Rekayasa Genetika

Rekayasa genetikaKloning Gen

Untuk mempelajari kloning gen dibutuhkan pengetahuan tentangkonsep biologi molekuler dan penggunaan tehnik-tehnik dalam

laboratorium

Teknologi DNA telah meluncurkan revolusidalam bidang bioteknologi yaitu manipulasiorganisme atau komponen organisme untukmelakukan tugas tugas praktis untukmenghasilkan produk yang bermanfaat.

Semuanya melibatkan para peneliti daribidang a.l; biologi, mikrobiologi, biologimolekuler,dan para teknisi peralatan untukmenunjang kerja para peneliti.

KEMAMPUAN YANG DIPEROLEH DARI REKAYASA GENETIKA

Teknik ini menjanjikan berbagai kemampuan karena :

Cepat

Dapat diterapkan secara universal

Dapat dilakukan pengendalian yang ketatterhadap proses manipulasi

Dapat membentuk berbagai kombinasi genetikbaru yang belum diseleksi sebelumnya denganmetode laboratorium

Cara / Garis besar kloning gen :

1. Membuka sel hidup. Untuk ini terdapat beberapa cara,yang popular adalah dengan memblender sel dankemudian menambahkan deterjen ( untuk sel mamalia ).

2. Mengambil informasi genetic ( DNA ) dari sel. Karena molekul DNA ratusan kali lebih panjang dari molekul lain dalam sel, maka tehnik pemurnian DAN mudah dikembangkan.

3. Salah satu metodanya adalah dengan menggulung DNApada sebatang gelas. Batang gelas yang membawa DNAkemudian diangkat dari campuran sel-sel pecah, dengancara seperti kita mengangkat bakmi dengan sumpit.

4. Memotong gen khusus yang diinginkan.

Metode ini dilakukan dengan cara seperti meng -edit film. Seperti halnya film, DNA juga terdiri atas frame untuk menunjukkan urutan yang tepat. Dalam DNA frame ini merupakan susunan huruf kode genetik. Bila frame-frame ini disusun pada kombinasi tertentu, akan menjadi cerita pada film atau menjadi DNA pada gen. Gunting molekuler untuk memotong DNA adalah suatu enzim yang disebut restriction enzym ( enzim pemotong ).

5. Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam perantara yang

disebut cloning vehicles yang akan membawa potongan DNA ke dalam sel hidup lain.

o. Cloning vehicles adalah molekul DNA yang relatif pendek yang

dapat memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel.

o. Menempatkan gen khusus pada kloning vehicle mi rip seperti

menyambung adegan cerita dalam film pendek.

o. Proses penyambungan menghasilkan chimeric DNA molekul

( molekul DNA kimera ), Sebagian adalah gen khusus dan

bagian lainnya adalah gen dari cloning vehicle tersebut.

o. Molekul DNA tersebut juga disebut recombinant DNA molekul

( molekul DNA rekombinan).

Cloning vehicle yang mengandung potong-an khusus DNA tadi dimasukkan ke dalam sel inang yang biasanya adalah organisme sel tunggal ( seperti bakteri atau ragi ).

membiarkan sel inang untuk memperbanyak diri membentuk klon dengan kandungan bermilyar milyar sel yang identik.

Pada umumnya kloning sederhana dari sepotong DNA berlangsung baik. Seperti halnya film yang menjadi berguna setelah diproyeksikan. Demikian juga informasi dalam DNA yang harus dirubah kedalam produk yang berguna.

Untuk membuat produk, informasi dalam DNA ditransfer dari gen ke tempat molekul protein diproduksi.

Pembuatan produk berdasar informasi yang disimpan dalam DNA disebut ekspresi gen.

Yang harus kita ketahui, protein adalah rangkaian molekul yang terdiri dari ratusan mata rantai asam nukleat.

Suatu tipe dari fungsi protein sebagai balok penyusun struktur sel, dan tipe lain yang berfungsi untuk mengontrol reaksi-reaksi kimia dalam sel.

Sebelumnya, insulin didapatkan dengan cara memurnikan protein pankreas sel hewan.

Tetapi sekarang dengan tehnik kloning gen, yaitu : memindahkan gen insulin manusia ke dalam sel bakteri. Dengan demikian akan didapatkan produksi insulin dalam jumlah besar oleh bakteri, cara ini lebih mudah

Contoh tehnik rekombinan : pembuatan insulin dengan perantara bakteri.

Insulin adalah hormon yang dibutuhkan untuk mengontrol metabolisme gula dalam tubuh kita.

Pada penderita penyakit kencing manis (diabetict) terjadi kegagalan dalam mensintesa hormon ini sehingga diperlukan penambahan insulin dari yang lain untuk kelangsungan metabolisme gula dalam tubuh.

TINGKAT KEBERHASILAN KLONING :

Dipengaruhi oleh : Pemilihan Vektor Pemilihan sistem kloning, tergantung pada penentuan

tujuan yang ingin dicapai. Tujuan dari kloning fragmen DNA

Isolasi dan perbanyakan fragmen DNA murni Preparasi pelacak DNA atau RNA dari urutan spesifik Sequencing daerah penting pada berbagai genom Ekspresi dan pemurnian sejumlah protein biologis Modifikasi genetik species Modifikasi in Vitro dari urutan DNA yang bermanfaat

Garis besar kloning gen :

Membuka sel hidup, dengan cara memblender , skuensing dan destruksi ( memecah sel ).

Mengambil informasi genetik ( DNA ). Karena molekul DNA panjangnya ratusan kali molekul lain didalam sel.

Memotong gen (DNA) khusus yang diinginkan menggunakan enzim restriksi.

Menempatkan potongan DNA spesifik kedalam perantara yang disebut cloning vehicles yang akan membawa DNA ke sel hidup yang lainnya.

Perangkat Teknik DNA Rekombinan/RekayasaGenetika

Enzim restriksi

Vektor / wahana kloning

Konstruksi dan pengklonan

Konjugasi, transformasi, transduksi

Enzim Restriksi

Adalah : Enzim yang dapat mengkatalisasi pembelahan / pemotongan DNA dibeberapa tempat / lokasi spesifik

dengan jumlah yang terbatas & dapat direproduksi.

Enzim ini disebut juga dengan nama endonuklease restriksi

( Russell, 1980).

Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester asam nukleatumumnya berupa tangga, karena urutan target umumnya seringmuncul berkali kali.

fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda dengan sedikitnya satuujung untai tunggal.

Sejarah penemuan enzim restriksi Stewart Linn & Werner Arber (1960)

Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim nuklease restriksi dalam bakteri E.coli galur B yang dapat menguraikan DNA yang tidak termetilkan.

Hamilton Smith (1970)

Pertama kali menemukan enzim nuklease restriksi spesifik yang memutus DNA pada tempat- tempat tertentu dan dapat diidentifikasikan, dari Haemophilus influenzaeyang dikenal dengan nama HindII,

Watson dkk, (1983)

Menemukan nuklease restriksi & metilase modifikasi dalam dua galur E.coli lain yang membuka kemungkinan adanya banyak nuklease yang spesifik untuk suatu tempat

Enzim gol 1

Memecah DNA pada tempat yang tidakspesifik,

jauh dari tempat pengolahan.

Mengenal urutan pasangan nukleotid spesifik.

Antara lain : enzim-enzim yang terlibat dalam

sistem restriksi K dan B ( termasuk E.Coli)

Enzim Restriksi terdiri dari 2 golongan

Enzim gol 2 Memecah DNA pada tempat yang spesifik.

Telah banyak diisolasi dari mikroorganisme

(Russell, 1980).

Enzim yang pertama kali ditemukan pada tahun

1970 oleh Hamilton Smith dari Universitas John

Hopkens yaitu : Haemophyllus influenza, yang

dapat segera menguraikan pemakan DNA asing.

Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi

Vektor / Wahana kloning

Seutas molekul DNA tunggal tempat dilekatkannya material genetik yang kita inginkan sebelum di injeksikan ataupun ditransformasikan kedalam bakteri tertentu.

Wahana kloning yang paling sering di gunakan adalah plasmid.

Plasmid

Adalah unsur genetik diluar kromosom ( ekstrakromosomal), yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam selbakteri.

DNAnya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda.

Mendukung gen yang diperlukan untuk replikasi ataupunfungsi lain yang dipikulnya.

Plasmid mudah dipisahkan dan dimurnikan dari DNA inang

Pada Rhizobium sp. plasmid berguna karena terlibat dalam proses fiksasi dan untuk mengikat nitrogen.

Adalah molekul yang dapat diturunkan secara stabil tanpa mengkaitkannya dengan kromosom.

Sangat berarti bagi bidang kedokteran , farmasi, dan pertanian , karena plasmid membawa resisten terha dap antibiotik yang berguna bagi manusia dan hewan.

Selain itu dapat menjandikan toksin dan proteinlain yang dapat meningkatkan virulensi patogen.

Jenis plasmid

Plasmid F :

Berfungsi dalam proses konjugasi dan dikenal pada berbagai bakteri.

Plasmid faktor R :

Plasmid yang membawa gen-gen penyebab resistensi terhadap antibiotik.

Plasmid Ti :

Pada berbagai Agrobacterium

Fungsi berhubungan dengan tumbuhan inang, yaitu dengan cara mentransfer satu fragmen DNA (DNA-T) kedalam sel inang, yang kemudian akan menyebabkan tumbuhnya tumor pada inang.

Fungsi plasmid

Mendukung replikasi Sebagai vektor untuk pengklonan DNa Pembawa gen resisten antibiotik ( plasma resisten )

Contoh : plasmid resisten plasmid R.E Coli ,yaitu : plasmid yang memberi resisten terhadap

ampicilin dan tetrasiklin. ) DNA plasmid dapat diisolasi dengan cara melisiskan sel

bakteri dan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom.

Plasmid p.BR.322 : merupakan suatu determinan replikasiplasmid pMBI yang berkaitan dengan col.E.I. gen plasmid RI ( TN3) resisten dan gen resisten tetrasiklin plasmid pS(101) sebagai penanda seleksi.

Plasmid

Plasmid resisten

Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan

bakteri

Pemindahan plasmid kedalam gen

Vektor plasmid & Ciri plasmid

Konstruksi dan Pengklonan

. Pengisolasian DNA sumber gen dan vektor Isolasi DNA sebagai sumber gen menggunakan enzim

endonuklease. diperoleh dari gen yang diinginkan yang kemudianditumbuhkan / dikultur kan dalam laboratorium.

Isolasi plasmid dari bakteri (E.coli ) yang membawa 2 gen penandae.g.

1. Resistensi terhadap antibiotik ampisilin,

2. Lac Z yang mengkode .galaktosidase yang dapat

menghidrolisis laktosa.

. Penyelipan DNA kedalam vektor ( 3 langkah)

1. Memotong DNA yang ingin diselipkan dan

DNA plasmid dengan enzim restriksi yang

sama. Pada saat pemotongan enzim restrik

si membuat / menciptakan ujung ujung leng-

ket dari kedua DNA.

2. Menyatukan kedua utas DNA dimana ke 2

ujung lengket akan berpasangan

3. Menggabungkan molekul molekul DNA

secara ikatan kovalen menggunakan enzim

Ligase.

. Pemasukan vektor kedalam sel

Sel bakteri akan mengambil plasmid dengan cara trans formasi(penyerapan DNA dari larutan disekelilingnya).

. Pengklonan sel- sel ( gen DNA asing)

Dalam proses ini bakteri yang telah mengandung plasmid rekombinanditempatkan dalam nutrien agar yg mengandung ampisilin dan gula

Bakteri akan bereproduksi yang membentuk koloni sel rekombinan.yang mengandung sel rekombinan resisten antibiotik ampisilin

. Identifikasi klon gen rekombinan. Dengan metode hibridisasi asam nukleat :

menggunakan utas DNA / RNA yang pendek dapatdiketahui urutan basanya disebut probe asamnukleat.

Probe asam nukleat diberi label radio isotopsehingga pada saat penelusurun dapat dilihat DNA klon yang komlementr dengan DNA probe yang berikatan hidrogen secara spesifik.

PCR ( Polymerase Chain Reaction)

Adalah suatu teknik / metode dimana setiap fragmen DNA dapat diamplifikasi atau diperbanyak berkali-kali,dengan cepat tanpa menggunakan sel.

PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran kali dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus ada primer karena DNA polimerase akan menambahkan nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang sudah ada sebelumnya dengan bantuan primer.

Manfaat PCR

Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah

Kerjanya sangat spesifik dan ampuh.

Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi

Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrio -nik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.