas dilakukan. Menurut Smith et al. (1991), ion-ion K+ dan Na+

berperan memperkuat ikatan antara substrat dan enzim. Ion Mg2+ bertindak

sebagai kofaktor dalam reaksi metabolisme berbagai polimer, salah satunya

59

karbohidrat (Smith et al. 1991; Faixova & Faix 2002). Konsentrasi EDTA

yang dibutuhkan untuk menghambat aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive

KPU 2.1.8 mencapai 5 mM. Hal tersebut menunjukkan ion K+, Na+, dan

Mg2+ hadir dalam jumlah besar di dalam larutan, sehingga dibutuhkan EDTA

dengan konsentrasi tinggi untuk mengikat ion-ion logam tersebut hingga

dapat menghambat aktivitas enzim (Erdem et al. 2001).

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 memiliki aktivitas optimum pada

rentang pH 5 – 8.

2. Aktivitas optimum enzim kitinolitik ditunjukkan pada rentang suhu 40 – 55

oC. Enzim tersebut mampu mempertahankan aktivitas residunya di atas

50% apabila terpapar selama enam jam pada suhu 40 oC, empat jam

pada suhu 45 oC, dan satu jam pada suhu 50 oC. Aktivitas residu enzim

hilang setelah inkubasi selama satu jam pada suhu 55 oC.

3. Ion Fe2+ meningkatkan aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8

sebesar 12.1% pada konsentrasi 1 mM dan 17% pada konsentrasi 5 mM.

Ion-ion Zn2+, Ca2+, dan Mn2+ meningkatkan aktivitas enzim sebesar 17.8,

11, dan 14.7% pada konsentarsi 5 mM.

4. Ion Cu2+ mampu menghambat aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive

KPU 2.1.8 sebesar 25.3% pada konsentrasi 1mM dan 43.6% pada

60

konsentrasi 5 mM. Sedangkan EDTA menghambat aktivitas enzim

tersebut sebesar 59.1% pada konsentrasi 5 mM.

Saran

Perlu dilakukan purifikasi serta penentuan karakteristik enzim kitinolitik

E. coli-inactive KPU 2.1.8, seperti berat molekul, struktur protein, urutan asam

amino, nilai Km, nilai Vmax, dan substrat spesifik enzim tersebut.

UCAPAN TERIMAKASIH

Ucapan terimakasih disampaikan pada Yusro Nuri Fawzya, M.Si.,

Sugiyono, M.Si., serta para peneliti dan teknisi Laboratorium Bioteknologi,

Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi, Departemen

Kelautan dan Perikanan RI, atas segala fasilitas dan bimbingan yang

diberikan.

DAFTAR ACUAN

van Aalten, D.M.F., D. Komander, B. Synstad, S. Gåseidnes, M. G. Peter &

V. G. H. Eijsink. 2001. Structural insights into the catalytic mechanism

of a family 18 exo-chitinase. Proceeding of the National Academy of

Science 98(16): 8979–8984.

Bade, M.L. & K. Hickey. 1989. Classification of enzymes hydrolizing chitin.

Dalam. Skjak-Brǽk, G., T. Anthonsen & P. Sandford (eds). 1989. Chitin

and chitosan. Elsevier Science Pub. Ltd., London: xxii + 835 hlm.

61

Bollag, D.M. & S.J. Edelstein. 1991. Protein methods. John Wiley & Sons

Inc., New York: xii + 230 hlm.

Chernin, L.S, Z. Ismailov, S. Haran & I. Chet. 1995. Chitinolytic Enterobacter

agglomerans antagonistic to fungal plant pathogens. Applied and

Environmental Microbiology 61(5): 1720 –1726.

Chien-Jui Huang, Tang-Kai Wang, Shu-Chun Chung & Chao-Ying Chen.

2005. Identification of an antifungal chitinase from a potential biocontrol

agent, Bacillus cereus 28-9. Journal of Biochemistry and Molecular

Biology 38(1): 82 – 88.

Chih-Min Wen, Chien-Sheng Tseng, Chih-Yu Cheng & Yaw-Kuen Li. 2002.

Purification, characterization and cloning of a chitinase from Bacillus sp.

NCTU2. Biotechnology and Applied Biochemistry 35: 213 – 219.

Creighton, T.E. 1993. Proteins: Structures and molecular properties. 2nd ed.

W.H. Freeman & Company, New York: xiii + 507 hlm.

Dahiya, N., R. Tewari, R.P. Tiwari & G.S. Hoondal. 2005. Chitinase from

Enterobacter sp. NRG4: Its purification, characterization and reaction

pattern. Electronic Journal of Biotechnology 8(2): 134 – 145.

D’Amico, S., J-C. Marx, C. Gerday, & G. Feller. 2003. Activity-Stability

Relationships in Extremophilic Enzymes. The Journal of Biological

Chemistry 278(10): 7891 – 7896.

Erdem, A., D. Özkan, B. Meriç, K. Kerman & M. Özsöz. 2001. Incorporation of

EDTA for the Elimination of Metal Inhibitory Effects in an Amperometric

62

Biosensor Based on Mushroom Tissue Polyphenol Oxidase. Turkish

Journal of Chemistry 25: 231 – 239.

Faixová Z.,& S. Faix. 2002. Influence of Metal Ions on Ruminal Enzyme

Activities. Acta Vet. Brno. 71: 451-455.

Fields, P.A., B.D. Wahlstrand & G.N. Somero. 2001. Intrinsic versus extrinsic

stabilization of enzymes: The interaction of solutes and temperature on

A4-lactate dehydrogenase orthologs from warm-adapted and cold-

adapted marine fishes. European Journal of Biochemistry 268: 4497 –

4505.

Folders, J., J. Algra, M.S. Roelofs, L.C. van Loon, J. Tommassen & W. Bitter.

2001. Characterization of Pseudomonas aeruginosa chitinase, A

gradually secreted protein. Journal of Bacteriology 183(24): 7044 –

7052.

Fukamizo, T. 2000. Chitinolytic enzymes: Catalysis, substrate binding, and

their application. Current Protein and Peptide Science 1(1): 105 – 124.

Gohel, V., A. Singh, M. Vimal, P. Ashwini & H.S. Chhatpar. 2006.

Bioprospecting and antifungal potential of chitinolytic microorganisms.

African Journal of Biotechnology 5(2): 54 – 72.

Howard, M.B., N.A. Ekborg, L.E. Taylor, R.M. Weiner & S.W. Hutcheson.

2004. Chitinase B of Microbulbifer degradans 2-40 contains two

catalytic domains with different chitinolytic activities. Journal of

Bacteriology 186(5): 1297 – 1303.

63

Nasran, S., F. Ariyani & N. Indriati. 2003. Produksi kitinase dan kitin

deasetilase dari Vibrio harveti. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia

9(5): 33 – 38.

Patil, R.S., V. Ghormade & M.V. Deshpande. 2000. Citinolytic enzimes: An

exploration. Enzyme and Microbial Technology 26: 473 – 483.

Pérez, L.F. & J.C. Tutor. 1998. Assay of β-N-acetylhexosaminidase

isoenzymes in different biological specimens by means of

determination of their activation energies. Clinical Chemistry 44(2): 226

– 231.

Purwani, E.Y., M.T. Suhartono, Y. Rukayadi, J.K. Hwang & Y.R. Pyun. 2004.

Characteristics of thermostable chitinase enzymes from the Indonesian

Bacillus sp. 13.26. Enzyme and Microbial Technology 35: 147 – 153.

Reed, G. 1975. Effect of temperature and pH. Dalam. Reed, G. (ed). 1975.

Enzyme in food processing. 2nd ed. Academic Press, New York: xvi +

573 hlm.

Segel, I.H. 1975. Enzyme kinetics: Behavior and analysis of rapid equilibrium

and steady state enzyme system. John Wiley & Sons, Inc., New York:

xxii + 957 hlm.

Shin Hye Park, Jung-Hyun Lee & Hong Kum Lee. 2000. Purification and

characterization of chitinase from a marine bacterium, Vibrio sp.

98CJ11027. The Journal of Microbiology 38(4): 224 – 229.

64

Smith, D., A.B. Burgin, E.S. Haas & N.R. Pace. 1992. Influence of metal ions

on the ribonuclease P reaction: Distinguishing substrate binding from

catalysis. The Journal of Biological Chemistry 267(4): 2429 – 2436.

Sørbotten, A., S.J. Horn, V.G.H. Eijsink & K.M. Vårum. 2005. Degradation of

chitosans with chitinase B from Serratia marcescens: Production of

chito-oligosaccharides and insight into enzyme processivity. FEBS

Journal 272: 538 – 549.

Thamthiankul, S., S. Suan-Ngay, S. Tantimavanich & W. Panbangred. 2001.

Chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. pakistani. Applied

Microbiology and Biotechnology 56: 395 – 401.

Tsujibo, H., K. Minoura, K. Miyamoto, H. Endo, M. Moriwaki & Y. Inamori.

1993. Purification and properties of a thermostable chitinase from

Streptomyces thermoviolaceus OPC-520. Applied and Environmental

Microbiology 59(2): 620 – 622.

Vijayakumar, S., S. Vishveshwara, G. Ravishanker, & D. L. Beveridge. 1993.

Differential stability of β-sheets and α-helices in β-lactamase: A high

temperature molecular dynamics study of unfolding intermediates.

Biophysical Journal 65: 2304 — 2312.

Zhang, Z., G.Y. Yuen, G. Sarath & A.R. Penheiter. 2001. Chitinases from the

plant disease biocontrol agent, Stenotrophomonas maltophilia C3.

Phytopathology 91(2): 204 – 211.

65

Zoldak, G., R. Sutak, M. Antalik, M. Sprinzl & E. Sedlak. 2003. Role of

conformational flexibility for enzymatic activity in NADH oxidase from

Thermus thermophilus. European Journal of Biochemistry 270: 4887 –

4897.

66

DISKUSI PARIPURNA

Aplikasi enzim kitinolitik semakin berkembang sehingga penelitian

untuk mencari sumber-sumber enzim tersebut banyak dilakukan, antara lain

dari bakteri. Habitat dengan kandungan kitin konsentrasi tinggi merupakan

tempat sesuai bagi bakteri kitinolitik, salah satunya adalah limbah

pengolahan hasil laut. Menurut Patil et al. (2000), limbah pengolahahan hasil

laut, yang terdiri dari eksoskeleton dan sefalotoraks Crustacea, mengandung

kitin hingga 55% dari berat keringnya. Isolasi bakteri kitinolitik dari

eksoskeleton Crustacea telah berhasil dilakukan oleh Johnson (1931) dan

Vogan et. al. (2002). Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi dan skrining

bakteri kitinolitik dari limbah pengolahan udang serta mengkarakterisasi

enzim kitinolitik yang dihasilkan isolat terbaik.

Isolasi bakteri kitinolitik dari limbah pengolahan udang menghasilkan

106 isolat bakteri kitinolitik. Skrining terhadap isolat tersebut menghasilkan

strain yang memiliki aktivitas kitinolitik terbaik, yaitu Escherichia coli-inactive

KPU 2.1.8 dari famili Enterobacteriaceae. Strain tersebut dibedakan dengan

E. coli berdasarkan hasil uji biokimia, yaitu uji penggunaan laktosa,

pembentukan gas pada fermentasi monosakarida, lisin dekarboksilase,

arginin dihidrolase, dan ornitin dekarboksilase (Holt et. al 1994). Bakteri

kitinolitik dari famili Enterobacteriaceae telah banyak diteliti, antara lain

Serratia marcescens (Suzuki et al. 1999; Suzuki et al. 2002; Sǿrbotten et al.

2005), Enterobacter sp. (Dahiya et al. 2005), dan Enterobacter aerogenes

67

(Donderski & Trzebiatowska 1999). Namun penelitian bakteri kitinolitik

menggunakan E. coli sebagai materi penelitian jarang dilakukan, misalnya

Keyhani & Roseman (1997) meneliti pertumbuhan strain E. coli liar pada

medium mengandung disakarida kitin. Oleh sebab itu, penelitian ini

merupakan laporan pertama yang menyatakan strain E. coli-inactive mampu

menghasilkan enzim kitinolitik.

Bakteri E. coli merupakan bakteri yang banyak diteliti karena

digunakan sebagai host dalam rekayasa genetika pada berbagai industri

fermentasi (Crueger & Crueger 1982; Moat et al. 2002), termasuk host gen

kitinase (Patil et al. 2000). Keunggulan E. coli yang menyebabkan bakteri

tersebut digunakan sebagai host adalah kemudahan penanganan E. coli

saat proses fermentasi (Crueger & Crueger 1982). Hal tersebut antara lain

disebabkan karena E. coli dapat dengan mudah dan aman dibiakkan pada

medium sintetis serta memiliki waktu penggandaan sel yang singkat, yaitu 20

menit pada medium kaya nutrisi (Lederberg 2004). Strain E. coli-inactive

KPU 2.1.8 merupakan strain yang berpotensi sebagai penghasil enzim

kitinolitik karena, selain memiliki sifat-sifat di atas, strain tersebut telah

memiliki gen kitinase tanpa harus menjalani proses rekayasa genetika yang

rumit dan membutuhkan biaya besar.

Strain E. coli-inactive KPU 2.1.8 menghasilkan enzim kitinolitik dengan

aktivitas tertinggi pada pH 5, sehingga diduga strain tersebut memiliki pH

optimum pertumbuhan 5. Pengetahuan tentang pH pertumbuhan suatu

bakteri dapat digunakan pada proses fermentasi salah satunya sebagai

68

pencegah terjadinya kontaminasi saat proses berlangsung (Judoamidjojo et

al. 1992). Bakteri umumnya memiliki pH optimum pertumbuhan pada rentang

6,5 hingga 7,5 (Moat et al. 2002). Oleh sebab itu, pH produksi enzim

kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 yang rendah dapat mencegah

kontaminasi bakteri lain pada saat proses fermentasi berlangsung.

Strain E. coli-inactive KPU 2.1.8 memproduksi enzim kitinolitik dengan

aktivitas tertinggi pada suhu 25 oC. Menurut Raghubeer & Matches (1990)

dan Madigan et al. (1997), bakteri yang memiliki kisaran suhu pertumbuhan

antara 20 – 40 oC merupakan bakteri mesofilik. Suhu selain berpengaruh

pada pertumbuhan bakteri juga berpengaruh dalam proses fermentasi.

Umumnya proses fermentasi terjadi pada rentang suhu mesofilik (20 – 45 oC)

atau termofilik (> 45 oC). Suhu dalam proses fermentasi dipertahankan pada

suhu optimum pertumbuhan mikroorganisme dengan menggunakan sistem

pemanas/pendingin (heat/cool system) (Crueger & Crueger 1982). Semakin

tinggi suhu proses fermentasi, semakin banyak energi yang dibutuhkan untuk

menghasilkan panas agar suhu stabil. Strain E. coli-inactive KPU 2.1.8

memiliki suhu optimum produksi 25 oC, oleh sebab itu pada proses

fermentasi tidak dibutuhkan banyak energi untuk mengatur suhu sehingga

biaya produksi lebih murah.

Profil produksi enzim kitinolitik dari strain E. coli-inactive KPU 2.1.8

selama 72 jam menunjukkan bahwa strain tersebut mengalami fase lag pada

jam ke-0 hingga jam ke-12 dan fase eksponensial pada jam ke-12 hingga jam

ke-30. Setelah jam ke-30, pertumbuhan bakteri memasuki fase stasioner.

69

Enzim kitinolitik bakteri umumnya memerlukan waktu produksi 72 jam atau

lebih (Chernin et al. 1998; Zhang & Yuen 1999; Zhang et.al. 2001; Chih-Min

Wen et al. 2002; Dahiya et al. 2005), namun strain E. coli-inactive KPU 2.1.8

hanya membutuhkan waktu 30 jam. Hal tersebut menguntungkan karena

membuat waktu fermentasi kitinase apabila strain E. coli-inactive KPU 2.1.8

digunakan lebih singkat. Waktu fermentasi akan berpengaruh terhadap

produktivitas fermentasi, yaitu perbandingan antara konsentrasi produk tiap

liter dengan waktu fermentasi (Crueger & Crueger 1984), serta biaya

produksi.

Enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 menunjukkan aktivitas

optimum pada rentang pH 5 – 8. Penelitian sebelumnya menunjukkan enzim

kitinolitik dari bakteri memiliki rentang pH optimum sempit, antara lain enzim

kitinolitik Vibrio sp. 98J11027 (pH optimum 6) (Shin Hye Park et al. 2000),

Enterobacter sp. NRG4 (pH optimum 5,5) (Dahiya et al. 2005), Bacillus sp.

13.26 (pH optimum 7 – 8) (Purwani et al. 2004), Stentrophomonas maltophila

C3 (pH optimum 6) (Zhang et al. 2001), dan Pseudomonas aeruginosa (pH

optimum 4,5 – 5) (Folders et al. 2001). Nilai pH berhubungan dengan

konsentrasi ion H+ yang terdapat di dalam larutan. Konsentrasi ion tersebut

mempengaruhi kondisi ionik asam-asam amino penyusun enzim, sehingga

mempengaruhi konformasi enzim saat melakukan aktivitas katalitik (Segel

1975). Umumnya enzim aktif pada rentang pH optimum yang sempit

sehingga sensitif terhadap perubahan pH lingkungan, oleh sebab itu

dibutuhkan pengaturan pH (pH tuning) ketika enzim tersebut akan

70

diaplikasikan (Gupta & Roy 2004). Hal tersebut membuat rentang pH

optimum enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 yang luas (5 – 8)

menguntungkan dalam aplikasi sebab enzim tersebut tetap aktif walau

kondisi pH lingkungan mengalami perubahan.

Karakterisasi suhu aktivitas menunjukkan enzim kitinolitik E. coli-

inactive KPU 2.1.8 memiliki suhu optimum 40 hingga 55oC dan mampu

mempertahankan aktivitas di atas 50% saat terpaparkan pada suhu 40oC

selama enam jam, suhu 45oC selama empat jam, dan suhu 50oC selama satu

jam. Enzim kehilangan aktivitas hingga 99% setelah pemaparan pada suhu

55oC selama satu jam. Enzim kitinolitik lain yang telah dikarakterisasi

umumnya memiliki rentang suhu aktivitas di atas 40 oC, yaitu enzim kitinolitik

Vibrio sp. 98CJ11027 (45 oC) (Shin Hye Park et al. 2000), Enterobacter sp.

NRG4 (45 oC) (Dahiya et al. 2005), Bacillus sp. 13.26 (60 oC) (Purwani et al.

2004), Stentrophomonas maltophila C3 (50 oC) (Zhang et al. 2001), dan

Pseudomonas aeruginosa (50 oC) (Folders et al. 2001). Aktivitas enzim

kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 berada pada rentang enzim termofilik (40

– 70 oC). Enzim termofilik memiliki stabilitas yang tinggi terhadap suhu

sehingga memudahkan preparasi dan penanganan pada aplikasinya (Cowan

1995).

Pengujian pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim kitinolitik E.

coli-inactive KPU 2.1.8 menunjukkan ion Fe2+ meningkatkan aktivitas enzim

kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 sebesar 12.1% pada konsentrasi 1 mM

dan 17% pada konsentrasi 5 mM, sedangkan ion-ion Zn2+, Ca2+, dan Mn2+

71

meningkatkan aktivitas enzim sebesar 17.8, 11, dan 14.7% pada konsentrasi

5 mM. Ion Cu2+ menghambat aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU

2.1.8 sebesar 25.3 dan 43.6% pada konsentrasi 1 dan 5 mM, sedangkan

EDTA menghambat aktivitas enzim tersebut sebesar 59.1% pada konsentrasi

5 mM. Hasil tersebut menunjukkan bahwa enzim kitinolitik E. coli-inactive

KPU 2.1.8 cenderung tahan terhadap ion-ion logam dan hanya dihambat oleh

Cu2+ dan EDTA. Tembaga (Cu) merupakan suatu logam berat yang jarang

ditemukan di lingkungan kecuali pada lingkungan yang telah tercemar limbah

pabrik (Darmono 1995), sedangkan Ethylene Diamine Tetra Acetate (EDTA)

merupakan senyawa kimia yang banyak di gunakan di laboratorium Kimia

dan Biologi sebagai chelator agent (Erdem et al. 2001). Oleh sebab itu,

aplikasi enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 tidak membutuhkan

lingkungan yang diatur konsentrasi ion-ionnya secara khusus karena Cu2+

dan EDTA jarang ditemukan di lingkungan secara alami.

72

RANGKUMAN KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN

1. Sebanyak 106 isolat bakteri kitinolitik berhasil diisolasi dari limbah

pengolahan udang. Sampel dari rumah makan menghasilkan isolat lebih

banyak (65 isolat) dibandingkan isolat dari sampel pabrik pengolahan

udang (41 isolat). Sedangkan sampel kepala udang menghasilkan isolat

lebih banyak (60 isolat) dibandingkan dengan isolat dari sampel kulit

udang (46 isolat).

2. Skrining medium padat menghasilkan tujuh isolat dengan IK > 2: KLU

1.1.16 (2,58 ± 0,52), KPU 2.1.24 (2,53 ± 0,29), KLU 1.1.5 (2,44 ± 0,17),

KPU 2.1.8 (2,39 ± 0,31), KPU 2.1.23 (2,27 ± 0,02), KLU 1.1.6 (2,21 ±

0,19), dan KLU 1.1.21 (2,18 ± 0,4).

3. Isolat KPU 2.1.8 menunjukkan aktivitas tertinggi (0,134 ± 0,004 U/mg) dan

pada waktu tercepat (24 jam) dibandingkan keenam isolat terpilih lainnya

pada skrining medium cair.

4. Isolat KPU 2.1.8 diidentifikasi sebagai strain Escherichia coli-inactive

menggunakan Microbact Identification System 12E/A.

5. Strain KPU 2.1.8 memproduksi enzim kitinolitik pada pH optimum 5 serta

suhu optimum 25 oC. Produksi enzim kitinolitk dari strain KPU 2.1.8 hanya

dapat diinduksi oleh substrat koloidal kitin. Waktu pemanenan terbaik

73

pada produksi enzik kitinolitik dari strain KPU 2.1.8 pada jam produksi ke-

30.

6. Enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 memiliki aktivitas optimum pada

rentang pH 5 – 8.

7. Aktivitas optimum enzim kitinolitik ditunjukkan pada rentang suhu 40 – 55

oC. Enzim tersebut mampu mempertahankan aktivitas residunya di atas

50% apabila terpapar selama enam jam pada suhu 40 oC, empat jam

pada suhu 45 oC, dan satu jam pada suhu 50 oC. Aktivitas residu enzim

hilang setelah inkubasi selama satu jam pada suhu 55 oC.

8. Ion Fe2+ meningkatkan aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8

sebesar 12.1% pada konsentrasi 1 mM dan 17% pada konsentrasi 5 mM.

Ion-ion Zn2+, Ca2+, dan Mn2+ meningkatkan aktivitas enzim sebesar 17.8,

11, dan 14.7% pada konsentarsi 5 mM.

9. Ion Cu2+ mampu menghambat aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive

KPU 2.1.8 sebesar 25.3% pada konsentrasi 1mM dan 43.6% pada

konsentrasi 5 mM. Sedangkan EDTA menghambat aktivitas enzim

tersebut sebesar 59.1% pada konsentrasi 5 mM.

SARAN

Perlu dilakukan purifikasi serta penentuan karakteristik enzim kitinolitik

E. coli-inactive KPU 2.1.8, seperti berat molekul, struktur protein, urutan asam

amino, nilai Km, nilai Vmax, dan substrat spesifik enzim tersebut.

74

DAFTAR ACUAN

Bade, M.L. & K. Hickey. 1989. Classification of enzymes hydrolizing chitin.

Dalam: Skjak-Brǽk, G., T. Anthonsen & P. Sandford (eds). 1989.

Chitin and chitosan. Elsevier Science Pub. Ltd., London: xxii + 835

hlm.

Berkenheger, I. & U. Fischer. 2004. Competition for polymers among

heterotrophic bacteria, isolated from particles of the Equatorial Atlantic.

International Microbiology 7: 13 – 18.

Bishop, J.G., A. M. Dean & T. Mitchell-Olds. 2000. Rapid evolution in plant

chitinases: Molecular targets of selection in plant-pathogen

coevolution. Proceeding of the National Academy of Science 97(10):

5322 – 5327.

Boot, R.G., E.F.C. Blommaart, E. Swart, K.G. van der Vlugt, N. Bijl, C. Moe,

A. Place & J.M.F.G. Aerts. 2001. Identification of a novel acidic

mammalian chitinase distinct from chitotriosidase. The Journal of

Biological Chemistry 276(9):6770–6778.

Cabib, E., S.J. Silverman, J.A. Shaw, S.D. Gupta, Hee-Moon Park, J.T.

Mullins , P.C. Mol & B. Bowers. 1991. Carbohydrates as structural

constituents of yeast cell wall and septum. Pure & Applied Chemistry

63(4): 483 – 489.

Cowan, D.A. 1995. Hyperthermophilic enzymes: biochemistry and

biotechnology. Dalam: Parson, L. M., C.L. Walker & D.R. Dixon. (eds).

75

1995. Hydrothermal Vents and Processes. Geological Society Special

Publication No. 87, London: 351 – 363.

Chernin, L.S, Z. Ismailov, S. Haran & I. Chet. 1995. Chitinolytic Enterobacter

agglomerans antagonistic to fungal plant pathogens. Applied and

Environmental Microbiology 61(5): 1720 –1726.

Chien-Jui Huang, Tang-Kai Wang, Shu-Chun Chung & Chao-Ying Chen.

2005. Identification of an antifungal chitinase from a potential

biocontrol agent, Bacillus cereus 28-9. Journal of Biochemistry and

Molecular Biology 38(1): 82 – 88.

Chih-Min Wen, Chien-Sheng Tseng, Chih-Yu Cheng & Yaw-Kuen Li. 2002.

Purification, characterization and cloning of a chitinase from Bacillus

sp. NCTU2. Biotechnology and Applied Biochemistry 35: 213 – 219.

Crueger, W. & A. Crueger. 1982. Industrial microbiology. Terj. dari Lehrbuch

der angewandten mikrobiologie, oleh Haessly, C. Science Tech, Inc.,

Wisconsin: x + 308 hlm.

Dahiya, N., R. Tewari, R.P. Tiwari & G.S. Hoondal. 2005. Chitinase from

Enterobacter sp. NRG4: Its purification, characterization and reaction

pattern. Electronic Journal of Biotechnology 8(2): 134 – 145.

Darmono. 1995. Logam dalam system biologi makhluk hidup. UI-Press,

Jakarta: x + 140 hlm.

Donderski, W. & M. S. Brzezinska. 2003. The utilization of N-

acetyloglucosamine and chitin as sources of carbon and nitrogen by

76

planktonic and benthic bacteria in Lake Jeziorak. Polish Journal of

Environmental Studies 12(6): 685 – 692.

Donderski, W. & M. Trzebiatowska. 1999. Chitinase activity production by

planktonic, benthic and epiphytic bacteria inhabiting the Moty Bay of

the Jeziorak Lake (Poland). Polish Journal of Environmental Studies

8(4): 215 – 220.

Elango, N., J.U. Correa & E. Cabib. 1982. Secretory character of yeast

chitinase. The Journal of Biological Chemistry 257(3): 1398 –1400.

Erdem, A., D. Özkan, B. Meriç, K. Kerman & M. Özsöz. 2001. Incorporation of

EDTA for the Elimination of Metal Inhibitory Effects in an Amperometric

Biosensor Based on Mushroom Tissue Polyphenol Oxidase. Turkish

Journal of Chemistry 25: 231 – 239.

Escott, G.M. & D.J. Adams. 1995. Chitinase activity in human serum and

leukocytes. Infection and Immunity 63(12): 4770 – 4773.

Folders, J., J. Algra, M.S. Roelofs, L.C. van Loon, J. Tommassen & W. Bitter.

2001. Characterization of Pseudomonas aeruginosa chitinase, A

gradually secreted protein. Journal of Bacteriology 183(24): 7044 –

7052.

Gohel, V., A. Singh, M. Vimal, P. Ashwini & H.S. Chhatpar. 2006.

Bioprospecting and antifungal potential of chitinolytic microorganisms.

African Journal of Biotechnology 5(2): 54 – 72.

Gooday, G.W. 1989. Control and inhibition of chitin synthesis in Fungi and

nematods. Dalam: Skjak-Brǽk, G., T. Anthonsen & P. Sandford (eds).

77

1989. Chitin and chitosan. Elsevier Science Pub. Ltd., London: xxii +

835 hlm.

Gooday, G.W. 1990. The ecology of chitin degradarion. Dalam: Marshall, K.C.

(ed). 1990. Advances in Microbial Ecology. Plenum Press, New York:

387 – 430.

Gupta. M.N. and I. Roy. 2004. Enzymes in organic media: Forms, functions

and applications. European Journal of Biochemistry 271: 2575 – 2583.

Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley & S.T. Williams. 1994.

Bergey’s manual of determinative bacteriology. 9th ed. Williams &

Wilkins, Baltimore: xviii + 787 hlm.

Jeuniaux. C., M-F. Voss-Foucart, M. Poulicek & J-C. Bussers. 1989. Sources

of chitin, estimated from new data on chitin biomass and production.

Dalam: Skjak-Brǽk, G., T. Anthonsen & P. Sandford (eds). 1989.

Chitin and chitosan. Elsevier Science Pub. Ltd., London: xxii + 835

hlm.

Johnson, D.E. 1931. Some observation on chitin-destroying bacteria. Journal

Series of the Minnesota Agricultural Experiment Station 1053: 335 –

340.

Judoamidjojo, M., A.A. Darwis & E.G. Sa’id. 1992. Teknologi fermentasi.

Rajawali Press, Jakarta: viii + 334 hlm.

Keyhani, N.O. & S. Roseman. 1997. Wild-type Escherichia coli grows on the

chitin disaccharide, N,N’-diacetylchitobiose, by expressing the cel

78

operon. Proceeding of the National Academy of Science 94: 14367 –

14371.

Lederberg, J. 2004. E. coli K-12. Microbiology Today 31: 116.

Madigan, M.T., J.M. Martinko & J. Parker. 1997. Brock biology of

microorganism. 8th ed. Prentice Hall International, Inc., London: xviii +

1038 hlm.

Merzendorfer, H. & L. Zimoch. 2003. Chitin metabolism in insects: structure,

function and regulation of chitin synthases and chitinases. The Journal

of Experimental Biology 206: 4393 – 4412.

Moat, A.G., J.W. Foster & M.P. Spector. 2002. Microbial physiology. 4th ed.

Willey-Liss, Inc., New York: xx + 715 hlm.

Nasution, Z., Tazwir & D.S. Zilda. 2004. Potensi, pemanfaatan dan nilai

ekonomi limbah udang dan rajungan di propinsi Lampung. Warta

Penelitian Perikanan Indonesia 10(7): 2 – 5.

Patil, R.S., V. Ghormade & M.V. Deshpande. 2000. Chitinolytic enzymes: An

exploration. Enzyme and Microbial Technology 26: 473 – 483.

Purwani, E.Y., M.T. Suhartono, Y. Rukayadi, Jae Kwan Hwang & Yu Ryang

Pyun. 2004. Characteristics of thermostable chitinase enzymes from

the Indonesian Bacillus sp. 13.26. Enzyme and Microbial Technology

35: 147 – 153.

Raghubeer, E.V. & J.R. Matches. 1990. Temperature range for growth of

Escherichia coli serotype 0157:H7 and selected coliforms in E. coli

medium. Journal of Clinical Microbiology 28(4): 803 – 805.

79

Sakai, K., A. Yokota, H. Kurokawa, M. Wakayama & M. Moriguchi. 1998.

Purification and Characterization of Three Thermostable

Endochitinases of a Noble Bacillus Strain, MH-1, Isolated from Chitin-

Containing Compost. Applied and Enviromental Microbiology 64(9):

3397 – 3402.

Sandford, P.A. 1989. Chitosan: Comercial uses & potential application.

Dalam: Skjak-Brǽk, G., T. Anthonsen & P. Sandford (eds). 1989.

Chitin and chitosan. Elsevier Science Pub. Ltd., London: xxii + 835

hlm.

Segel, I.H. 1975. Enzyme kinetics: Behavior and analysis of rapid equilibrium

and steady state enzyme system. John Wiley & Sons, Inc., New York:

xxii + 957 hlm.

Shahidi, F., J.K.V. Arachi & Y.J. Jeon. 1999. Food applications of chitin and

chitosan. Trends in Food Science & Technology 10: 37 – 51.

Shin Hye Park, Jung-Hyun Lee & Hong Kum Lee. 2000. Purification and

characterization of chitinase from a marine bacterium, Vibrio sp.

98CJ11027. The Journal of Microbiology 38(4): 224 – 229.

Sørbotten, A., S.J. Horn, V.G.H. Eijsink & K.M. Vårum. 2005. Degradation of

chitosans with chitinase B from Serratia marcescens: Production of

chito-oligosaccharides and insight into enzyme processivity. FEBS

Journal 272: 538 – 549.

Suzuki, K., M. Taiyoji, N. Sugawara, N. Nikaidou, B. Henrissat & T.

Watanabe. 1999. The third chitinase gene (chiC) of Serratia

80

marcescens 2170 and the relationship of its product to other bacterial

chitinases. Biochemistry Journal 343: 587 – 596.

Suzuki, K., N. Sugawara, M. Suzuki, T. Uchiyama, F. Katouno, N. Nikaidou &

T. Watanabe. 2002. Chitinase A, B, and C1 of Serratia marcescens

2170 produced by recombinant Escherichia coli: Enzymatic properties

and synergism on chitin degradation. Bioscience of Biotechnology and

Biochemistry 66(5): 1075 – 1083.

Vogan, C.L., C. Costa-Ramos & A.F. Rowley. 2002. Shell disease syndrome

in the edible crab, Cancer pagurus – isolation, characterization and

pathogenicity of chitinolytic bacteria. Microbiology 148: 743 – 754.

Yu, C., A.M. Lee, B. L. Bassler & S. Roseman 1991. Chitin utilization by

marine bacteria: A physiological function for bacterial adhesion to

immobilized carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry

266(36): 24260 – 24267.

Zhang, Z. & G.Y. Yuen. 2000. The role of chitinase production by

Stenotrophomonas maltophilia strain C3 in biological control of

Bipolaris sorokiniana. Phytopathology 90(4): 384 – 389.

Zhang, Z., G.Y. Yuen, G. Sarath & A.R. Penheiter. 2001. Chitinases from the

plant disease biocontrol agent, Stenotrophomonas maltophilia C3.

Phytopathology 91(2): 204 – 211.