Técnicas para evaluar Inmunodeficiencias

Técnicas para evaluar Técnicas para evaluar InmunodeficienciasInmunodeficiencias

Inmunología Aplicada 1065Inmunología Aplicada 1065Carolina Hernández Martínez Carolina Hernández Martínez Formación de profesores 2005Formación de profesores 2005

Supervisado por Ma. Dolores LastraSupervisado por Ma. Dolores Lastra

Biometría HemáticaBiometría HemáticaNúmero total de eritrocitos, plaquetas, linfocitos, Número total de eritrocitos, plaquetas, linfocitos, monocitos y granulocitos.monocitos y granulocitos.

Linfocitos B: CD18,CD19, CD20, CD21, CD22, Linfocitos B: CD18,CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD43, CD44CD23, CD25, CD43, CD44

Linfocitos T: CD3, CD4, CD8, CD18, CD25, Linfocitos T: CD3, CD4, CD8, CD18, CD25, CD43, CD44CD43, CD44

Células NK: CD56, CD16, CD18, CD43, CD44Células NK: CD56, CD16, CD18, CD43, CD44 Neutrófilos: CD11a, CD63Neutrófilos: CD11a, CD63 Monocitos-Macrófagos: CD14, CD18, CD23, Monocitos-Macrófagos: CD14, CD18, CD23,

CD25, CD43, CD44CD25, CD43, CD44

Función de las células TFunción de las células T

Pruebas cutáneas de hipersensibilidad Pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada.retardada.

Estudios funcionales in vitro.Estudios funcionales in vitro.

Respuesta linfoproliferativa. Respuesta linfoproliferativa.

Produción de mediadores: citocinas.Produción de mediadores: citocinas.

Citotoxicidad T CD8+.Citotoxicidad T CD8+.

Citotoxicidad NK.Citotoxicidad NK.

Prueba de hipersensibilidad retardada

Respuesta linfoproliferativaRespuesta linfoproliferativa

Consiste en cultivar linfocitos del paciente Consiste en cultivar linfocitos del paciente con los antígenos que quieren ser con los antígenos que quieren ser evaluados o estudiados y con varios evaluados o estudiados y con varios mitógenos que se utilizan como control de mitógenos que se utilizan como control de la inmunoproliferación (estimulación no la inmunoproliferación (estimulación no específica). La transformación blástica específica). La transformación blástica específica se mide por la capacidad que específica se mide por la capacidad que tiene el antígeno de inducir la proliferación tiene el antígeno de inducir la proliferación linfocitaria.linfocitaria.

Rosetas con los eritrocitos

Los linfocitos T presentan la característica de formar rosetas cuando se unen a los eritrocitos de carnero . Se pueden cuantificar los linfocitos T incubándolos con eritrocitos de carnero (reconocimiento de moléculas CD2+ y CD58+) y la posterior observación al microscopio se numeran las rosetas (entre 70 y 80% positivas en pacientes normales).

ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS LINFOCITOS T (CD 8+)LINFOCITOS T (CD 8+)

La actividad citotóxica de los linfocitos T La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+) frente a una célula blanco se (CD 8+) frente a una célula blanco se puede estudiar, midiendo la capacidad de puede estudiar, midiendo la capacidad de destrucción, que un determinado número destrucción, que un determinado número de linfocitos T tienen para destruir un de linfocitos T tienen para destruir un determinado número de células blanco, al determinado número de células blanco, al estar ambas poblaciones en contacto. Se estar ambas poblaciones en contacto. Se puede medir mediante la liberación de Crpuede medir mediante la liberación de Cr5151 por las células blanco previamente por las células blanco previamente marcadas.marcadas.

Citotoxicidad NKCitotoxicidad NK

En esta prueba se mide la capacidad de En esta prueba se mide la capacidad de estas células para matar células blanco estas células para matar células blanco especiales (K562). La citotoxicidad suele especiales (K562). La citotoxicidad suele determinarse mediante el uso de Crdeterminarse mediante el uso de Cr5151..

Por citometría de flujo se determina la Por citometría de flujo se determina la actividad de estas células utilizando los actividad de estas células utilizando los marcadores específicos.marcadores específicos.

Subpoblaciones de TSubpoblaciones de T

Mediante anticuerpos monoclonales se Mediante anticuerpos monoclonales se pueden marcar las diferentes poblaciones pueden marcar las diferentes poblaciones linfocitarias:linfocitarias:

Linfocitos Th: CD4+Linfocitos Th: CD4+

Linfocitos Tc: CD8+Linfocitos Tc: CD8+

Las mediciones obtenidas se indican en Las mediciones obtenidas se indican en porcentajes de cada población.porcentajes de cada población.

Se pueden utilizar otros marcadores.Se pueden utilizar otros marcadores.

Evaluación de la Fagocitosis

Índice Fagocítico.Índice Fagocítico. Determina la Determina la capacidad de fagocitar de los leucocitos, capacidad de fagocitar de los leucocitos, pero no el poder para digerir las partículas pero no el poder para digerir las partículas fagocitadas.fagocitadas.

Actividad bactericida.Actividad bactericida. Complementa la Complementa la prueba anterior y determina si las prueba anterior y determina si las bacterias fagocitadas son o no destruidas bacterias fagocitadas son o no destruidas por las lisozimas de los fagosomas de los por las lisozimas de los fagosomas de los leucocitos.leucocitos.

Prueba del NBT

Es posible observar la Es posible observar la reducción del reducción del nitroazul de tetrazolio nitroazul de tetrazolio (NBT) debido a que (NBT) debido a que éste acepta un éste acepta un protón, cambiando su protón, cambiando su típica coloración típica coloración amarilla transparente amarilla transparente por un azul intens por un azul intens (azul formazán).(azul formazán).

Prueba de la reducción de Prueba de la reducción de dihidrorodamina (DHR).dihidrorodamina (DHR).

Los fagocitos reducen el DHR a un Los fagocitos reducen el DHR a un compuesto fluorescente en individuos compuesto fluorescente en individuos sanos. Al no haber presencia de sanos. Al no haber presencia de fluorescencia se suele tratar de una EGC fluorescencia se suele tratar de una EGC ligada al X, pero con presencia en bajas ligada al X, pero con presencia en bajas cantidades, hablamos usualmente de una cantidades, hablamos usualmente de una AR. AR.

Se basa en la cuantificación de la Se basa en la cuantificación de la hemoglobina liberada por los eritrocitos hemoglobina liberada por los eritrocitos que han sido fagocitados utilizando un que han sido fagocitados utilizando un espectrofotómetro.espectrofotómetro.

En una placa, se colocan una En una placa, se colocan una concentración conocida de macrófagos concentración conocida de macrófagos del paciente en seis pozos, se incuban. Se del paciente en seis pozos, se incuban. Se coloca SRBC opsonizados (es decir, coloca SRBC opsonizados (es decir, unidos al complemento o IgG) y sin unidos al complemento o IgG) y sin opsonizar, se incuban.opsonizar, se incuban.

Se añade el sustrato y se mide la Se añade el sustrato y se mide la absorbanciaabsorbancia..

EritrofagocitosisEritrofagocitosis

Eritrofagocitosis Eritrofagocitosis

Ventana cutánea de Rebuck.Ventana cutánea de Rebuck.

Normalmente se presenta un acúmulo de PMN Normalmente se presenta un acúmulo de PMN en las primeras 6 horas, después es sustituido en las primeras 6 horas, después es sustituido por uno de linfocitos (poco utilizada).por uno de linfocitos (poco utilizada).

QuimiotaxiaQuimiotaxia

Se basan en medir Se basan en medir la locomoción la locomoción direccional de los direccional de los neutrófilos hacia neutrófilos hacia diversos estímulos diversos estímulos quimiotácticos: quimiotácticos: Cámara de Cámara de Boyden.Boyden.

QuimioluminiscenciaQuimioluminiscencia Los neutrófilos emiten pequeñas Los neutrófilos emiten pequeñas

cantidades de radiación electromagnética cantidades de radiación electromagnética después de la ingestión de después de la ingestión de microorganismos. microorganismos. Durante la explosión Durante la explosión respiratoria se genera oxígeno molecular respiratoria se genera oxígeno molecular (inestable y muy reactivo) se combina con (inestable y muy reactivo) se combina con bacterias u otros elementos bacterias u otros elementos intralisosómicos formando grupos intralisosómicos formando grupos carboxilo de inestabilidad electrónica. carboxilo de inestabilidad electrónica. Cuando estos grupos regresan a su Cuando estos grupos regresan a su estado basal, emiten energía lumínica.estado basal, emiten energía lumínica.

Evaluación General de la Inmunidad Mediada por AnticuerposMétodos Inmunológicos utilizados para identificar

anormalidades fenotípicas y defectos genéticos y moleculares

Evaluación fenotípica Concentración de Inmunoglobulinas en suero Subclases de IgG Anticuerpos específicos Anticuerpos antiproteínas Anticuerpos contra tétanos y difteria Anticuerpos contra H influenza Anticuerpos antipolisacárido Isohematoaglutininas Anticuerpos contra el polisacárido del neumococo Anticuerpos antibacteriófago Enumeración Células B (poca aplicación) Evaluación de la función de células T Evaluación de defectos genéticos y moleculares Detección de defectos moleculares en células B y T Identificación de anormalidades genéticas

Pruebas para células BPruebas para células B

• Proteínas (Electroforesis)• IgA,IgE• Isohematoaglutininas AB (IgM)• Anticuerpos antitoxoide tetánico (función IgM)• Anticuerpos antitoxoide diftérico (función IgG)• Anticuerpos anti candida • Anticuerpos anti pneumococo • Antígeno CD20 (función de células B)• Subclases de IgG