-
TEKNIK PEWARNAAN
-
PendahuluanPengamatan mikroorganisme sulit:Berukuran kecilTransparan/tidak berwarna ketika disuspensikan dalam media cairPerlu dikembangkan teknik pewarnaan untuk memudahkan dalam:Pengamatan morfologi mikroorganismePengidentifikasian bagain-bagian struktural sel mikroorganisme
-
Faktor Penentu Keberhasilan Dalam Teknik PewarnaanPenempatan olesan, atau lapisan tipis spesimen pada kaca objekFiksasi olesan pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, menyebabkan mikroorganisme melekat pada kaca objekAplikasi pewarna yang digunakan (pewarnaan sederhana atau differensial)
-
Prinsip Dasar PewarnaanSecara kimiawi zat pewarna (stain/dye) yang digunakan dalam pewarnaan berupa senyawa organik yang mengandung kromogen+AuksokromKromogen: senyawa berwarna yang terbentuk atas benzen (senyawa organik yang tidak berwarna)+ kromofor (senyawa yang mampu membentuk warna jika bereaksi dengan benzen)Auksokrom Senyawa kimia yang dapat mengubah ionisasi dari kromogenMenjadikan kromogen membentuk garam dan dapat berikatan dengan serat atau jaringan
-
Prinsip Dasar Pewarnaan Kemampuan zat pewarna (stain) dalam berikatan dengan komponen selular makromolekul seperti protein atau asam nukleat sangat bergantung pada muatan listrik kromogen serta komponen selular yang akan diwarnai.Dikenal ada dua jenis zat pewarna:Pewarna asam (acidic stains)Pewarna basa (basic stains)
-
Pewarna Asam (acidic stains)Bersifat anionikIonisasi stain membentuk kromogen bermuatan negatifMemiliki afinitas yang kuat terhadap struktur sel yang bermuatan positif, seperti proteinTidak terikat pada sel bakteri hanya mewarnai latar blakang.Contoh Picric acid, eosin dan fuchsin acid
-
Pewarna basa (basic stains)Bersifat kationikIonisasi stain membentuk kromogen bermuatan positifMemiliki afinitas yang kuat terhadap struktur sel yang bermuatan negatif, seperti asam nukleatContoh methylene blue
-
Macam-macam teknik pewarnaanPewarnaan sederhana (simple staining)Pewarnaan differensial (differential staining):Pewarnaan gramPewarnaan tahan asamPewarnaan khususPewarnaan kapsulPewarnaan sporaPewarnaan flagela
-
Pewarnaan Sederhana (simple staining)Pewarnaan yang hanya menggunakan zat pewarna tunggalMenggunakan zat pewarna basa (mengandung kromogen kationik)Digunakan untuk mewarnai asam nukleat dan komponen dinding sel bakteri (bermuatan negatif)Bertujuan untuk mengamati morfologi dan penataan sel bakteriZat pewarna yang digunakan: methylene blue, crystal violet, dan carbol fuchsin
-
Pewarnaan differensial (differential staining)Pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu zat pewarnaPewarna terbagi menjadi dua macam: pewarna utama (primary dye) dan pewarna tandingan (counterstain)Digunakan untuk menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
-
Pewarnaan GramDikembangkan pertama kali oleh Hans Christian Gram pada tahun 1884Pewarna yang digunakan:Ungu kristal (pewarna utama), iodium gram (mordan), alkohol 95 % (pemucat), safranin (pewarna tandingan)Intepretasi hasil:Gram positif: mampu menahan pewarna utama meskipun telah dipucatkan dengan alkohol, serta pemberian warna tandingan.Organisme berwarna ungu-hitam (warna kristal violet)Gram negatif: tidak mampu menahan pewarna utama, serta mampu terwarnai dengan pewarna tandingan setelah pemucatan.Organisme berwarna merah (warna safranin)
-
Pewarnaan Gram
-
Pewarnaan Gram Determinasi gram + dan disebabkan adanya perbedaan struktur dan komposisi dinding sel pada masing-masing kelompok.Gram mengandung lipid, lemak dalam prosentase yang lebih besar dibandingkan dengan gram +. Dinding sel bakteri gram juga lebih tipis dibandingkan dengan bakteri gram +.Etanol mampu mengekstraksi pewarna utama pada bakteri gram
-
Pewarnaan Gram
-
Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Stain)Beberapa spesies tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, contohnya genus MycobacteriumHal ini disebabkan komposisi dinding sel yang mengandung lipid yang tebal sehingga menyulitkan pewarna biasa untuk dapat melakukan penetrasi pewarnaan.Pewarna yang digunakan:Karbol fuchsin (pewarna utama), metilen biru (pewarna tandingan), alkohol asam (3 % HCl + 95 % etanol) sebagai pemucat.Proses pewarnaan dilakukan dengan pemanasan atau tanpa pemanasan (penambahan turgitol/wetting agent)
-
Intepretasi hasil:Bakteri tahan asam: mampu menahan pewarna utama meskipun telah dilakukan pemucatan terhadap asam alkoholBakteri berwarna merah keunguanBakteri tak tahan asam: mampu dipucatkan oleh alkohol asam, dan menerima pewarna tandingan.Bakteri berwarna biruPewarnaan Tahan Asam
-
Pewarnaan tahan asam
-
(Pewarnaan Khusus)Pewarnaan KapsulKapsul merupakan bagian dari struktur sel bakteri yang berupa lapisan luar yang bergelatinKapsul mengandung polisakarida, glikoprotein dan polipeptida.Tidak semua bakteri memililki kapsulUmumnya keberadaan kapsul mengindikasikan virulensiPewarna yang digunakan:Kristal violet 1 % (pewarna utama); tembaga sulfat 20 % (pemucat dan pewarna tandingan)Tidak ada perlakuan pemanasan
-
Pewarnaan Kapsul
-
Pewarnaan SporaEndospora: Bentuk dormansi bakteriStruktur yang resisten:Panas, radiasi, dingin, asam, desinfektan kimiawiPerebusan > 1 jam tetap viabelMembutuhkan energi dan waktu untuk membentuk sporaPewarnaan spora: menentukan lokasi yang menjadi dasar klasifikasi sentral, subterminal,terminalStruktur:Spore coatCortexCore (Spore protoplast)
-
Komponen penyusun inti endosporaAir dalam konsentrasi yang rendahSmall acid-soluble spore proteins (SASPs):Melindungi DNA dari radiasi UV, pengeringan & pemanasanSumber karbon & energi untuk pembentukan sel vegetatif baru (germinasi)Pewarnaan Spora lanjutan
-
Pewarna yang digunakan:Hijau malakit (pewarna utama), Safranin (pewarna tandingan), air (pemucat)Perlu pemanasan ketika pemberian warnaIntepretasi hasil:Spora akan berwarna hijau (hijau malakit), sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah (safranin)Pewarnaan Spora lanjutan
-
Pewarnaan Spora lanjutan
-
Pewarnaan FlagelDigunakan untuk mewarnai flagel sehingga dapat diamati keberadaan, jumlah, dan penataan flagel pada bakteri.Penataan flagel akan membantu dalam identifikasi bakteri.Untuk mewarnai flagel dibutuhkan teknik pewarnaan yang khusus.Diperlukan bahan tertentu yang dapat melapisi flagel bakteri, sehingga dapat menambah ketebalan flagel.Pewarna selanjutnya akan mewarnai bahan pelindung tersebut.
-
Pewarnaan flagel
-
Pewarnaan NegatifDigunakan untuk mengamati morfologi dan penataan bakteriPewarna yang digunakan berupa pewarna asam seperti tinta india atau nigrosin.Pewarna asam tidak akan mewarnai sel, karena permukaan sel bakteri yang bermuatan negatifBakteri tidak berwarna, sedangkan latar belakangnya akan berwarna gelapContoh : Pewarnaan kapsul
-
Pewarnaan Negatif
-
SEMOGA BERMANFAAT
