Praktikum Pengecatan Gram

PENGECATAN GRAM

disusun oleh:dr. Shofyatul Yumna Triyana, MSc

Pendahuluan

• Pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884

• Berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.

• Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.

• Pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp

• Spesimen• Pembuatan preparat• Cat Gram

Persiapan

1. Bahan langsung dari penderita :berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin,cairan serebrospinal dan kerokan kulit.

2. Bahan dari biakan cair3. Bahan dari media pertumbuhan padat

Persiapan - Spesimen

1. Bahan langsung dari penderita Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian

endapannya (pellet) dibuat preparat Pellet hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose

steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin

Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya sampai preparat tersebut kering

Teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat

Persiapan - Pembuatan preparat

2. Bahan dari biakan cair Ambil gelas obyek yang bersih dan steril,

bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus

Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm

Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung


3. Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari

lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek

tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan

pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan.

Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita


1. Cat Gram A:• Kristal violet : 2 gram• Etil alkohol 95 : 20 ml• Ammonium oksalat : 0,8 gram• Akuades : 80 ml berwarna ungu (karena mengandung kristal

violet). cat primer semua mikroorganisme akan berwarna ungu

sesuai warna cat Gram A

Persiapan - Cat Gram

2. Cat Gram B:• Yodium : 1 gram• Kalium Yodida : 2 gram• Akuades : 300 ml berwarna coklat merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan

kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target

pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat)


3. Cat Gram C• Aseton : 50 ml• Etil alkohol 95 % : 50 ml Tidak berwarna Berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :

a. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif

b. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif


4. Cat Gram D• Safranin : 0,25 gram• Etil alkohol 95 % : 10 ml• Akuades : 90 ml Berwarna merah Merupakan cat sekunder atau kontras Cat ini berfungsi untuk memberikan warna

mikroorganisme non target Cat sekunder mempunyai spektrum warna

yang berbeda dari cat primer


Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :

a. Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.

b. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D


PengecatanPreparat yang telah siap dicat, digenangi

dengan cat Gram A selama 1 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicucidengan air mengalir

Preparat digenangi cat Gram B selama 1 menit


Preparat ditetesi dengan cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan.


Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1 menit

Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara

Preparat siap diamati dibawah mikroskop

Skema

cara

kerja

• Mikroorganisme berwarna ungu Gram positif

• Mikroorganisme berwarna merah Gram negatif

Hasil dan interpretasi

Perbedaan hasil pengecatan

Gram pada :

bakteri kokus (bulat) Gram positif dengan bakteribacillus (batang) Gram negatif

HASIL DAN INTERPRETASI

1. Teori Salton Gram negatif :kadar lipid tinggi (20 %) di

dalam dinding sel. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna

Landasan teori

1. Teori Salton Bakteri Gram positif :mengalami

denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.

Landasan teori

2. Teori permeabilitas dinding sel Gram positif : mempunyai susunan dinding

yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

Gram negatif : lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

Landasan teori

• Dasar terapi antibiotik• Makna diagnostik

Kelebihan

Kekurangan

• Memerlukan jumlah koloni yang banyak

Identifikasi slide berikut :

a.Bakteri Gram positifbentuk batang/basili

b.Bakteri Gram positifbentuk kokus (cocci)

c. Bakteri Gram negatifbentuk batang

d.Bakteri Gram negatifbentuk kokus


a. Bakteri Gram positifbentuk batang/basili

b. Bakteri Gram positifbentuk kokus (cocci)


d. Bakteri Gram negatifbentuk kokus











Terima kasih

Selamat Belajar

Praktikum Pengecatan Gram

Documents