Home > Documents > Petunjuk Praktikum Sismik

Petunjuk Praktikum Sismik

Date post: 19-Dec-2015
Category:
Author: indira-rizqita-ivanesthi
View: 108 times
Download: 24 times
Share this document with a friend
Description:
good
Embed Size (px)
of 24 /24
1 BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM SISTEMATIKA MIKROBIA Oleh: Dr. Enny Zulaikha, MP. M. Andry FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA
Transcript
  • 1

    BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM

    SISTEMATIKA MIKROBIA

    Oleh:

    Dr. Enny Zulaikha, MP.

    M. Andry

    FAKULTAS BIOLOGI

    UNIVERSITAS GADJAH MADA

    YOGYAKARTA

  • 2

    TAKSONOMI NUMERIK FENETIK

    Acara 1 Klasifikasi Numerik-Fenetik Berdasarkan Data Fenotipik

    A. Pengantar

    Taksonomi numerik yang juga dikenal dengan sebutan taksonomi Adansonian

    (berdasarkan nama ahli sistematika Michael Adanson) didefinisikan sebagai

    pengelompokan unit taksonomis ke dalam sejumlah taksa dengan metode numerik

    berdasarkan karakteristik yang dimiliki. Taksonomi numerik didasarkan atas lima prinsip

    utama, yakni:

    1. Taksonomi yang ideal adalah taksonomi yang mengandung informasi terbesar yaitu

    yang didasarkan atas sebanyak-banyaknya karakter.

    2. Masing-masing karakter diberi nilai yang setara (a priori) dalam mengkonstruksi

    takson yang bersifat alami.

    3. Tingkat kedekatan antara dua strain/OTU (operational taxonomical unit) merupakan

    fungsi similaritas yang dimiliki bersama.

    4. Taksa yang berbeda dibentuk atas sifat yang dimiliki.

    5. Similaritas tidak bersifat filogenetis melainkan bersifat fenetis.

    Tujuan utama taksonomi numerik adalah untuk menghasilkan suatu klasifikasi yang

    bersifat teliti, reprodusibel, serta padat informasi. Aplikasi taksonomi numerik dalam

    konstruksi klasifikasi biologis memungkinkan terwujudnya sirkumskripsi takson

    berdasarkan prinsip yang mantap dan bukan sekedar klasifikasi yang bersifat subjektif

    belaka. Teknik klasifikasi meliputi empat tahapan, yaitu:

    1. Strain mikrobia (n) yang akan diklasifikasikan dikoleksi lalu ditentukan karakter

    fenotipiknya dalam jumlah besar (t) yang mencakup sifat yang tertera pada Tabel 1.1.

    Data yang diperoleh disusun dalam suatu matriks n x t.

    2. Strain mikrobia diklasifikasikan berdasarkan nilai similaritas atau disimilaritas yang

    dihitung dari data n x t.

    3. Strain yang mirip akan dimasukkan ke dalam satu kelompok dengan menggunakan

    algoritma pengklasteran (clustering algorithm).

    4. Kelompok yang dibentuk secara numerik lalu dipelajari dan karakter yang bersifat

    membedakan (separating character) dipilih diantara data dalam matriks untuk

    selanjutnya digunakan dalam dentifikasi.

    B. Cara Kerja

    Tahapan kerja dalam klasifikasi numerik-fenetik terdiri dari (1) pemilihan strain uji,

    (2) pemilihan jenis pengujian, (3) pencatatan hasil pengujian, (4) data coding, (5) analisis

    komputer, dan (6) interpretasi hasil (Priest & Austin, 1993). Namun demikian, dalam

    praktikum ini kita akan menggunakan data hasil pengujian dari artikel penelitian yang

  • 3

    terdapat pada jurnal ilmiah dalam bentuk tabel n x t. Dengan demikian, kita telah

    melewati tahapan kerja 13 dan langsung menuju tahapan data coding dan seterusnya.

    Tabel 1.1. Kelompok karakter yang digunakan dalam taksonomi numerik bakteri (Priest

    & Austin, 1993).

    No Kelompok Karakter Jenis Karakter

    1

    Morfologi kolonial

    Bentuk dan ukuran koloni, pigmentasi larut/tidak larut/

    fluoresens.

    2

    Morfologi selular

    Sifat pengecatan, bentuk & ukuran sel, motilitas,

    ada/tidak nya flagela, ada/tidaknya spora.

    3

    Sifat pertumbuhan

    Bentuk-bentuk pertumbuhan pada medium cair,

    kekeruhan, aerobsis/anaerobsis, kebutuhan vitamin,

    kemampuan tumbuh pada medium salinitas tinggi.

    4

    Sifat biokimia

    Kemampuan fermentasi/oksidasi karbohidrat,

    kehadiran enzim katalase & oksidase, penghasilan

    asam, indol, & gas H2S.

    5

    Resistensi terhadap

    antibiotik

    Kemampuan untuk tumbuh pada medium yang

    mengandung antibiotik.

    6

    Kemampuan

    penggunaan senyawa

    kimia sebagai satu-

    satunya sumber C

    Kemampuan tumbuh pada medium minimal dengan

    glukosa/alanin/sitrat sebagai satu-satunya sumber

    karbon

    7

    Sifat serologis

    Ada/tidaknya reaksi aglutinasi terhadap antiserum

    spesifik

    8

    Sifat kemotaksonomis

    Kehadiran komponen sub-selular tertentu, seperti

    peptidoglikan, menakuinon, asam mikolat.

    9 Sifat genetik Kandungan G+C pada DNA

    10 Phage typing Ada/tidaknya pola phage typing tertentu

    1. Penelusuran Sumber Data

    Dalam praktikum ini, data untuk klasifikasi numerik-fenetik didapatkan melalui hasil

    penelusuran artikel ilmiah. Artikel ilmiah tersebut dapat dicari dari internet melalui

    Google Search dengan mengetikan kata-kata kunci terkait klasifikasi numerik fenetik

    seperti contohnya numerical taxonomy of... atau numerical classification of... Salah

    satu contoh artikel dapat dilihat pada West et al. (1986) yang mempelajari klasifikasi

    spesies anggota genus Vibrio yang diisolasi dari perairan. Data yang terdapat pada artikel

    tersebut selanjutnya akan dijadikan contoh pada panduan praktikum ini.

    Setelah mendapatkan artikel jurnal, telusuri tabel n x t yang terdapat di dalam artikel

    tersebut. Walaupun sering tidak disebut sebagai tabel n x t, namun tabel n x t dapat

    terlihat dari cirinya yang mengandung informasi mengenai strain-strain mikrobia (n) serta

    jenis karakter yang diujikan (t). Karakter yang terkandung dalam tabel n x t pada

    umumnya akan dikelompokan seperti pada Tabel 1.1.

  • 4

    2. Konstruksi Tabel n x t

    Berdasarkan tabel n x t yang diperoleh dari artikel jurnal penelitian, selanjutnya kita

    membuat tabel n x t sendiri. Tabel n x t dapat dibuat dengan program Microsoft Excel

    (MS Excel). Pada MS Excel, strain (n) dimasukan sebagai kolom dan karakter pengujian

    (t) dimasukan sebagai baris (Gambar 1.1.). Pengkodean pada tabel n x t menggunakan

    sistem biner, yakni notasi 1 dan 0. Notasi 1 diberikan apabila ada kehadiran suatu

    sifat dan notasi 0 diberikan untuk ketidakhadiran suatu sifat. Jika dilihat pada Gambar 1

    tersebut, kemampuan V. fluvialis untuk dapat tumbuh pada medium dengan kandungan

    NaCl 6% menjadikan spesies tersebut mendapatkan notasi 1 pada karakter

    Pertumbuhan 6% NaCl. Sebaliknya, V. fluvialis tidak dapat tumbuh pada medium

    dengan kandungan NaCl 0% sehingga membuatnya mendapatkan notasi 0 untuk sifat

    tersebut. Dalam laporan tertulis atau publikasi ilmiah, penggunaan notasi 1 dan 0

    pada n x t sebagai indikasi kehadiran dan ketidakhadiran suatu sifat pada suatu strain

    terkesan kurang lazim. Pada umumnya, notasi + dan digunakan sebagai pengganti

    1 dan 0. Namun demikian, notasi 1 dan 0 pada n x t dimaksudkan untuk

    kepentingan analisis menggunakan program komputer, karena program tersebut tidak

    dapat mengenali notasi + dan .

    Gambar 1.1. Contoh tabel n x t

    Perlu diketahui bahwa pemilihan spesies dalam konstruksi tabel n x t sebaiknya

    mencakup type strain untuk spesies tersebut. Dengan kata lain, sangat disarankan apabila

    data yang digunakan juga memiliki hasil pengujian untuk type strain. Suatu type strain

    merupakan strain yang mewakili suatu spesies atau dengan kata lain type strain

    merupakan pemilik nama spesies. Kehadiran suatu type strain dalam proses konstruksi

    dendrogram berfungsi sebagai acuan bagi strain-strain lainnya yang memiliki kesamaan

    nama spesies dengan type strain, sehingga dapat lebih meyakinkan posisi strain-strain

    tersebut dalam suatu dendrogram.

    3. Konstruksi Dendrogram Dengan Program MVSP 3.1 (Kovach, 2007)

    Konstruksi dendrogram dengan MVSP 3.1 membutuhkan file input dalam format

    .mvs. File tersebut dapat dihasilkan menggunakan program Programmers File Editor

    (PFE) atau Notepad. Kedua program tersebut memiliki kalimat perintah yang sama,

    sehingga dalam penjelasan ini hanya akan diterangkan mengenai satu program saja yakni

    PFE. Pada program PFE, buka file baru New dan akan tampil sebuah layar. Pada layar

    tersebut ketik *L . Sebagai contoh,

  • 5

    apabila kita ingin mengkonstruksi dendrogram 10 spesies dengan 50 karakter, maka kita

    akan menuliskan *L 50 10 pada baris pertama layar.

    Setelah itu, copy tabel n x t dari MS Excel ke dalam layar PFE. Namun sebelum itu,

    tabel n x t harus sedikit dimodifikasi agar dapat terbaca oleh program PFE dan MVSP.

    Modifikasi yang dilakukan meliputi penambahan baris dibawah nama OTU dan kolom

    disamping jenis karakter (Gambar 2). Penambahan ini dilakukan karena program PFE dan

    juga MVSP akan memperlakukan spasi sebagai pemisah antar dua kategori. Apabila kita

    tidak menambahkan simbol pengganti karakter atau OTU, maka sebagai contoh V.

    fluvialis akan dianggap sebagai dua kategori yakni V. dan fluvialis. Setelah

    modifikasi selesai dilakukan, maka tabel n x t selanjutnya di-copy ke program PFE. Perlu

    diketahui bahwa hanya character states dan simbol karakter yang di-copy-kan ke PFE

    (kotak abu muda dan abu tua pada Gambar 1.2.).

    (a)

    (b)

    Gambar 1.2. (a) Tabel n x t awal, dan (b) modifikasi berupa penambahan baris simbol

    strain [a, b, c] dan kolom simbol karakter [1, 2, 3, 4, 5].

    Hasil copy akan terlihat seperti berikut:

    *L 5 3

    a b c

    1 0 0 0

    2 1 1 1

    3 1 1 0

    4 0 0 0

    5 0 0 0

    Simpan file tersebut dalam format .mvs dengan memberikan tambahan .mvs pada

    akhir nama file dalam menu save. File .mvs tersebut selanjutnya dapat dibuka dengan

    program MVSP 3.1. Selanjutnya, masuk ke program MVSP 3.1 dengan membuka

    aplikasi mvspw. Pada MVSP, klik File Open dan pilih file .mvs yang tersimpan.

  • 6

    Ketika terbuka, MVSP akan menampilkan sebuah layar tambahan mengenai jumlah

    variabel dan jumlah sampel dari file .mvs yang kita masukan. Pada program MVSP, kita

    dapat mengubah kembali nama OTU/sampel yang sebelumnya telah diubah menjadi

    simbol [a, b, c] dengan menu Data Edit Data. Pengubahan data pada menu

    tersebut dapat menerima spasi, namun tidak dapat mencetak miring sebagaimana yang

    seringkali dilakukan terhadap nama suatu spesies. Setelah semua simbol OTU diubah

    menjadi nama spesiesnya, kita dapat menutup layar Edit Data tersebut dan memulai

    analisis klaster.

    Analisis klaster dilakukan melalui menu Analyses Cluster Analysis.

    Pada layar Cluster Analysis, kita dapat menentukan jenis perhitungan indeks

    similaritas dan analisis klaster yang diinginkan. Dalam praktikum ini kita akan mencoba

    menggunakan dua jenis perhitungan indeks similaritas (SSM dan SJ) dan metode

    pengklasteran average linkage / UPGMA. Pada metode pengklasteran, kita juga

    dapat memilih single linkage / nearest neighbour atau complete linkage /

    farthest neighbour. Setelah selesai memilih perhitungan indeks similaritas dan

    metode pengklasteran pada submenu Options, kita dapat memilih output analisis pada

    menu Advanced. Pada submenu Advanced, kita dapat menentukan penampilan hasil

    analisis pada kolom result to display. Nyalakan pilihan

    Similarity/distance matrix, Clustering report, dan Text

    dendrogram. Setelah semuanya selesai, maka klik OK.

    Hasil analisis akan memunculkan dua layar, yakni layar pertama yang berisikan

    matriks similaritas dan analisis klaster serta layar kedua yang menampilkan dendrogram.

    Untuk memudahkan analisis selanjutnya, disarankan untuk meng-copy seluruh isi layar

    pertama yang menyerupai layar Excel ke program MS Excel. Gambar dendrogram dapat

    dijadikan file gambar (image file) dengan File Export.

    4. Analisis Korelasi-Kofenetik

    Analisis korelasi-kofenetik dilakukan untuk melihat tingkat akurasi suatu

    dendrogram yang merepresentasikan matriks similaritas antar OTU. Analisis ini

    membandingkan dua jenis matriks similaritas, yakni matriks similaritas awal (unsorted)

    dan matriks similaritas yang diturunkan dari dendrogram (sorted). Analisis ini dapat

    dilakukan dengan program MS Excel. Sebelum mengisikan nilai-nilai dari kedua matriks

    similaritas, kita perlu membuat pasangan OTU terlebih dahulu. Jumlah kemungkinan

    pasangan OTU yang dapat dibentuk dari n-OTU dijabarkan dengan rumus kombinasi:

    Pada contoh diatas, kita dapat menghasilkan 3 jenis kemungkinan pasangan dari total 3

    OTU, yakni [a,b], [a,c], dan [b,c]. Setelah semua kemungkinan pasangan dituliskan,

    masukan nilai untuk kolom unsorted, yakni nilai similaritas dari matriks similaritas awal

  • 7

    dan kemudian nilai untuk kolom sorted yang berasal dari dendrogram / analisis klaster.

    Dari hasil MVSP kita memperoleh matriks similaritas:

    V. fluvialis V. furnisii V. natriegens

    V. fluvialis 1.000

    V. furnisii 1.000 1.000

    V. natriegens 0.500 0.500 1.000

    dan analisis klaster:

    Objects

    Node Group 1 Group 2 Simil. in group

    1 V. fluvialis V. furnisii 1.000 2

    2 Node 1 V. natriegens 0.500 3

    Berdasarkan matriks similaritas tersebut, kita memasukan nilai unsorted. Dengan

    demikian, pasangan [a,b] yang dalam hal ini [V. fluvialis, V. furnisii] memiliki nilai 1.000.

    Hal yang sama untuk pasangan [a, b] juga sama pada analisis klaster, sehingga kolom

    sorted untuk pasangan [a,b] bernilai 1.000. Hal yang perlu diperhatikan, khususnya pada

    tabel analisis klaster adalah pada nomor 2, yakni penggabungan Node 1 dengan V.

    natriegens. Dalam hal ini, masing-masing komponen dari Node 1, yakni a dan b akan

    berpasangan dengan V. natriegens ([c]) pada nilai 0.500. Hal ini berarti kombinasi [a,b]

    dengan [c] akan menghasilkan [a,c] dan [b,c] yang keduanya memiliki nilai similaritas

    0,500.

    Setelah semua komponen nilai dimasukan, maka akan terbentuk tabel seperti:

    OTU Unsorted Sorted

    ab 1 1

    ac 0.5 0.5

    bc 0.5 0.5

    ...

    Dari tabel tersebut, kita dapat menghitung nilai korelasi menggunakan fungsi CORREL.

    Indeks korelasi yang diterima adalah 0,7 atau 70%. Semakin rendah nilai korelasi

    berarti dendrogram yang terbentuk semakin tidak mewakili matriks similaritas yang

    menjadi dasar konstruksinya.

    5. Penampilan Hasil

    Data dan hasil yang diperoleh dari praktikum ini meliputi: (1) tabel n x t, (2) matriks

    similaritas, (3) analisis klaster, (4) dendrogram, dan (5) analisis korelasi-kofenetik. Perlu

    diingat bahwa setiap entry pada tabel n x t yang sebelumnya dimasukan dengan notasi 1

    dan 0 perlu diganti dengan notasi + dan untuk pelaporan hasil. Perubahan ini

    dapat dilakukan pada MS Excel menggunakan fungsi Find/Replace (ctrl+F). Seluruh data

    dan hasil dimuat dalam bab hasil pada laporan praktikum.

  • 8

    Acara 2 Klasifikasi Numerik-Fenetik Berdasarkan Profil Sidik Jari Molekular

    A. Pengantar

    Selain data fenotipik, data berupa profil sidik jari molekular (molecular fingerprints)

    juga dapat digunakan dalam studi taksonomi mikrobia. Profil yang digunakan dapat

    berasal dari DNA, RNA, atau protein. Studi klasifikasi menggunakan profil sidik jari

    molekular termasuk ke dalam studi kemosistematik bersama dengan analisis komponen

    selular lainnya (Priest & Austin, 1993). Teknik yang paling umum digunakan dalam studi

    klasifikasi berdasarkan profil sidik jari molekular adalah restriction fragment length

    polymorphisms (RFLP). Prinsip dasar dari penggunaan RFLP adalah adanya kesamaan

    situs restriksi antara satu mikroorganisme dengan mikroorganisme lainnya yang dapat

    dikenali oleh enzim restriksi endonuklease tertentu. Hal ini berarti bahwa distribusi situs-

    situs restriksi tersebut dapat memberi gambaran mengenai kemiripan antara satu

    mikroorganisme dengan lainnya secara molekular.

    B. Cara Kerja

    Seperti halnya pada praktikum acara 1, data yang dipakai dalam praktikum acara 2

    ini diperoleh dari artikel penelitian yang terdapat pada jurnal ilmiah dalam bentuk

    elektroforegram (foto elektroforesis).

    1. Penelusuran Sumber Data

    Data yang digunakan dalam praktikum ini berupa elektroforegram sidik jari

    (fingerprint) molekular. Data fingerprint tersebut dapat berupa hasil ribotyping, RFLP,

    RAPD, dan lainnya. Elektroforegram dari suatu artikel jurnal dapat di-crop menggunakan

    program PDF reader seperti Adobe Reader melalui menu Tools Select & Zoom

    Snapshot Tool. Buat file gambar (image file) format JPEG atau PNG dari

    elektroforegram tersebut dengan memblok elektroforegram yang diinginkan dan copy

    (ctrl+C) ke program Paint.

    2. Pembuatan Diagrammatic Representative

    Diagrammatic representative merupakan sebuah gambaran skematis yang mewakili

    elektroforegram yang dianalisis. Penggunaan diagrammatic representative ini barfungsi

    untuk mempertegas kehadiran atau ketidakhadiran suatu band dalam elektroforegram.

    Kejelasan mengenai hadir atau tidaknya sebuah band merupakan hal yang penting karena

    band tersebut diasumsikan sebagai karakter dalam data coding.

    Pembuatan diagrammatic representative dapat dilakukan dengan program photo

    editor seperti Corel Draw, Adobe Photoshop, atau Paint Shop Pro. Secara umum,

    tahapan pembuatannya meliputi input gambar, penambahan layer transparan, dan

    menggambarkan suatu garis pada layer transparan tersebut yang berpandu pada band

    elektroforegram dibawahnya. Dalam praktikum ini program Paint Shop Pro (PSP) akan

    digunakan untuk pembuatan diagrammatic representative ini. Pertama, buka program

    PSP dan masukan file gambar elektroforegram yang telah dibuat sebelumnya melalui

  • 9

    menu File Open. Setelah gambar elektroforegram muncul, akan terdapat suatu kotak

    bertuliskan Layer pada sisi sebelah kanan. Apabila kotak ini tidak muncul, kita dapat

    memunculkannya melalui ikon Toggle Layer Palette pada sisi atas, ikon kedua

    dari kanan. Pada layer palette tersebut, gambar yang kita masukan sebelumnya

    dikategorikan sebagai Background. Kita dapat menambahkan layer baru dengan

    menekan ikon Add New Layer yang terletak pada pojok kiri bawah layer

    palette. Sebuah layer baru yang muncul akan diberi nama Layer 1 secara otomatis

    dan terletak di atas layer Background. Klik ikon Layer 1 untuk mengaktifkannya

    dan Pada Layer 1 inilah kita akan membuat diagrammatic representative dari

    elektroforegram.

    Setelah memilih Layer 1, aktifkan control palette dengan menekan ikon Toggle

    Control Palette yang terletak 3 ikon di sebelah kiri Toggle Layer Palette.

    Menu control palette berfungsi untuk mengatur jenis, ketebalan, bentuk, dan ukuran

    brush tip yang akan digunakan untuk mewarnai Layer 1 berdasdarkan cetakan yang

    ada pada elektroforegram. Sebelum mengatur apapun yang ada pada control palette,

    aktifkan Paint Brushes yang terletak pada tool palette (menu di pojok kiri).

    Pemilihan warna dapat dilakukan pada color palette (menu di pojok kanan). Kedua menu

    tersebut masing-masing dapat diaktifkan melalui Toggle Tool Palette dan

    Toggle Color Palette. Menu Control Palette terdiri atas dua submenu,

    yakni Tool Controls dan Brush Tip. Untuk sementara, abaikan dahulu submenu

    Tool Controls dan masuk ke submenu Brush Tip. Pada submenu Brush Tip

    terdapat pilihan Shape, Size, Opacity, Hardness, Density, dan Step yang

    masing-masing berfungsi untuk mengatur jenis kuas, ukuran kuas, ketebalan warna,

    ketegasan bentuk kuas, kepadatan warna, dan gradasi kuas. Hasil pengaturan enam

    parameter ini langsung ditampilkan pada layar di kiri atas submenu Brush Tip.

    Sebagai contoh, pengaturan Brush Tip yang digunakan meliputi Shape:

    Horizontal, Opacity: 25, Hardness: 50, Density: 100, dan Step: 1.

    Size yang digunakan bergantung pada ukuran image file yang digunakan. Sebelum

    mulai membuat diagrammatic representative, sebaiknya kita mengujikan hasil pengaturan

    pada submenu Brush Tip untuk melihat kecocokannya langsung pada Layer 1.

    Hasil pengujian kemudian dapat dihapus dengan mengaktifkan ikon Eraser pada tool

    palette. Bentuk dan ukuran Eraser juga diatur pada menu Control Palette yang

    sama dengan Brush Tip. Hasil penggambaran dapat dilihat pada Gambar 2.1.

    Setelah penggambaran selesai dilakukan, simpan file tersebut (PSP akan secara

    otomatis menyimpannya dalam format .psp). File .psp ini juga dapat dibuka dengan

    program image viewer seperti ACDSee. Diagrammatic representative yang ditampilkan

    adalah hasil penggambaran yang dilakukan tanpa menyertakan background foto

    elektroforegram.

  • 10

    Gambar 2.1. (a) Elektroforegram awal yang dijadikan latar belakang/background dan (b)

    hasil penggambaran yang berpandu pada latar belakang tersebut.

    Dengan demikian, kita dapat menghilangkan foto elektroforegram dengan meng-klik

    ikon Background pada Layer Palette dan kemudian Delete. Hasilnya hanya

    akan tersisa pita-pita berwarna hasil penggambaran sebelumnya (Gambar 2.2). Simpan

    kembali file ini dalam format .jpg (gunakan menu Save As) dengan nama lain agar

    tidak mengganti file sebelumnya.

    Gambar 2.2. (a) Elektroforegram dan (b) diagrammatic representative yang dihasilkan

    dari elektroforegram tersebut.

    3. Data Coding dan Analisis

    Diagrammatic representative yang dihasilkan merupakan sumber untuk data coding.

    Dalam hal ini, setiap pita yang tergambarkan pada diagrammatic representative

    merupakan karakter, sehingga total seluruh pita dari seluruh strain mencerminkan jumlah

    karakter (t) pada tabel n x t. Konversi diagrammatic representative menjadi tabel n x t

    dapat dilakukan secara intuitif dengan melihat kesejajaran pita antar strain dan

    menggolongkan pita-pita yang sejajar sebagai satu karakter (Gambar 2.3). Namun

    demikian, apabila jumlah pita terlalu banyak maka diperlukan garis bantu untuk melihat

    kesejajaran antar pita. Garis bantu tersebut dapat dibuat pada program Paint. Buka file

    gambar diagrammatic representative dalam format .jpg dengan program Paint dan klik

    ikon Line yang terletak pada bagian atas. Setelah itu buat garis dari ujung kiri ke ujung

    kanan gambar dimulai dari pita teratas. Pita-pita yang bersinggungan dengan garis

    tersebut dinyatakan sejajar dan menempati karakter yang sama.

  • 11

    Gambar 2.3. Konversi diagrammatic representative menjadi tabel n x t.

    Tabel n x t yang telah dibuat selanjutnya dianalisis secara numerik-fenetik sama seperti

    pada analisis data fenotipik. Analisis dilakukan menggunakan program MVSP 3.1

    (Kovach, 2007) dengan indeks similaritas SSM dan SJ serta algoritme pengklasteran

    UPGMA.

    4. Interpretasi Hasil

    Hasil analisis numerik-fenetik data fingerprint molekular ini sekilas terlihat sama

    dengan data fenotipik, yakni terdiri atas matriks similaritas, analisis klaster, dan

    dendrogram. Akan tetapi, perlu diperhatikan bahwa kaidah yang diterapkan pada data

    fenotipik tidak harus diterapkan pada data fingerprint ini. Salah satu syarat seperti

    digunakannya minimal 50 karakter pada data fenotipik tidak perlu diterapkan pada data

    fingerprint. Hal ini didasarkan pada fakta bahwa profil fingerprint yang ada dipandang

    hanya sebagai salah satu karakter saja dan tabel n x t yang dikonstruksi merupakan

    turunan dari satu karakter tersebut.

  • 12

    TAKSONOMI FILOGENETIK

    Acara 3 Klasifikasi Molekular Filogenetik Berdasarkan Gen 16S rRNA

    A. Pengantar

    Klasifikasi molekular filogenetik merupakan klasifikasi yang disusun dengan

    mempertimbangkan jalur evolusi setiap organisme yang dikaji. Hal ini berbeda dengan

    klasifikasi fenetik yang hanya melihat hubungan antar organisme berdasarkan karakter

    yang ada pada saat ini (Priest & Austin, 1993). Dalam prosesnya, klasifikasi molekular

    filogenetik menggunakan data berupa urutan (sequence) nukleotida pada DNA atau asam

    amino pada protein. Sequence nukleotida yang digunakan dalam klasifikasi molekular

    filogenetik harus merupakan sequence yang diwariskan langsung oleh nenek moyang

    (homolog) serta memiliki kesamaan sejarah evolusi. Sebuah sequence dapat disebut

    sebagai marker molekular apabila memenuhi persyaratan berupa: (1) terdistribusi pada

    seluruh organisme, (2) memiliki kesetaraan fungsi pada seluruh organisme, dan (3)

    memegang peranan vital bagi kehidupan organisme. Hal ini menjadikan marker

    molekular merupakan sequence yang tepat untuk digunakan dalam studi klasifikasi

    filogenetik.

    Gen 16S rRNA merupakan salah satu contoh marker molekular karena terdapat pada

    organisme baik yang berada pada domain Bacteria, Archaea, serta Eukarya. Saat ini,

    informasi mengenai sequence gen 16S rRNA sudah sangat banyak tersedia pada database

    internasional dan juga sudah dijadikan standar penetapan suatu spesies baru dalam studi

    taksonomi. Pada praktikum ini kita akan mencoba mengklasifikasikan sejumlah bakteri

    dengan cara merekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sequence gen 16S RNA yang

    dimiliki.

    B. Cara Kerja

    3.1.1. Persiapan Data

    Data yang digunakan dalam klasifikasi berbasis molekular filogenetik adalah berupa

    urutan (sequence) nukleotida atau asam amino. Kedua jenis sequence ini umumnya dapat

    diperoleh dari hasil sequencing DNA/protein maupun dari sequence database

    internasional yang tersedia di internet. Untuk kemudahan dalam praktikum ini, kita akan

    menggunakan cara kedua, yakni mengunduh sequence nukleotida/asam amino dari

    internet. Saat ini sudah banyak sekali situs yang memfasilitasi hal tersebut. Situs

    GenBank, DDBJ, serta EMBL merupakan situs dimana pencarian sequence

    nukleotida/asam amino umumnya dilakukan. Dalam acara praktikum ini, kita akan

    mencoba mengunduh data melalui GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)

    dan untuk selanjutnya sequence DNA akan digunakan sebagai contoh persiapan data.

    Pada GenBank kita dapat mencari sequence DNA berdasarkan nama gen, spesies

    pemilik gen, atau accession number pada kolom search yang tersedia. Accession number

  • 13

    merupakan penanda/identitas dari setiap sequence DNA yang telah disimpan pada situs

    tersebut. Pada umumnya accession number tertulis pada artikel publikasi ilmiah yang

    penelitinya telah menyumbangkan hasil sequencing-nya ke database yang ada. Pencarian

    pada menu search di GenBank terdiri dari banyak menu sub-pencarian untuk

    memudahkan penelusuran data, namun dalam praktikum ini kita akan lebih fokus pada

    pencarian dengan menu Nucleotide, Protein, dan Genome. Sebagai contoh, apabila kita

    ingin melakukan pencarian gen 16S rRNA bakteri Escherichia coli maka kita dapat

    melakukan salah satu dari hal berikut:

    1. Melakukan penelusuran pustaka, misalnya pada artikel jurnal untuk mendapatkan

    accession number. Sebagai contoh, Escherichia coli ATCC 11775T pada Bergeys

    Manual of Systematic Bacteriology (Brenner et al., 2005) memiliki accession number

    X80725. Accession Number ini dapat diketikan pada kolom search nucleotide.

    Cara ini merupakan pencarian yang cukup spesifik karena setiap sequence dari setiap

    jenis organisme memiliki accession number tersendiri.

    2. Melakukan penelusuran pada situs List of Prokaryotic names with Standing in

    Nomenclature (LPSN, http://www.bacterio.cict.fr/). Penelusuran melalui situs ini

    khusus untuk pencarian sequence bakteri dan archaea saja. Informasi yang diberikan

    mengenai suatu genus/spesies meliputi type species, type strain, tahun ditemukan, dan

    publikasi (valid/efektif) terkait genus/spesies tersebut.

    3. Melakukan penelusuran pada kolom search nucleotide di GenBank dengan

    mengetik kata kunci, seperti Escherichia coli 16S rRNA. Cara ini kurang spesifik

    karena akan menghasilkan sejumlah daftar yang berisikan berbagai macam spesies

    bakteri yang mengandung sequence gen 16S rRNA dan kita harus mencarinya satu per

    satu.

    4. Melakukan penelusuran pada kolom search genome di GenBank dan kemudian

    mengetik nama spesies yang kita inginkan. Umumnya hasil penelusuran meliputi

    sejumlah daftar complete genome dari spesies yang dicari. Kita dapat mencari gen

    yang diinginkan dalam daftar complete genome tersebut. Cara ini cukup memakan

    waktu, namun kita dapat menelusuri berbagai jenis gen dari spesies tersebut.

    Contoh Hasil pencarian dengan accession number X80725 akan ditampilkan sebagai

    berikut:

    E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S rRNA

    GenBank: X80725.1

    FASTA Graphics

    LOCUS X80725 1450 bp DNA

    linear BCT 29-MAR-1996

    DEFINITION E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S rRNA.

    ACCESSION X80725

    VERSION X80725.1 GI:1240022

  • 14

    KEYWORDS 16S ribosomal RNA; 16S rRNA gene; 16S small

    subunit ribosomal RNA.

    SOURCE Escherichia coli DSM 30083

    ORGANISM Escherichia coli DSM 30083

    Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;

    Enterobacteriales;

    Enterobacteriaceae; Escherichia.

    REFERENCE 1

    AUTHORS Cilia,V., Lafay,B. and Christen,R.

    TITLE Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA

    sequences, and their effect on phylogenetic analyses at the

    species level

    JOURNAL Mol. Biol. Evol. 13 (3), 451-461 (1996)

    PUBMED 8742634

    REFERENCE 2 (bases 1 to 1450)

    AUTHORS Lafay,B.

    TITLE Direct Submission

    JOURNAL Submitted (26-JUL-1994) B. Lafay, CNRS &

    Universite Paris 6,Station Zoologique, Observatoire

    Oceanologique, Villefranche Sur

    Mer, 06230, FRANCE

    FEATURES Location/Qualifiers

    source 1..1450

    /organism="Escherichia coli DSM 30083"

    /mol_type="genomic DNA"

    /strain="ATCC 11775T"

    /db_xref="taxon:866789"

    gene 1..1450

    /gene="16S rRNA"

    rRNA 1..1450

    /gene="16S rRNA"

    /product="16S ribosomal RNA"

    ORIGIN

    1 agtttgatca tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca

    agtcgaacgg

    61 taacaggaag cagcttgctg ctttgctgac gagtggcgga cgggtgagta

    atgtctggga

    121 aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca

    taacgtcgca

    181 agcacaaaga gggggacctt agggcctctt gccatcggat gtgcccagat

    gggatta...

  • 15

    Tulisan diatas mengandung informasi mengenai jenis sequence, asal sequence, produk

    yang dihasilkan, dan sequence itu sendiri. Dalam contoh ini jenis sequence adalah gen

    16S rRNA yang berasal dari Escherichia coli ATCC 11775T. Gen ini akan menghasilkan

    produk berupa RNA ribosomal (rRNA). Informasi mengenai hasil pengkodean dari

    sequence dapat dilihat pada FEATURES. Sequence dari DNA itu sendiri yang dituliskan

    per 10 nukleotida pada kolom ORIGIN. Sequence ini selanjutnya dapat diunduh dalam

    bentuk FASTA dengan cara meng-klik link FASTA pada baris ketiga, dan akan muncul:

    E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S rRNA

    GenBank: X80725.1

    GenBank Graphics

    >gi|1240022|emb|X80725.1| E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S

    rRNA

    AGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGG

    TAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGA

    AACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCA

    AGCACAAAGAGGGGGACCTTAGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTA...

    Kedua jenis data ini (informasi sequence dan sequence FASTA) dikompilasi ke masing-

    masing arsip untuk membuat database sendiri.

    1. Sequence Alignment dengan Program ClustalX 2.1 (Larkin et al., 2001)

    Alignment bertujuan untuk menata sequence agar satu sama lain diletakkan sesuai

    dengan posisi homologi antar sequence. Hanya berdasarkan alignment inilah kita dapat

    membandingkan antar sequence gen 16S rRNA dari masing-masing strain mikrobia yang

    akan diklasifikasikan. Alignment menggunakan program ClustalX dilakukan dengan

    mempersiapkan data sequence dalam format FASTA. Dataset sejumlah sequence yang

    telah didapatkan dikumpulkan terlebih dahulu ke dalam 1 file Notepad dengan awalan

    dari setiap sequence diberikan tanda >. Contohnya dapat dilihat pada sequence berikut:

    >Allochromatium vinosum DSM 180

    agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcatgcctaacacatgcaa...

    >Chlorobium luteolum DSM 273

    aggaaagcggcttcggccgggagtacttggcgcaagggtgagtaaggcatagg...

    >Chloroflexus aurantiacus J-10-fl

    aaaggaggtgatccagccgcaccttccggtacggctaccttgttacgacttcg...

    Penamaan dalam pembuatan dataset sequence ini juga perlu diperhatikan. Disarankan

    untuk menyingkat nama dari setiap sequence yang ada karena program ClustalX akan

    secara otomatis memotong karakter nama apabila melebihi 30 karakter. Selain itu, hasil

    alignment ClustalX yang akan digunakan dalam program Phylip (.phy) juga akan secara

    otomatis memotong karakter nama apabila melebihi 10 karakter. Hal ini akan

    membingungkan apabila pembeda antar nama sequence satu dengan lainnya terletak pada

  • 16

    posisi karakter >10, karena ketika dipotong akan menghasilkan nama yang sama antar

    sequence satu dengan lainnya. Dengan demikian, sebaiknya kita membuat daftar baru

    (dengan MS Word atau Notepad) yang berisi rincian nama sequence beserta

    singkatannya. Singkatan nama ini yang akan kita gunakan dalam dataset yang akan

    diproses dalam ClustalX. Contoh dataset diatas setelah namanya disingkat akan menjadi:

    >AvinDSM180

    agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcatgcctaacacatgcaa...

    >ClutDSM273

    aggaaagcggcttcggccgggagtacttggcgcaagggtgagtaaggcatagg...

    >ChaurJ-10-fl

    aaaggaggtgatccagccgcaccttccggtacggctaccttgttacgacttcg...

    Perlu diperhatikan bahwa pemberian nama tidak boleh mengandung spasi. Penyingkatan

    nama sequence hingga satu karakter (A-Z) sebaiknya tidak dilakukan karena akan

    membuat program ClustalX salah mengenali karakter nama menjadi salah satu komponen

    sequence nukleotida atau asam amino. Jadi, contoh seperti:

    >A

    caaaatggagagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaac...

    tidak boleh dilakukan karena nama A akan disalahartikan sebagai nukleotida oleh

    ClustalX. Dataset yang telah siap selanjutnya disimpan dan selanjutnya dimasukan ke

    dalam ClustalX. Pertama buka program ClustalX, File Load Sequences. Pilih

    file dataset yang telah disimpan dan program tersebut akan secara otomatis menampilkan

    nama sequence pada kolom sebelah kiri dan sequence-nya di kolom sebelah kanan

    (Gambar 3.1).

    Gambar 3.1. Hasil input dataset pada ClustalX.

  • 17

    Sebelum melakukan alignment, kita harus terlebih dahulu mengatur file output yang akan

    dihasilkan. Program ClustalX dapat menghasilkan beberapa macam format file dari satu

    jenis dataset, yakni: CLUSTAL, GCG/MSF, GDE, NBRF/PIR, NEXUS dan

    PHYLIP. Masing-masing file output ini mempunyai kegunaan masing-masing karena

    diperlukan oleh program-program analisis lainnya. Dalam praktikum ini kita hanya akan

    menggunakan format CLUSTAL (.aln), GDE (.gde), dan PHYLIP (.phy). Pada program

    ClustalX, pilih Alignment Output Format Options klik GDE FORMAT,

    dan PHYLIP FORMAT CLOSE. Setelah itu pilih Alignment Do Complete

    Alignment.

    3.1.2. Rekonstruksi Pohon Filogenetik dengan PHYLIP v3.6.9 (Felsenstein, 2005)

    Rekonstruksi dengan program ini membutuhkan file input dalam format .phy yang

    dapat dihasilkan oleh program ClustalX atau MEGA. Program Phylip memiliki

    serangkaian aplikasi executeable yang dapat menganalisis data sequence dengan berbagai

    algoritme. Aplikasi yang terdapat pada Phylip antara lain:

    clique dnamlk drawgram neighbor restml

    concense dnamove drawtree pars retree

    contml dnapars factor penny seqboot

    contrast dnapenny fitch proml treedist

    dnacomp dollop gendist promlk

    dnadist dolmove main protdist

    dnainvar dolpenny mix protpars

    dnaml draw move restdist

    Rekonstruksi pohon filogenetik pada Phylip dapat dilakukan dengan aplikasi

    neighbor, fitch, dnapars, dan dnaml untuk sequence nukleotida. Aplikasi

    neighbor juga dapat digunakan untuk merekonstruksi pohon dengan sequence asam

    amino, namun sebelumnya harus menggunakan input data yang dihasilkan dari aplikasi

    protdist. Aplikasi protml dan protpars memiliki prinsip analisis yang sama

    dengan dnaml dan dnapars, namun menggunakan sequence asam amino sebagai data

    inputnya.

    Copy file format .phy ke dalam folder exe yang terdapat di dalam folder Phylip dan

    kemudian ganti nama file tersebut menjadi infile tanpa menggunakan

    extension/format apapun. Folder exe terkadang sudah mengandung file dengan nama

    infile yang disebabkan oleh analisis data yang pernah dilakukan sebelumnya. Apabila

    kita menjumpai file infile tersebut, hapus terlebih dahulu dan kemudian baru

    mengganti nama file .phy menjadi infile. Selanjutnya, buka salah satu dari aplikasi

    yang tersedia dalam folder exe untuk menganalisis infile, dalam hal ini kita akan

    menggunakan aplikasi neighbor, yakni rekonstruksi dengan algoritme Neighbor-

    Joining.

  • 18

    Perlu diketahui bahwa rekonstruksi pohon filogenetik yang menggunakan data

    distance matrix berbasis clustering seperti UPGMA, Neighbor-Joining, dan algoritme

    Fitch-Margoliash menggunakan data berupa matriks p-distance yang dihasilkan oleh

    aplikasi dnadist untuk sequence DNA atau protdist untuk sequence asam amino.

    Dengan demikian, infile perlu dianalisis terlebih dahulu dengan dnadist,

    kemudian outfile hasil analisis dnadist diubah lagi (rename) menjadi infile

    untuk dapat dianalisis dengan neighbor. Setelah namanya diubah, buka aplikasi

    neighbor dan akan tampil menu berupa:

    Neighbor-Joining/UPGMA method version 3.69

    Settings for this run:

    N Neighbor-joining or UPGMA tree? Neighbor-joining

    O Outgroup root? No, use as outgroup species 1

    L Lower-triangular data matrix? No

    R Upper-triangular data matrix? No

    S Subreplicates? No

    J Randomize input order of species? No. Use input order

    M Analyze multiple data sets? No

    0 Terminal type (IBM PC, ANSI, none)? ANSI

    1 Print out the data at start of run No

    2 Print indications of progress of run Yes

    3 Print out tree Yes

    4 Write out trees onto tree file? Yes

    Y to accept these or type the letter for one to change

    Tekan huruf yang bersangkutan untuk mengubah pengaturan yang diinginkan. Setelah

    selesai, tekan Y dan Enter. File hasil analisis akan dimuat ke dalam outfile dan

    gambar pohon dimuat pada outtree. File outfile dapat dibuka dengan Notepad dan

    dapat di-copy ke dalam MS Excel untuk memudahkan pembacaan, sedangkan file

    outtree dapat dibuka dengan program Treeview (Page, 1996).

    Rekonstruksi pohon filogenetik dengan algoritme berbasis character-based seperti

    maximum parsimony dan maximum likelihood menggunakan file .phy sebagai infile

    dan tidak perlu dibuat matriks p-distance. Dengan demikian kita dapat langsung

    menjalankan program dnapars untuk analisis parsimony atau dnaml untuk analisis

    likelihood langsung terhadap infile.

    3.1.3 Pembuatan Matriks Similaritas DNA dengan Phydit (Chun, 1995)

    Program Phydit menggunakan data input berupa hasil alignment dengan format .gde

    yang dapat dihasilkan dengan program ClustalX. Salah satu analisis yang dilakukan oleh

    Phydit adalah penghasilan matriks similaritas nukleotida yang berisi persentase

  • 19

    similaritas nukleotida antar pasangan sequence yang dibandingkan tanpa menggunakan

    model evolusi apapun.

    Analisis dengan Phydit dilakukan dengan membuat file baru dengan membuka menu

    File New atau dengan menekan ikon New Phydit File yang terdapat pada

    panel atas bagian paling kiri. Sebuah menu akan muncul dimana kita dapat memasukan

    keterangan file. Isi keterangan apabila diperlukan dan apabila sudah, tekan OK. Phydit

    kemudian akan menampilkan layar baru bertuliskan No entry to tag. Pada tahap

    ini, masukan data melalui Data Import GDE (NT Replace) untuk sequence

    nukleotida. Pilih data dalam format .gde dan Phydit akan langsung memasukan sequence

    berdasarkan entry nama sequence. Penghasilan matriks similaritas nukleotida dapat

    dilakukan melalui Analysis SimTable: Generating Similarity Table

    yang terdapat pada panel atas. Matriks similaritas nukleotida terdiri atas dua bagian, yakni

    bagian segitiga kanan atas (upper-right triangle) dan segitiga kiri bawah (lower-left

    triangle). Phydit akan menanyakan jenis data yang akan dimuat dalam masing-masing

    segitiga tersebut. Pada umumnya kita akan memasukan data similaritas nukleotida (NT

    Similarity) pada lower-left triangle dan jumlah nukleotida yang berbeda

    per total nukleotida yang dibandingkan (NT different/Total Nucleotides)

    pada upper-right triangle. Tekan OK dan akan muncul menu Options; tekan

    OK lagi untuk melanjutkan analisis. Hasil yang keluar berupa matriks yang dituliskan

    pada Notepad. Untuk memudahkan pembacaan, copy seluruh tulisan pada Notepad

    tersebut (ctrl+A kemudian ctrl+C) ke MS Excel dan kemudian simpan. Sebagai

    tambahan, Phydit juga menyediakan pilihan analisis lainnya yang mencakup:

    Alignment Reports, menu ini berfungsi untuk menampilkan hasil alignment sequence

    nukleotida/asam amino dalam bentuk text yang secara otomatis dibuka oleh Notepad.

    Sequence Statistics, menu ini berfungsi untuk menampilkan frekuensi nukleotida dan

    frekuensi asam amino dari sequence yang ada. Apabila kita menggunakan sequence

    nukleotida, adanya statistik frekuensi asam amino pada hasil diasumsikan bahwa

    sequnce yang dimiliki merupakan coding sequence.

    3.2.Konstruksi pohon filogeni menggunakan aplikasi MEGA 4.0

    Molecular Evolutionary Genetic Analysis 4.0 (MEGA 4.0) merupakan alat

    terintegerasi untuk mengolah pemerataan sekuen, menkonstruksi pohon filogenetik,

    memperkirakan perbedaan waktu, memperkirakan kecepatan evolusi molekuler,

    menkonstruksi sekuen nenek moyang, dan menguji hipotesis evolusioner. Aplikasi

    MEGA 4.0 digunakan oleh para ahli biologi di dalam laboratorium untuk

    merekonstruksi sejarah evolusioner dari suatu spesies dan sifat selektif yang

    dihasilkan dari kekuatan alam membentuk evolusi gen dan spesies.

    Langkah-langkah merekonstruksi pohon filogenetik dengan aplikasi MEGA 4.0

    lebih singkat daripada dengan cara diatas.

  • 20

    Secara garis besar tahapan rekonstruksi pohon filogenetik dengan menggunakan

    aplikasi MEGA 4.0 terdiri atas:

    1. Mengunduh sekuens nukleotida yang kita kehendaki dari GenBank

    2. Sequence alignment dengan ClustalW

    3. Rekonstruksi pohon filogenetik

    3.2.1. Mengunduh sekuens nukleotida dari GenBank

    Pengunduhan dapat dilakukan dari NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

    dengan format FASTA. Diupayakan sekuens nukelotida yang kita gunakan berasal

    dari jenis yang sama dan banyaknya sekuen nukleotida tidak jauh berbeda. Apabila

    kita memilih sekuen dengan panjang yang perbedaan terlalu jauh maka akan

    mengganggu proses alignment dengan ClustalW. Setelah mengunduh format FASTA

    dari GenBank kemudian disalin pada program Notepad. Contoh format FASTA

    sekuen nukleotida dari B. mycoides GMA030 adalah sebagai berikut:

    >gi|398650471|dbj|AB738786.1| Bacillus mycoides gene for 16S rRNA, partial sequence, strain:

    GMA030 GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACCGATTAAGAGCTTGCTCTTAAGAAGT

    TAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGG

    CTAATACCGGATAACATTTTGCACCGCATGGTGCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATAGAT

    GGACCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAG

    AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC

    CGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGT

    TGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCT

    AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGC

    GCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA

    GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACA

    CCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGCAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT

    TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCT

    GAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG

    GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAT

    CCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA

    GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAA

    GTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCC

    CCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGTCGCAAGACCGCGAGGTGGAGCT

    AATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGT

    AATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA

    GTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGG

    GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAA

    1. Sequence alignment dengan ClustalW

    - Buka aplikasi MEGA 4.0, pilih menu Alignment kemudian beri tanda pada pilihan

    Create new alignment dan klik OK.

  • 21

    Gambar 3.2. Membuka menu Alignment pada MEGA 4.0.

    - Data sekuens dalam format FASTA dari Notepad kita salin pada blank sequence

    dengan cara Ctrl+N untuk menambak kotak blank sequence. Nama Sequence 1,

    Sequence 2, dst. dapat diganti dengan nama strain asli. Pada kotak sebelah nama

    strain ditempelkan data sekuen nukleotida. Basa T dengan kotak warna merah,

    basa G dengan kotak warna ungu, basa A dengan kotak warna hijau, dan basa C

    dengan kotak biru.

    Gambar 3.3. Proses memasukkan nucleotide sequence pada kolom blank sequence.

  • 22

    - Setelah selesai melakukan penambahan sekuens kemudian klik icon W yang

    merupakan ClustalW. Hasil alignment dengan ClustalW disimpan dengan format

    file .mega.

    Gambar 3.4. Hasil Alignment dengan menggunakan ClustalW.

    3.2.2. Rekonstruksi Pohon Filogenetik

    - Buka kembali aplikasi MEGA 4, pilih File, kemudian pilih Reopen data, pilih data

    hasil alignment yang telah dibuat. Pilih menu Phylogeny, kemudian pilih Boostrap

    Test of Phylogeny, pilih Neighbor Joining (perlu diperhatikan jumlah boostrap

    sebaiknya 1000 replikasi), dan klik Compute.

    Gambar 3.5. Pilihan menu rekonstruksi pohon filogenetik.

  • 23

    Pohon filogenetik selesai dibuat.

    Bacillus anthracis DN 2210 (DNA sample)

    Bacillus cereus strain ATCC14579

    Bacillus thuringiensis strain CMBL-BT4

    Bacillus weihenstephanensis isolate CCM1

    Bacillus mycoides strain GMA030

    Bacillus aquimaris isolate L-36

    Bacillus pumilus strain X-6-19

    Bacillus licheniformis strain VPS50.2

    Bacillus subtilis strain ATCC 21331

    Bacillus megaterium strain GMA479

    Bacillus flexus partial 16S rRNA gene

    Bacillus cohnii gene for 16S rRNA

    Bacillus indicus 16S ribosomal RNA gene

    Bacillus coagulans strain NRIC 1527

    Bacillus methanolicus strain NCIMB 12524

    Bacillus circulans strain Q11

    Bacillus firmus strain D1

    Bacillus lentus strain IAM 12466

    Bacillus fusiformis gene for 16S rRNA

    Oceanobacillus caeni gene for 16S rRNA

    Bacillus larvae 16S rRNA

    72

    38

    99

    100

    100

    98

    99

    81

    62

    88

    51

    41

    31

    59

    15

    17

    86

    0.005 Gambar 3.6. Rekonstruksi pohon filogenetik dari 21 spesies Bacillus sp.

  • 24

    DAFTAR PUSTAKA

    Brenner, D. J., N. R. Krieg, J. T. Staley & G. M. Garrity. 2005. Bergey's manual of

    systematic bacteriology 2nd

    edition, volume 2: The Proteobacteria, Part B: The

    Gammaproteobacteria. Springer Pub.: USA.

    Chun, J. 1995. Computer-assisted clasification and identification of actinomycetes. Ph.D.

    Thesis. University of Newcastle, UK.

    Felsenstein, J. 2005. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Distributed by

    the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle,

    USA.

    Goodfellow, M. 1997. Microbial Systematics. In Microbiology and Medical

    Microbiology. University of Newcastle Upon Tyne.

    Kovach, W.L., 2007. MVSP - A MultiVariate Statistical Package for Windows, ver. 3.1.

    Kovach Computing Services, Pentraeth, Wales, U.K.

    Larkin, M. A., G. Blackshields, N. P. Brown, R. Chenna, P. A. McGettigan, H.

    McWilliam, F. Valentin, I. M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J. D. Thompson, T.

    J. Gibson, & D. G. Higgins.2007. Clustal W and Clustal X version 2.0.

    Bioinformatics 23: 29472948.

    Page, R. D. M. 1996. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on

    personal computers. Computer Applications in the Biosciences 12: 357358.

    Priest, F. & B. Austin. 1993. Modern Bacterial Taxonomy 2nd

    Edition. Chapman & Hall

    Pub.: England.

    Sembiring, L. 2002. Sistematika Mikrobia (BIO 668) Petunjuk Praktikum. Fakultas

    Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia.

    Sembiring, L. 2002. Sistematika Molekular (BIO 765) Petunjuk Praktikum. Fakultas

    Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia.

    West, P. A., P. R. Brayton, T. N. Bryant, & R. R. Colwell. 1986. Numerical taxonomy of

    vibrios isolated from aquatic environments. International Journal of Systematic

    Bacteriology 36 (4): 531543.


Recommended