Top Banner
PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI GAFFAR, M.Si. NIP: 132 313 560 JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007
33

Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

Dec 09, 2020

Download

Documents

dariahiddleston
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM

SEL EUKARIOT

OLEH

SHABARNI GAFFAR, M.Si.

NIP: 132 313 560

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2007

Page 2: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT

OLEH

SHABARNI GAFFAR, M.Si.

NIP: 132 313 560

Bandung, September 2007

Mengatahui : Ketua Jurusan Kimia, FMIPA

Universitas Padjadjaran

Dr. Unang Supratman

NIP. 131929830

Page 3: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

DAFTAR ISI 1.

2.

3.

4.

5.

6.

Pendahuluan...............................................................................................

Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae...................................................

2.1. Vektor untuk S. Cerevisiae..................................................................

2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae.........

2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae.....................................

Sistem ekspresi Pichia pastoris..................................................................

3.1. Vektor ekspresi untuk P. Pastoris.....................................................

3.2. Integrasi multicopy............................................................................

Sistem ekspresi ragi yang lain.................................................................

Sistem ekspresi Baculovirus untuk sel serangga..................................

5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus.................................................

5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus...................................

5.3. Konstruksi suttle vektor Baculovirus E.coli-sel serangga.............

5.4. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel serangga.....

Sistem ekspresi untuk sel mamalia.........................................................

6.1. Sistem marker penyeleksi untuk vektor ekspresi mamalia..........

Daftar Pustaka............................................................................................

1

3

5

8

10

11

14

16

16

17

19

20

20

21

22

26

28

3

Page 4: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

Gambar 2.

Gambar 3.

Gambar 4.

Gambar 5.

Gambar 6.

Gambar 7.

Gambar 8.

Gambar 9.

Gambar 10.

Gambar 11.

Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada

ragi (A), serangga (B) dan mamalia (C)................................

Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan

vektor YIp..................................................................................

Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/Zn-

SOD manusia di kloning diantara promotor dan

terminator gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase

(GAPDp) ragi............................................................................

Vektor integrasi untuk P. pastoris...........................................

Peta vektor pPICZ/pPICZα...................................................

Peta vektor pGAPZ/pGAPZα...............................................

Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis

virus............................................................................................

Organisasi vektor transfer Baculovirus (AcMVPV)............

Konstruksi bacmid rekombinan.............................................

Peta vektor ekspresi untuk sel mamalia...............................

Vektor ekspresi bicistronik.....................................................

2

7

10

13

14

15

18

19

21

23

4

Page 5: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

DAFTAR TABEL

Tabel 1.

Tabel 2.

Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S.

cerevisiae............................................................................................

Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P.

Pastoris..............................................................................................

4

16

5

Page 6: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot

1. Pendahuluan

Sistem ekspresi prokariot biasanya digunakan untuk memproduksi

protein heterolog (rekombinan) dari cDNA eukariot yang dikloning. Akan

tetapi, pada beberapa penelitian, protein yang disintesis oleh bakteri tersebut

tidak stabil atau tidak punya aktifitas biologi. Selain itu, meskipun kita

menggunakan prosedur pemurnian protein yang sangat hati-hati, senyawa

yang bersifat toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan

temperatur tubuh manusia dan binatang (pyrogen) mungkin dapat

mengkontaminasi produk.

Untuk mengatasi masalah ini beberapa peneliti telah mengembangkan

sistem ekspresi protein eukariot, yaitu ragi, serangga atau sel mamalia untuk

memproduksi protein-protein terapetik yang tidak terkontaminasi, sehingga

dapat digunakan oleh manusia atau binatang dengan jumlah yang banyak

dan stabil; aktif secara biologi untuk studi biokimia, biofisik, dan struktur;

dan protein yang digunakan untuk proses industri. Selanjutnya, protein

manusia yang ditujukan untuk penggunaan medis harus identik sifatnya

dengan protein natif.

Ketidakmampuan prokariot untuk memproduksi versi autentik dari

protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan protein yang

tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifikasi pasca translasi. Pada

eukariot terdapat enzim Protein Disulfida Isomerase (PDI) yang

mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida pada protein. Pembentukan

ikatan disulfida yang menyimpang akan merubah konfigurasi protein,

sehingga menyebabkan protein tidak stabil dan kehilangan aktifitas.

Terdapat beberapa tipe modifikasi pasca translasi. Beberapa urutan

asam amino pada N-terminal biasanya dibuang melalui pemotongan

proteolisis protein precursor untuk menghasilkan protein fungsional.

Penambahan gula spesifik (glikosilasi) terhadap asam amino tertentu

6

Page 7: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

merupakan modifikasi utama yang memberikan stabilitas dan sifat

pengikatan yang khusus terhadap protein. Glikosilasi yang umum terjadi

adalah pengikatan gula spesifik ke gugus hidroksil dari asam amino serin

atau asparagin (O-linked glicosylation), dan gugus amida dari asparagin (N-

linked glycosylation) (gambar 1). Sekitar 30% protein mamalia mengalami

glikosilasi.

Gambar 1. Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada ragi (A), serangga (B) dan mamalia (C). T adalah threonin, S adalah serin, N adalah asparagin dan X asam sembarang asam amino. Monosakarida/oligosakarida yang berbeda.dilambangkan oleh bentuk yang berbeda.

Kenyataanya tidak ada sel inang eukariot yang efektif secara

universal, dimana proses modifikasi terjadi dengan benar untuk setiap

protein. Dalam beberapa kasus, sel inang mungkin menambahkan gula yang

tidak lazim ke asam amino yang tidak tepat sehingga menghasilkan protein

antigen atau mungkin protein yang mempunyai fungsi yang tidak tepat.

Walaupun beberapa protein rekombinan, mungkin memiliki sifat-sifat yang

tidak cocok untuk agen terapeutik, tapi masih bisa dimanfaatkan untuk

7

Page 8: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

penelitian atau proses industri. Sistem ekspresi eukariot yang berbeda harus

dicoba untuk menentukan sistem mana yang dapat mensintesis protein

rekombinan yang fungsional dan dalam jumlah besar. Pemilihan vektor

ekspresi tergantung pada kualitas protein rekombinan yang akan

diproduksi, penggunaannya, dan biaya produksi dan purifikasi juga penting

untuk dipertimbangkan.

Pada prinsipnya vektor ekspresi eukariot tidak berbeda dengan

vektor ekspresi prokariot. Vektor ekspresi eukariot memiliki promotor

eukariot yang menjalankan transkripsi gen yang dikloning, signal terminasi

transkripsi dan translasi, urutan yang dapat menyebabkan mRNA

mengalami poliadenilasi, dan gen penanda untuk menyeleksi klon yang

positif. Karena prosedur DNA rekombinan secara teknik sulit untuk

dilakukan menggunakan sel eukariot, kebanyakan vektor eukariot

merupakan suttle vector dengan dua origin of replication (ORI) dan gen

penanda seleksi. Salah satunya berfungsi di E. Coli dan yang lain berfungsi di

sel inang eukariot. Jika vektor ekspresi eukariot akan digunakan sebagai

plasmid, maka vektor itu harus mempunyai ORI eukariot. Alternatif lain,

jika vektor itu didisain untuk integrasi ke kromosom, maka harus

mempunyai urutan yang komplemen dengan urutan pada inang untuk

memfalisitasi insersi ke kromosom.

2. Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae.

Saccaromyces cerevisiae telah digunakan sebagai inang untuk ekspresi gen

eukariot dengan alasan-alasan sebagai berikut:

1. Ber-sel tunggal dan sudah dipelajari secara genetik maupun fisiologi.

2. Beberapa promotor gen yang kuat telah diisolasi dari ragi ini dan

dikarakterisasi. S. cerevisiae secara alami mengandung plasmid yang

disebut plasmid 2µm dan dapat digunakan sebagai vektor ekspresi.

3. S. cerevisiae mempunyai mekanisme modifikasi pasca translasi.

8

Page 9: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

4. Ragi ini biasanya mensekresikan beberapa protein. Jadi apabila

protein heterolog direkayasa untuk dibebaskan secara ekstraselular,

maka produk dapat segera di purifikasi.

5. Karena sudah bertahun-tahun digunakan pada industri makanan, S.

cerevisiae sudah didaftarkan oleh U.S Food and Drug Administration

sebagai organisme “generally recognize as safe” (GRAS).

Oleh karena itu penggunakan organisme ini untuk produksi agen

terapetik manusia (drug or pharmaceuticals) tidak membutuhkan penelitian

secara ekstensif seperti yang diwajibkan untuk inang yang belum terjamin

keamanannya. Dewasa ini terdapat sejumlah protein yang telah diproduksi

di S. cerevisiae, dan digunakan secara komersial sebagai vaksin, agen

terapeutik, dan untuk diagnosa (table 1). Sebagai contoh lebih dari 50%

suplai insulin dunia diproduksi oleh S. cerevisiae.

Tabel 1

Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae.

Protein rekombinan

Kegunaan

Antigen permukaan virus hepatitis B Protein circumsporozoide malaria Envelope protein HIV-1

Vaksin

Protein virus hepatitis C Antigen HIV-1

diagnostik

Faktor pertumbuhan epidermal Insulin insulin-like growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growt factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor α1 antitripsin faktor koagulasi darah XIIIa hirudin human growth factor human serum albumin

Agen terapetik untuk manusia

9

Page 10: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

2.1. Vektor untuk S. cerevisiae

Terdapat tiga kelas utama vektor ekspresi untuk S. cerevisiae: episom

atau plasmid, yaitu vektor Yeast Episomal plasmid [YEps], vektor integrasi

(Yeast Integrating plasmid [Yips] dan Yeast Artificial kromosom [YACs].

Vektor-vektor ini telah digunakan secara ekstensif untuk memproduksi

protein heterolog intra atau ekstraselular.

Vektor YEp direkayasa dari plasmid 2µm dengan jumlah copy tinggi. Seleksi

berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan asam amino

tertentu (histidin, triptofan atau leusin) atau nukleotida urasil untuk

pertumbuhan. Strain ini disebut bersifat auxotrof karena medium

pertumbuhan harus diberi suplemen dengan nutrient spesifik. Dalam

prakteknya vektor ini dilengkapi dengan versi gen wild type yang menjadi

komplemen dari gen yang dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila

plasmid YEp dengan gen LEU2 wild type, ditransformasi ke sel inang mutan

leu2 dan kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan

leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh.

Sejumlah promotor dari gen S. cerevisiae sudah diambil untuk

efisiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam vektor ragi. Pada

umumnya vektor-vektor ini dapat diregulasi dengan ketat. Promotor yang

dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi sejumlah besar protein

rekombinan selama pertumbuhan skala besar. Dalam kasus ini promotor

yang diregulasi oleh galaktosa, merespon sangat cepat penambahan

galaktosa, yang menaikkan efisiensi transkripsi sampai 1000x. Promotor

yang dapat direpresi, konstitutif dan promotor hibrida yang

menggabungkan sifat promotor yang berbeda juga tersedia. Tingkat ekspresi

maksimal tergantung pada efisiensi terminasi transkripsi. Pada umumnya

untuk vektor YEp urutan terminator dan promotor diambil dari gen yang

sama.

Urutan pengode gen heterolog pada umumnya dilengkapi segmen

asam amino (urutan pengenal, peptida pengenal, dan urutan pemula) yang

10

Page 11: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

memfasilitasi perjalanan protein rekombinan melewati membran sel dan

pelepasan protein ke luar sel. Alasan utama modifikasi ini adalah lebih

mudahnya memurnikan protein yang disekresikan dibandingkan protein

yang terdapat dalam lisat sel. Urutan pengenal yang umum untuk S.

cerevisiae diambil dari gen α mating factor. Urutan pengenal sintetik juga

sudah dirancang untuk menaikkan jumlah sekresi protein. Urutan lain yang

menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi proteolisis, dan

menyediakan urutan asam amino spesifik (affinity tag) yang digunakan

untuk purifikasi secara selektif, dapat digabungkan ke urutan pengode gen

heterolog. Asam amino tambahan ini dilengkapi oleh sisi pemotongan

protease sehingga bisa dipotong dari protein rekombinan setelah

dimurnikan.

Sistem ekspresi ragi yang menggunakan plasmid kadang-kadang

tidak stabil pada kondisi pertumbuhan skala besar (≥ 10 L) walaupun diberi

tekanan. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti telah menguji apakah

integrasi gen heterolog dapat menyediakan sistem produksi yang dapat

diandalkan. Pendekatan yang berbeda telah dilakukan untuk ko-integrasi

klon dan gen penanda seleksi ke kromosom S. cerevisiae . Lebih jelasnya gen

penanda seleksi fungsional dan gen heterolog ditambahkan dengan urutan

pengontrol transkripsi dan translasi yang spesifik untuk ragi, di insersikan

antara dua segmen DNA yang berasal dari ujung gen non esensial pada ragi.

Pada contoh ini, plasmid tidak selalu membawa ORI yang berfungsi pada sel

ragi. Plasmid dipotong pada ujung dari dua segmen ragi. Setelah

transformasi, melalui peristiwa rekombinasi ganda terjadi insersi DNA

dengan dua gen ke sisi kromosom spesifik (gambar 2). DNA plasmid

dilinearisasi karena DNA dalam bentuk ini lebih disukai dibanding DNA

sirkular untuk berekombinasi dengan DNA kromosom. DNA yang tidak

terintegrasi hilang selama pembelahan sel. Kekurangan utama strategi ini

adalah rendahnya hasil protein rekombinan dari satu copy gen.

11

Page 12: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan vektor YIp. Gen marker seleksi (LEU2) dan gen yang diinsersi (GOI) diinsersikan ke vektor diantara dua segmen yang merupakan ujung gen nonesensial ragi (A1 dan A2). Urutan ini mengalami rekombinasi dengan kromosom sehingga GOI dan LEU2 terintegrasi ke kromosom.

Beberapa pendekatan sedang dilakukan untuk menaikkan jumlah gen

heterolog yang terintegrasi melalui penentuan urutan DNA yang berulang.

Kira-kira terdapat 200 copy urutan DNA untuk RNA ribosom (rRNA) dan

sekitar 400 copy urutan δ pada genom S. cerevisiae. Urutan δ merupakan

bagian dari DNA yang non esensial, yang diambil dari retrotransposon.

Retrotransposon merupakan urutan DNA kromosom yang ditranskripsi.

Molekul RNA ini berperan sebagai templat untuk reverse transcriptase, dan

urutan DNA yang disalinnya mengalami integrasi ke kromosom pada sisi

yang berbeda. Pada studi awal, 10 copy gen yang diinsersikan ke urutan δ

memproduksi sejumlah rekombinan protein.

Vektor YAC dirancang untuk mengkloning segmen DNA dengan

ukuran besar (100 kb), yang kemudian dipertahankan sebagai bagian dari

12

Page 13: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

kromosom dalam sel inang. Sistem YAC sangat stabil dan sudah digunakan

untuk pemetaan fisik genom manusia, analisis unit transkripsi yang besar

dan pembentukan perpustakaan genom yang mengandung DNA dari

kromosom manusia. Vektor YAC menyerupai kromosom karena

mempunyai urutan yang berperan sebagai ORI (autonomous replicating

sequence), urutan centromer ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi

setelah linearisasi DNA yang berfungsi sebagai telomer kromosom untuk

mempertahankan kestabilan kromosom. (gambar 2). Dalam beberapa kasus,

input DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. Tanpa adanya

produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima

ditumbuhkan pada medium khusus. Beberapa vector YAC mengandung gen

marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi cloning. YAC tidak pernah

digunakan sebagai system ekspresi untuk produksi protein heterolog

komersial walaupun punya potensi untuk produksi sejumlah besar protein

tunggal dari gen yang punya jumlah copy banyak atau protein heterolog

dengan subunit berbeda.

2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae

Kebanyakan system ekspresi intraselular S. cerevisiae mempunyai

dasar yang sama. Produksi enzim manusia superoksida dismutase akan

digunakan sebagai ilustrasi. Anion superoksida merupakan produk samping

dari penyediaan oksigen pada organisme aerob. Pada manusia anion ini

membantu merangsang respon inflamasi dari fagosit dan untuk

mengarahkan lekosit ke sisi infeksi. Akan tetapi bila molekul ini terlalu

banyak, turunannya dapat menyebabkan kerusakan sel. Untuk

meminimalkan efek cytotoxic, enzim Cu/Zn superoksida dismutase (Cu/Zn-

SOD) mencari radikal superoksida dan menggabungkannya dengan ion

hidrogen untuk membentuk hidrogen peroksida yang kemudian didegradasi

menjadi air dan oksigen oleh katalase atau peroksidase. Anion superoksida

juga dihasilkan bila darah masuk kembali ke organ-organ (reperfusion)

13

Page 14: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

setelah kehilangan darah selama proses operasi. Untuk mencegah hal ini,

dokter berspekulasi bahwa Cu/Zn-SOD dapat dimasukkan ke organ yang

sedang mengalami reperfusi. Cu/Zn-SOD mungkin bisa bertindak sebagai

agen terapi terhadap penyakit-penyakit inflamasi seperti osteoarthritis,

rheumathoid arthritis scleroderma dan ankylosing spondylitis. Untuk

penggunaan ini bentuk natif dari Cu/Zn-SOD lebih disukai untuk mencegah

respon immunologi yang merugikan yang mungkin dihasilkan dari

penggunaan enzim dari spesies lain.

Pada awalnya, cDNA untuk Cu/Zn-SOD manusia di kloning di

sistem ekspresi E. Coli. Seperti telah diduga, sel inang E. Coli membuang N

terminal metionin dari protein Cu/Zn-SOD, dan asam amino selanjutnya

(alanin) tidak di asetilasi, seperti yang terdapat pada sel manusia. Sehingga

kemudian, cDNA Cu/Zn-SOD manusia dikloning ke vektor YEp (gambar 3).

Vektor YEp mengandung: (1) gen untuk biosintesis leusin (LEU2); (2) ORI

plasmid 2 µm; (3) gen resistan ampisilin (Ampr); (4) ORI dari E. Coli; dan (5)

cDNA Cu/Zn-SOD manusia yang diinsersikan diantara daerah promotor

gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) dan urutan yang

mengandung signal terminasi transkripsi dan poliadenilasi mRNA dari gen

yang sama (GAPDp). Strain ragi dengan leusin defektif (leu2) ditransformasi

dengan vektor ini, dan sel di tumbuhkan pada medium tanpa leusin. Hanya

sel dengan gen LEU2 fungsional (yang terdapat pada vektor) yang akan

tumbuh. Promotor GAPD di transkripsi secara konstitutif selama

pertumbuhan sel. Pada percobaan ini sel ragi memproduksi Cu/Zn-SOD

intraselular dengan level tinggi, dan residu alanin pada N terminal di

asetilasi seperti protein yang sama pada manusia (Gambar 3).

14

Page 15: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/Zn-SOD manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) ragi.

2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae

Semua protein yang mengalami glikosilasi pada S. cerevisiae,

disekresikan ke luar sel. Protein ini harus mempunyai urutan pemula supaya

bisa melewati sistem sekresi. Konsekuensinya urutan pengode dari protein

rekombinan yang membutuhkan gula O-linked atau N-linked untuk aktifitas

biologi harus dilengkapi dengan urutan pemula. Biasanya urutan pemula

dari gen yeast mating factor type α (prepro-α-factor) diinsersikan pada bagian

depan cDNA gen yang akan di ekspresikan. Dengan kondisi ini,

pembentukan ikatan disulfida yang tepat, pemotongan proteolitik dari

urutan pemula, dan modifikasi pascatranslasi yang tepat sering terjadi, dan

protein rekombinan yang aktif akan disekresikan. Selama proses ini peptida

pemula dibuang oleh endopeptidase yang mengenali dipeptida Lys-Arg.

Kodon Lys-Arg harus ditempatkan berdekatan dengan N terminal cDNA,

sehingga setelah peptida pemula dibuang, protein rekombinan akan

memperoleh residu asam amino yang benar pada posisi N terminal.

Strategi tambahan juga sudah ditemukan untuk meningkatkan sekresi

protein rekombinan oleh S. cerevisiae. Sebagai contoh, overproduksi PDI

(Protein Disulfide Isomerase) yang secara natural terdapat pada sistem enzim

sekresi. PDI menyebabkan terjadinya pelipatan protein (folding) yang tepat

15

Page 16: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

selama proses sekresi, sehingga PDI mungkin meningkatkan pelepasan

protein rekombinan, terutama yang memiliki ikatan disulfida. Untuk

memeriksa hipotesa ini, urutan promotor dan terminator transkripsi

gliseraldehid fosfat dehidrogenase yang konstitutif ditempatkan pada ujung

gen PDI ragi yang dikloning dalam vektor YIp, dan diintegrasikan ke

kromosom. Strain transforman menunjukkan peningkatan produksi PDI 16x

dibandingkan dengan strain wild type. Bila sel yang meng-overproduksi PDI

ini ditransformasi dengan vektor YEp yang membawa gen platelet-growth

factor B manusia, terdapat peningkatan sekresi proten rekombinan 10x lebih

tinggi dibandingkan dengan sel yang mempunyai level PDI normal.

Sehingga overproduksi PDI secara spesifik meningkatkan sekresi protein

dengan pembentukan ikatan disulfida.

3. Sistem ekspresi Pichia pastoris.

Ekspresi protein rekombinan dalam S. cerevisiae telah berhasil

digunakan untuk ekspresi berbagai protein dari sumber yang berbeda.

Namun dalam beberapa kasus level ekspresinya rendah. Pada contoh lain

protein rekombinan mengalami hiperglikosilasi dengan lebih dari 100 residu

manosa pada rantai samping N-linked oligosakarida. Kelebihan manosa ini

sering merubah fungsi protein dan menghasilkan protein rekombinan yang

bersifat antigen. Selain itu protein yang dirancang untuk sekresi pada S.

cerevisiae sering tertahan pada membran periplasma, sehingga menambah

biaya dan waktu untuk pemurnian. Selanjutnya, bila densitas sel tinggi maka

S. cerevisiae akan memproduksi etanol, yang merupakan racun bagi sel.

Sebagai konsekuensinya menurunkan jumlah protein yang disekresikan.

Untuk alasan ini beberapa peneliti mencoba spesies ragi yang lain dan sel

eukariot yang dapat berperan sebagai sel inang yang efektif untuk produksi

protein rekombinan.

Sebagai eukariot, P. pastoris memiliki berbagai manfaat seperti sistem

ekspresi eukariot lain, seperti pemrosesan protein, pelipatan protein, dan

16

Page 17: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

modifikasi pascatranslasi, serta mudah dimanipulasi seperti E. coli dan S.

cerevisieae. Penggunaannya juga mudah, mudah, cepat dan mengekspresikan

protein dengan level tinggi.

P. pastoris merupakan ragi metilotropik yang memiliki beberapa

keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae, yaitu:

1. P. pastoris memiliki promotor yang diregulasi dengan ketat, yaitu

promotor gen AOX1 yang mengkode enzim alkohol oksidase yang

dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada metanol, 30% dari protein

selular adalah alkohol oksidase. Sedangkan bila tidak ada metanol,

gen AOX1 tidak bekerja. Selanjutnya promotor gen AOX1 dengan

cepat merespons penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain,

promotor AOX1 merupakan kandidat yang baik untuk menjalankan

transkripsi gen yang dikloning dan memproduksi protein rekombinan

dalam jumlah besar;

2. Tingkat sekresi protein rekombinan pada P. pastoris tinggi, hal ini

disebabkan oleh konsentrasi sel yang tinggi dan tidak dihasilkannya

etanol yang merupakan racun bagi sel; dan

3. P. pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri,

sehingga memudahkan pemurnian protein rekombinan yang

disekresikan.

Vektor ekspresi P. pastoris pada umumnya memiliki format yang

sama. Gen yang diekspresi berada dibawah kontrol promotor dan urutan

terminator transkripsi dari gen AOX1 P. pastoris , ORI dan gen marker seleksi

dari E. Coli dan gen marker seleksi dari ragi (gambar 4). Selain itu juga

terdapat penambahan urutan signal dari gen fosfatase PHO1 P. pastoris atau

gen dari ragi lain yang memfasilitasi sekresi protein rekombinan. Vektor P.

pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk

mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka

panjang. Gen asing dan marker seleksi ragi diinsersikan ke kromosom

17

Page 18: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

spesifik melalui proses rekombinasi homolog antara DNA pada vektor

dengan daerah yang homolog pada genom P. pastoris.

Gambar 4. Vektor integrasi untuk P. pastoris. Gen yang dikloning (GOI) diinsersikan diantara promotor dan terminator gen alkohol oksidase (AOX1).

Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan

tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi tersebut

melakukan metabolisme terhadap alkohol. Metabolisme yang dimaksud

adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan menggunakan

molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah satu produk samping dari

oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mencegah sifat

racun dari H2O2, maka metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel

sel khusus yang disebut dengan peroksisom. Karena alkohol oksidase

memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P.

pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan jumlah sangat

banyak (Invitrogen, 2004).

Sistem ekpresi P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi lebih

dari 100 protein aktif dari bakteri, jamur, invertebrata, tumbuh-tumbuhan,

dan mamalia, termasuk manusia (Tabel 2). Protein-protein rekombinan ini,

seperti antigen permukaan hepatitis B, serum albumin manusia, dan bovine

lysozyme, memiliki sifat identik dengan protein natifnya.

Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat

potensial dalam sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis

18

Page 19: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang

digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi,

(5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum

endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi

ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease. Berdasarkan

pertimbangan di atas, peptida sinyal dan proses pelipatan protein menjadi

perhatian utama dalam peningkatan sekresi protein. Untuk menyelesaikan

permasalahan di atas, beberapa penelitian dengan menggunakan teknik

manipulasi genetik telah berhasil meningkatkan tingkat sekresi dari protein

dalam P. pastoris.

3.1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris.

Vektor pPICZ dan pPICZα merupakan vektor dengan tingkat ekspresi

tinggi. Keduanya membawa marker Zeosin, sehingga seleksi dapat

dilakukan secara langsung dan multi-copy integran dapat diketahui

langsung tanpa menggunakan banyak medium. Zeosin juga dapat

digunakan untuk E. coli, sehingga mengurangi penggunaan antibiotik lain

dan mengurangi ukuran vektor (Gambar 5).

Gambar 5. Peta vektor pPICZ/pPICZα

19

Page 20: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

Kedua vektor ini memiliki: (1) promotor AOX1, untuk

mengekspresikan protein dengan level tinggi yang diinduksi oleh metanol.

(2) C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk

memudahkan deteksi dan purifikasi protein. (3) gen 5’ AOX1 yang berfungsi

untuk menargetkan integrasi ke genom P. pastoris. pPICZα juga

mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan

protein rekombinan ke medium.

Vektor pGAPZ dan pGAPZα dapat mengekspresikan protein tanpa

menggunakan metanol. Vektor ini lebih disukai untuk ekspresi skala besar.

Vektor ini memiliki promotor GAP untuk mengekspresikan protein dengan

level tinggi, gen resistan Zeosin untuk seleksi langsung, dan C-terminal c-

myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan

purifikasi protein. pGAPα juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang

berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium (Gambar 6).

Gambar 6. Peta vektor pGAPZ/pGAPZα

20

Page 21: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

3.2. Integrasi multicopy.

Beberapa vektor ekspresi untuk Pichia yang tersedia dapat

meningkatkan jumlah copy gen dalam P. Pastoris. Sehingga protein akan

diekspresikan lebih tinggi. Vektor pPIC3.5K dan pIC9K membawa gen

resistan kanamycin, sehingga seleksi transforman yang membawa multi

copy vektor terintegrasi dapat dilakukan. Multi insersi dapat diidentifikasi

melalui peningkatan resistensi terhadap Geneticin.

Tabel 2

Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. pastoris

Protein rekombinan Tingkat ekspresi (mg/L)

Protein bakteri: Toksin tetanus fragmen C a-amilase T2A peroksidase Fragmen neurotoxin C. botulinum

12000 2500 2470 78

Protein Ragi: Catalase L Glukoamilase Lipase

2300 400 60

Protein tumbuhan: Hidroksinitril liase Aeroallergen Wheat lipid transfer protein

22000 720 60

Protein mamalia: Mouse gelatin Human tumor necrosis factor Human IGF-1 Human CD-38

14000 10000 600 455

4. Sistem ekspresi ragi yang lain

Protein heterolog untuk kepentingan industri dan pengobatan juga

telah diekspresikan di yeast lain. Contohnya cDNA untuk rantai α dan β

globin dari hemoglobin A manusia, masing-masingnya diklon diantara

promotor metanol oksidase (MOXp) dan urutan terminator transkripsi

(MOXt) dari ragi metilotropik Hansenula polymorpha, dan ditempatkan secara

21

Page 22: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

berurutan pada vektor ekspresi. Secara kebetulan terjadi integrasi dan

setelah 40 generasi dihasilkan hemoglobin A fungsional yang memiliki

tetramer yang tepat yaitu dua rantai globin α dan dua rantai globin β.

Sejumlah spesies jamur Aspergillus juga telah digunakan secara

ekstensif untuk produksi enzim komersial, seperti α-amilase, lipase,

amyloglukosidase, katalase, dan selulase untuk industri makanan dan kertas.

Jamur ini mensekresikan sejumlah besar natif protein, tumbuh dengan cepat

pada medium yang tidak mahal, memproses mRNA eukariot dan

melakukan modifiksi pasca translasi. Beberapa vektor telah dicocokkan

dengan elemen pengontrol trankripsi dan translasi jamur, untuk ekspresi

protein rekombinan. Chymosin manusia, laktoferin tikus, interleukin-6

manusia, xantin oksidase Drosophilla dan protein lain telah berhasil

diproduksi pada sel inang jamur.

Sebagai kesimpulan sistem ekspresi ragi telah memberikan peranan

yang penting dalam memproduksi protein rekombinan untuk kepentingan

penelitian, industri, dan aplikasi medik. Bagaimanapun, pengalaman telah

menunjukkan bahwa tidak ada satu sistempun yang dapat memproduksi

versi autentik dari protein heterolog, sehingga sistem ekspresi yang

menggunakan insek atau sel mamalia juga dikembangkan.

5. Sistem ekspresi Baculovirus untuk sel serangga

Baculovirus menginveksi invertebrata, termasuk beberapa spesies

serangga. Selama siklus infeksi dihasilkan dua bentuk Baculovirus. Pertama

single nucleocapsid (partikel virus) dikeluarkan dari sel yang terinfeksi, dan

dapat menginfeksi sel lain. Kedua, kluster dari nucleocapsid (virion) yang

terperangkap dalam matriks protein. Protein matriks ini disebut polyhedrin

dan keseluruhannya disebut polyhedron (Gambar 7). Sekumpulan

polyhedron (polyhedra) dibebaskan ke lingkungan setelah sel lisis dan mati.

Polyhedron memproteksi virion dari inaktifasi oleh agen-agen asing. Selama

siklus akhir infeksi Baculovirus, protein polyhedrin diproduksi dalam

22

Page 23: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

jumlah besar. Sintesis polyhedrin dimulai sekitar 36-48 jam setelah infeksi

dan berlanjut selama 4-5 hari, sampai infeksi selesai dan sel inang mati.

Gambar 7. Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis virus. (A) single nucleocapsid (partikel virus) dikeluarkan dari sel yang terinfeksi. (B) kluster dari nucleocapsid (virion) yang terperangkap dalam matriks protein.

Promotor untuk gen polyhedrin (polyh) sangat kuat, dan tidak

dibutuhkan untuk produksi virus. Sehingga penggantian daerah pengkode

polyhedrin dengan protein heterolog dan diikuti dengan infeksi sel

serangga, akan menghasilkan produksi sejumlah besar protein heterolog.

Selanjutnya, karena kesamaan sistem modifikasi pascatranslasi antara

serangga dan mamalia, maka protein rekombinan yang dihasilkan akan

sangat mirip dengan bentuk aslinya.

Baculovirus yang telah digunakan secara ekstensif sebagai vektor

ekspresi adalah Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus

(AcMNPV). Sel yang umum digunakan adalah Spadoptera frugiperda. Dalam

sel ini promotor polyhedrin aktif, dan selama infeksi dengan Baculovirus

wild type, polyhedrin dengan level tinggi di sintesis.

23

Page 24: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus

Langkah pertama dalam produksi rekombinan AcMNPV adalah

merancang vektor transfer. Transfer vektor merupakan plasmid E. coli-based

yang membawa segmen DNA dari AcMNPV yang mengandung promotor

polyhedrin dan sebagian segmen upstream DNA AcMNPV, multiple cloning

site, terminator polihedrin dan daerah signal poliadenilasi, serta sebagian

segmen downstream DNA AcMNPV. Daerah pengkode untuk gen polyhedrin

telah di delesi. Segmen upstream dan downstream AcMNPV menyediakan

daerah untuk rekombinasi homolog dengan AcMNPV. Gen yang diinginkan

di klon diantara promotor dan terminator polyhedrin dan kemudian

dipropagasi ke E. coli (Gambar 8).

Kemudian sel serangga dalam kultur di ko-transfeksi dengan DNA

AcMNPV dan vektor transfer yang membawa gen yang diklon. Selama

proses transfeksi, terjadi peristiwa double crossover dan gen yang diklon

dengan promotor dan terminator polyhedrin terintegrasi ke DNA AcMNPV.

Virion yang tidak memiliki gen polyhedrin menghasilkan zona yang berbeda

pada lisis sel (plak negatif) yang merupakan rekombinan Baculovirus.

Gambar 8. Organisasi vektor transfer Baculovirus (AcMVPV). Gen asing diinsersikan ke multiple cloning site (MCS) yang berada diantara promotor gen polyhedrin (Pp) dan urutan terminasi transkripsi polyhedrin (Pt). Urutan 5’ AcMNPV DNA dan 3’AcMNPV DNA menyediakan urutan untuk integrasi unit ekspresi melalui rekombinasi homolog ke genom AcMNPV. Jika gen lacZ E. coli yang mengkode β-galaktosidase diinsersikan pada

promotor baculovirus yang di-on kan selama fasa awal sampai akhir siklus

litik, dan menjadi bagian dari DNA yang diinkorporasikan ke genom

baculovirus, maka plak rekombinan akan menjadi biru, bila ke dalam

24

Page 25: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

medium ditambahkan substrat untuk β-galaktosidase. Penambahan siklus

infeksi terhadap plak negatif akan meningkatkan konsentrasi virus

rekombinan. Protein heterolog dipanen 4 sampai 5 hari setelah sel serangga

terinfeksi. Sistem ekspresi baculovirus ini telah digunakan untuk

memproduksi lebih dari 500 protein heterolog.

5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus.

Linearisasi dari genom AcMNPV sebelum transfeksi ke sel serangga,

meningkatkan frekuensi plak rekombinan. Prosedur sederhana ini

menurunkan jumlah plak non-rekombinan, karena linearisasi genom

baculovirus mengurangi ketidak efektifan dan double crossover antara DNA

AcMNPV linear dengan vektor transfer sirkular. Untuk menjamin proses

linearisasi terjadi secara konsisten, sisi restriksi Bsu31 telah diinsersikan

kedalam gen polyhedrin dari genom AcMNPV wild type. Pada kondisi ini

sekitar 30% plak mengandung baculovirus rekombinan.

5.3. Konstruksi suttle vektor Baculovirus E.coli-sel serangga.

Sistem yang memungkinkan untuk melakukan semua manipulasi

genetik untuk menghasilkan vektor ekspresi baculovirus dalam E. coli juga

telah dikembangkan. Dalam kasus ini transfeksi sel serangga hanya

dibutuhkan untuk produksi protein heterolog. Plasmid E. coli dikonstruksi

dimana suatu segmen DNA diapit oleh urutan DNA yang berada diluar

ujung 5’ dan 3’ gen polyhedrin. Urutan DNA pada segmen ini mengandung

gen resistensi kanamycin, sisi integrasi (sisi pengikatan) yang diinsersikan ke

gen LacZ tanpa merusak fungsinya dan ORI E. coli. Plasmid dan DNA

AcMNPV dimasukkan ke E. coli, setelah terjadi peristiwa rekombinasi, DNA

antara segmen AcMNPV terintegrasi ke genom AcMNPV tanpa kehilangan

gen polyhedrin. Double crossover antara plasmid E. coli dan genom AcMNPV

membentuk DNA single sirkular yang dapat dipertahankan di E. coli sebagai

plasmid, setelah transfeksi ke sel inang serangga, akan langsung

25

Page 26: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

memproduksi baculovirus. Shuttle vektor baculovirus E. coli-sel serangga ini

disebut bacmid.

Gambar 9. Konstruksi bacmid rekombinan. Plasmid E. Coli digabungkan ke genom AcMNPV dengan cara double crossover antara segmen DNA (5’ dan 3’) yang mengapit gen polyhedrin untuk membentuk suttle vektor yang dapat bereplikasi di E. Coli dan di sel serangga.

Dalam prakteknya hampir semua sistem ekspresi prokariot dan

eukariot membawa satu kopi gen yang diklon. Ekspresi simultan dari dua

atau lebih gen yang diklon akan membentuk protein multimer yang

fungsional. Pada suatu studi sejumlah gen dari virus bluetongue (BTV)

sukses diinsersikan ke vektor baculovirus, sehingga terbentuk vektor dengan

tujuh gen insersi. Sistem ini ditest dengan vektor yang membawa empat

protein BTV. Ekspresi dari gen ini menghasilkan partikel yang secara

struktur mirip dengan virus pada siklus perakitan. Virus-like partikel ini

diinjeksikan ke domba dan menghasilkan antibodi terhadap protein BTV

yang bertahan untuk waktu lama. Dalam studi yang lain, antibodi manusia

dan elemen antibodi di produksi dari vektor dua gen dengan urutan

pengkode kombinasi variasi rantai immunoglobulin ringan dan berat.

5.4. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel serangga.

Sel serangga tidak rutin menambahkan galaktosa atau terminal asam

sialat ke N-link glikoprotein. Konsekuensinya sistem baculovirus tidak dapat

digunakan untuk memproduksi sejumlah gliprotein mamalia. Untuk

26

Page 27: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

mengatasi kekurangan ini, sel serangga yang stabil diintegrasi dengan gen

α-2,6-sialiltransferase dan vektor kloning baculovirus diintegrasi dengan gen

β-1,4 glaktotransferase mamalia, dibawah kontrol promotor early-stage. Pada

kondisi uji, sistem ini mensintesis N-link glikan dengan galaktosa dan asam

sialat.

Dalam beberapa kasus, protein heterolog juga tidak diproses dengan

tepat dari prekursor inaktif yang besar menjadi bentuk aktif dalam sel

serangga. Sel mamalia mengandung sejumlah enzim pemroses protein

(proprotein konvertase). cDNA untuk salah satu enzim ini, yaitu furin, telah

diklon kedalam vektor ekspresi baculovirus dibawah kontrol promotor

polyhedrin dan dikotransfeksi ke sel serangga dengan vektor ekspresi

baculovirus lain dengan urutan untuk preproprotein yang normalnya tidak

diproses oleh sel serangga. Pada kondisi ini terjadi konversi penuh menjadi

protein aktif.

6. Sistem ekspresi untuk sel mamalia.

Sistem ekspresi sel mamalia penting untuk produksi protein heterolog

dengan modifikasi pascatranslasi yang lengkap. Sejumlah sel telah

dikembangkan untuk tujuan ini. Contohnya sel yang diambil dari ginjal

monyet hijau dari Afrika (COS), sel ginjal bayi hamster (BHK), dan sel ginjal

embrio manusia (HEK-239), digunakan untuk mempercepat ekspresi gen

dan mempercepat produksi sejumlah kecil protein heterolog, atau untuk

mengetahui integritas dari konstruksi selama pengembangan vektor. Sel

Chinnese hamster ovary (CHO) telah umum digunakan untuk ekspresi gen

jangka panjang dan untuk produksi protein jumlah banyak. Sejauh ini telah

ratusan vektor ekspresi mamalia yang dikembangkan, dan semuanya tidak

berbeda dalam disainnya.

Vektor ekspresi mamalia mengandung origin of replication eukariot,

biasanya dari virus binatang, seperti simian virus 40 (SV40). Urutan

promotor yang menjalankan gen yang diklon dan gen marker seleksi, dan

27

Page 28: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

urutan terminasi transkripsi (signal poliadenilasi) harus dari eukariot dan

secara teratur diambil dari virus lain (cytomegalovirus, SV40, virus herpes

simpleks) atau gen mamalia (β-actin, metallothionein, thymin kinase, bovine

growth hormone). Promotor konstitutif yang kuat dan signal poliadenilasi

dibutuhkan.

Gambar 10. Peta vektor ekspresi untuk sel mamalia. Multiple cloning site (MCS) dan selectable marker gene (SMG) berada dibawah kontrol promotor (p), poliadenilasi (pa), dan terminasi transkripsi (TT) untuk eukariot. Intron (I) mempercepat produksi protein heterolog.

Promotor yang dapat diinduksi sering digunakan bila sintesis secara

kontinu dari protein heterolog bersifat toksid terhadap sel inang. Ekspresi

dari gen yang diinginkan dapat ditingkatkan dengan menempatkan urutan

intron antara promotor dan sisi kloning dari konstruksi transkripsi (cassette).

Intron hibrida yang terdiri dari bagian donor dan sisi akseptor dari dua gen

yang berbeda cukup efektif untuk berbagai sel. Urutan yang dibutuhkan

untuk seleksi dan propagasi dari vektor ekspresi mamalia dalam E. coli

diambil dari vektor kloning E. coli seperti pBR322.

Untuk mendapatkan hasil yang baik, maka gen yang akan diklon

ditambah dengan urutan kontrol translasi. Inisiasi translasi pada eukariot

tingkat tinggi tergantung pada urutan spesifik nukleotida disekitar kodon

start (AUG) yang disebut dengan urutan Kozak, yaitu:

CC(AatauG)CCAUGG. Urutan Kozak biasanya diikuti oleh urutan signal

yang memfasilitasi sekresi, urutan protein (tag) untuk memudahkan

purifikasi protein heterolog, dan urutan pemotongan proteolitik sehingga tag

dapat dibuang dari protein heterolog. Kodon stop ditambahkan untuk

28

Page 29: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

meyakinkan bahwa translasi terjadi pada lokasi yang tepat. Sedangkan

urutan yang mengandung 5’ dan 3’ untranslated region (UTR) penting untuk

efisiensi translasi dan kestabilan mRNA. Sintetik 5’ dan 3’ UTR atau dari gen

β-globin manusia digunakan pada vektor ekspresi mamalia.

Vektor ekspresi sel mamalia pada umumnya membawa satu gen yang

mengkode polipeptida fungsional. Bentuk aktif dari beberapa protein

komersial mengandung dua rantai protein yang berbeda. Contohnya,

hormon tyhroid manusia merupakan dua rantai polipeptida (heterodimer),

hemoglobin, dan antibodi merupakan tetramer dengan dua copy masing-

masing subunit (yaitu α2β2 dan H2L2). Gen atau cDNA dari masing-masing

subunit dapat diklon, disintesis dan masing-masing subunit dipurifikasi

secara terpisah, dan kemudian semua rantai polipeptida digabung dalam

tabung reaksi. Namun, hanya sedikit protein multi-rantai yang dapat dirakit

in vitro. Sebaliknya perakitan in vivo dari protein dimer atau tetramer cukup

efisien. Sehingga sejumlah strategi telah dikembangkan untuk produksi dua

rekombinan protein dalam sel yang sama.

Dua vektor ekspresi mamalia, masing-masing dengan gen atau cDNA

untuk satu subunit dan gen penyeleksi yang berbeda, dapat dikotransfeksi

ke sel inang. Sel yang ditransfeksi diperlakukan dengan kedua agen

penyeleksi, dan sel yang bertahan hidup membawa kedua vektor. Dua jenis

sistem vektor telah sukses digunakan untuk memproduksi protein

rekombinan dimer dan tetramer. Namun sering ditemui salah satu vektor

bisa hilang, dan dua vektor jarang dipertahankan dengan jumlah copy yang

sama, sehingga kedua subunit protein diproduksi dengan jumlah yang

berbeda, dan mengurangi jumlah produk akhir. Untuk mengatasi masalah

ini, vektor tunggal yang membawa dua gen yang diklon telah

dikembangkan. Kedua gen ditempatkan dibawah kontrol promotor dan

signal poliadenilasi yang indipenden (double cassette vector). Alternatif lain,

untuk meyakinkan bahwa sejumlah protein rekombinan yang sama

disintesis, vektor (vektor bicistronik) dikonstruksi dengan dua gen yang

29

Page 30: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

diklon terpisah satu dengan yang lain oleh urutan DNA yang mengandung

sisi pemasukan internal ribosom (IRES= internal ribosomal entry site). IRES

ditemukan pada genom virus mamalia, dan menyebabkan terjadinya

translasi simultan dari protein yang berbeda pada mulekul mRNA

policistronik. Transkripsi dari konstruksi ”gen a-IRES-gen b” dikontrol oleh

satu promotor dan signal poliadenilasi. Pada kondisi ini ”dua gen” tunggal

(bicistronik) ditranskripsi dan translasi berlangsung dari ujung 5’ mRNA

untuk memproduksi rantai pertama (rantai a) dan didalam elemen IRES

memproduksi rantai kedua (rantai b). Biasanya, konstruksi vektor ekspresi

mamalia memakan waktu lama dan membutuhkan usaha yang gigih untuk

mendapatkan produksi protein yang optimum.

Gambar 11. Vektor ekspresi bicistronik. Gen yang diklon (gen a dan gen b) mengkode subunit protein dimer (ab). Masing-masing gen diinsersikan ke vektor pada dua sisi urutan IRES. Kedua gen tersebut dan IRES ditranskripsi di bawah kontrol satu promotor, urutan poliadenilasi dan terminasi transkripsi eukariot.

30

Page 31: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

6.1. Sistem marker penyeleksi untuk vektor ekspresi mamalia.

Beberapa skema seleksi telah di disain yang fungsinya tidak hanya

untuk identifikasi sel yang mengalami transfeksi, juga untuk meningkatkan

produksi protein heterolog melalui amplifikasi jumlah copy vektor ekspresi.

Sistem dihidrofolat reduktase methotrexate (DHFR-MTX) termasuk ke dalam

kategori ini. DHFR mengkatalisis reduksi dihidrofolat menjadi

tetrahidrofolat, yang dibutuhkan untuk produksi purin. MTX merupakan

inhibitor kompetitif dari DHFR. Sensitifitas MTX dapat diatasi jika sel

memproduksi DHFR berlebih. Bila konsentrasi MTX meningkat dalam

jangka waktu tertentu, gen DHFR dalam kultur sel akan diperbanyak. Pada

protokol standar DHFR-MTX, sel defisien DHFR ditransfeksi dengan vektor

ekspresi yang membawa gen DHFR sebagai marker seleksi dan kemudian

sel diperlakukan dengan MTX. Setelah seleksi awal terhadap sel yang

mengalami transfeksi, konsentrasi MTX ditingkatkan, sehingga sel dengan

jumlah copy tinggi vektor dapat diseleksi.

Cara seleksi yang lain adalah menggunakan sistem glutamin

sintetase-metionin sulfoximin (GS-MSX). GS terlibat dalam sintesis glutamin,

yang digunakan pada sintesis protein, produksi purin dan pyrimidin, dan

proses penting lain. MSX secara irreversibel menghambat GS. Sel yang

ditransfeksi dengan vektor yang membawa gen GS, reristan terhadap efek

toksik dari MSX dan memiliki suplai aktif GS yang cukup untuk proliferasi

sel. Setelah seleksi dengan MSX, sel yang memproduksi protein heterolog

dengan level tinggi biasanya memiliki vektor ekspresi tidak lebih dari 10

copy. Sejumlah protein untuk penelitian dan terapi telah diproduksi dengan

sistem ini, termasuk dua antibodi yang telah digunakan untuk terapi

manusia. Gen pengkode rantai berat dan ringan dari monoklonal antibodi

diklon menggunakan dua promotor yang kuat dan gen GS dijalankan oleh

promotor-medium pada vektor ekspresi. Monoklonal antibodi ini telah

digunakan untuk terapi manusia dan tidak terdapat rejeksi organ.

31

Page 32: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

Sebagai kesimpulan vektor ekspresi mamalia efektif dan serbaguna

sebagai vektor untuk ekspresi protein eukariot lain. Namun produksi skala

industri protein rekombinan oleh sel mamalia yang direkayasa menjadi

cukup mahal. Sebagai konsekuensinya sistem ekspresi yang tidak terlalu

mahal lebih disukai walaupun protein rekombinan penting yang autentik

hanya dapat diperoleh dari sel mamalia.

32

Page 33: Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot · FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007 . PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT OLEH SHABARNI

DAFTAR PUSTAKA

Ansari, A., V. C. Emery. 1998. Baculoviruses, 219-233. Dalam R. Rabley and J. M. Walker (ed.) Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc., Totowa, N.J.

Barnes, L. M., C. M. Bentley, and A. J. Dickson. 2000. Advances in animal cell recombinant protein production: GS-NSO expression system. Cytotechnology 32: 109-123.

Cregg, J. M. 1999. Expression in the methylotropic yeast Pichia pastoris, 157-191. Dalam J. Fernandez and J. P. Hoeffler (ed.) Gene Expression Systems: Using nature for the Art of Expression. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

Glick, B.R., Pasternak, J.J. 2003. Molecular biotechnology, principles and applications of recombinant DNA. ASM Press (Washington DC). 163-173.

Geisse, S., and H. P. Kocher. 1999. Protein expression in mamalian and insect cells, Methods Enzymol. 306:19-42.

Invitrogen, A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia Pastoris, 2004. California. 7-10.

Robinson, A. S., Hines, V., Wittrup, K. D. 1994. Protein disulphide isomerase overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio/Technology. 12, 381-384

Schultz, L. D., Markus, H. Z., Hofmann, K. J., Montgomery, D. L., Dunwiddier, C. T., Kniskern, P. J., Freedman, R. B., Ellis, R. W., Tuite, M. F. 1994. Using molecular genetic to improve the production of recombinant proteins by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Ann. N. Y. Acad. Sci. 721, 148-157

Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., Margaret Dah-Tsyr, C. 2005. Improved secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic manipulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 326, 817-824

Tuite, M.F. and Freedman, R.B. 1994, Improving secretion of recombinant proteins from yeast and mammalian cells; rational of empirical design? Trends in Biotechnology.

33