Top Banner
PERCOBAAN VI PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM BAHAN MAKANAN SECARA SPEKTROFOTOMETRI A. Tujuan Memahami dan melakukan penetapan kadar protein secara spektrofotometri B. Dasar Teori 1. Protein Istilah protein berasal dari kata proteos yakni bahasa Yunani yang berarti utama. Istilah ini dapat digunakan karena protein merupakan zat paling penting dalam setiap organisme. Protein ini merupakan molekul makro dengan berat molekul antara lima ribu hingga jutaan gram per mol. Protein terdiri atas rantai-rantai panjang asam amino yang terikat satu sama lain dengan ikatan peptide. Hal inilah yang membuat protein ini lebih kompleks daripada karbohidrat dan lemak dalam hal berat molekul dan keanekaragamannya. Protein adalah bagian dari semua sel hidup dan merupakan bagian terbesar dalam tubuh sesudah air (Sandjaja, 2009). Dalam kehidupan, protein memegang peranan penting. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim suatu
34

Percobaan Vi

Sep 30, 2015

Download

Documents

Elva Luo

asdfgh
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript

PERCOBAAN VIPENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM BAHAN MAKANAN SECARA SPEKTROFOTOMETRI

A. Tujuan

Memahami dan melakukan penetapan kadar protein secara spektrofotometri

B. Dasar Teori

1. Protein

Istilah protein berasal dari kata proteos yakni bahasa Yunani yang berarti utama. Istilah ini dapat digunakan karena protein merupakan zat paling penting dalam setiap organisme. Protein ini merupakan molekul makro dengan berat molekul antara lima ribu hingga jutaan gram per mol. Protein terdiri atas rantai-rantai panjang asam amino yang terikat satu sama lain dengan ikatan peptide. Hal inilah yang membuat protein ini lebih kompleks daripada karbohidrat dan lemak dalam hal berat molekul dan keanekaragamannya. Protein adalah bagian dari semua sel hidup dan merupakan bagian terbesar dalam tubuh sesudah air (Sandjaja, 2009).Dalam kehidupan, protein memegang peranan penting. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim suatu protein yang dapat berfungsi sebagai biokatalis. Disamping itu hemoglobin dalam butir-butir darah merah yang disebut eritrosit. Eritrosit berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru menuju keseluruh bagian tubuh yakni salah satu jenis protein. Demikian pula zat-zat yang berperan untuk melawan bakteri penyakit atau yang disebut dengan antigen yang merupakan pula jenis protein (Poedjiadi, 2006)

Protein yang diperoleh dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut dengan protein hewani, sedangkan protein yang berasal dari tumbuhan disebt dengan protein nabati. Beberapa makanan sumber protein yakni daging, telur, susu, ikan, beras, kacang, kedelai, gandum, jagung dan buah-buahan (Sandjaja, 2009).

2. Analisis Protein pada Makanan

Penentuan kadar protein dalam bahan makanan dengan tujuan yang beragam, diantaranya untuk menentukan kadar protein total dalam bahan makanan, menentukan tingkat kualitas protein yang dipandang dari sudut gizi dan menelaah protein sebagai salah satu bahan kimia seperti yang dilakukan pada bidang biokimia. Penentuan kadar protein total dalam bahan makanan dapat dilakukan dengan beberapa metode antara lain yakni dengan metode spektrofotometri UV, metode Kjeldahk, Lowry, Metode Biuret, metode turbidimetri, metode pengecatan dan penentuan protein dengan titrasi formal (Maharani, 2010).Protein merupakan zat makanan yan amat penting bagi tubuh karena disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengakhir. Protein merupakan sumber sejumlah asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Molekul protein juga mengandung fosfor dan belerang. Sebagai zat pembangun, protein merupakan bahan pembentuk jaringan baru yang selalu terjadi didalam tubuh. Pada masa kehamilan protein membentuk jaringan baru dan embrio. Fungsi utama protein bagi tubuh adalah untuk membentuk jaringan dan mempertahankan jaringan yang telah ada (Husni, 2008).Protein dapat juga dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu, yaitu: a. Protein globular

Protein globular rantai atau rantai-rantai polipeptida berlipat rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat yang padat, protein globular biasanya larut didalam sistem larutan (air) dan segera berdifusi, hampir semua mempunyai fungsi gerak dan dinamik. Hampir semua enzim merupakan protein globular, seperti protein transport pada darah, antibodi, dan protein penyimpan nutrien.

(Lehninger, 1982)Protein globular umumnya berbentuk bulat atau elips dan terdiri dari atas rantai polipeptida yang berlipat. Pada umumnya gugus R polar terletak disebelah luar rantai polipeptida, sedangkan gugus R yang hidrofob terletak disebelah dalam molekul protein.

(Poedjiadi, 2006)b. Protein Serabut

Bersifat tidak larut didalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu sumbu, dan tidak berlipat menjadi bentuk globular. Hampir semua protein serabut memberikan peranan struktural atau pelindung. Protein serabut ysng khas -keratin pada rambut dan wol, fibroin dari sutra dan kolagen dari urat (Lehninger, 1982).

Peneraan jumlah protein secara empiris yang umum dilakukan adalah dengan menentukan jumlah nitrogen (N) yang terkandung oleh suatu bahan makanan. Cara penentuan ini dikembangkan oleh Kjeldahl, seorang ahli kimia Denmark pada tahun 1883. Dalam penentuan protein seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang ditentukan. Akan tetapi hal ini secara teknis sulit sekali dilakukan dan mengingat jumlah kandungan senyawa lain selain protein dalam bahan biasanya sangat sedikit, maka penentuan jumlah N total ini tetap dilakukan untuk mewakili jumlah protein yang ada. Kadar protein yang dapat ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl ini dengan demikian sering disebut sebagai kadar protein kasar (Sumarni, 2002).

Pengukuran kadar protein dapat dilakukan secara kuantitatif dan kualitatif. Cara kuantitatif dapat dilakukan dengan cara spektrofotometri UV dan kolorimetri, cara Kjeldahl dan titrasi Formol. Cara tak langsung ada dua metode, pertama yakni berdasarkan pengikatan zat warna misalnya Bradfrod, Nynhidrin, Brom Cresol Grren. Sedangkan metode yang lain adalah berdasarkan pengikatan dengan tembaga, seperti metode Biuret, Lowry, metode BCA (Bicin Croninic Acid) dan juga metode FeCl3.

(Katili, 2009)3. Spektrofotometri Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu laajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detector fototube. Alat yang digunakan disebut dengan spektrofotometer. Komponen utama dari spektrofotometer yakni sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detector, penguat dan indikator (Poedjiadi, 2006)

Penetapan kadar protein secara biuret dilakukan dengan bantuan alat spektrofotometer. Prinsipnya adalah pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm, ini merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu.

Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip dari metode biuret adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa. Reaksi biuret terdiri dari campuran protein sodium hidroksida (berupa larutan) dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari reaksi ini. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lainnya (Carpette, 2005).C. Alat dan Bahan

1. Alat

a. Batang pengaduk

b. Corong kaca

c. Gelas kimia 50 mL dan 100 mL

d. Kaca arloji

e. Kuvet

f. Labu takar 25 mL; 100 mL; 250 mLg. Pipet ukur 15 mL; 100 mLh. Pipet tetes

i. Propipet

j. Spektrofotometri uv-vis

k. Timbangan analitik

2. Bahan

a. Albumin standar

b. Aquades

c. NaOH 0,5 M

d. Pereaksi biuret

e. Sampel

1) Susu kedelai

2) Susu sapi

3) Telur ayam ras

4) Telur ayam kampung

5) Telur bebek

6) Telur puyuh

D.Bagan kerja

1. Penentuan kalibrasi

1 mL albumin standar (5g/dL)

Aquades ad. Tanda batas

Diambil

1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm 1000 ppm

+ biuret 3 mL

+ aquades ad. tanda batas2. Penentuan protein

Air sampel

+ 1 gram putih telur

+ NaOH 0,5 M sebanyak 5 mL

+ aquades ad. Larut

+ biuret 3 mL

Didiamkan t = 10 menit

Suhu 37 - 38C

Diinkubator

Diukur absorbansi

3. Pembuatan pereaksi biuret Larutan A Larutan B

+ CuSO4 0,375 g + NaOH 10% 10 g

+ KH4C4 1,5 g

+ Aquades 50 mL + Aquades 50 mL

Dicampurkan

Dihomogenkan

E. Hasil Pengamatan

1. Tabel Hasil Pengamatan

a. Tabel panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang (nm)Absorbansi

540

545

550

555

5600,096

0,098

0,099

0,098

0,096

b. Tabel kurva standar

Konsentrasi (ppm)Absorbansi

200

400

600

800

10000,021

0,082

0,099

0,118

0,207

c. Tabel kadar protein

NoSampelAbsorbansiKadar (%)

1.

2.

3.

4.

5.

6.Susu kedelai

Telur bebek

Susu Sapi

Telur ayam kampung

Telur ayam ras

Telur puyuh0.240

0.019

0,749

0,030

0,022

0,00312,59

1,76

37,54

2,30

1,91

0,98

2. Perhitungan

a. Pembuatan larutan baku

1). 200 ppm

M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 1 mL = M2 . 10 mL

M2 = 200 ppm

2). 400 ppm

M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 2 mL = M2 . 10 mL

M2 = 400 ppm

3). 600 ppm

M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 3 mL = M2 . 10 mL

M2 = 600 ppm

4). 800 ppm

M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 4 mL = M2 . 10 mL

M2 = 800 ppm

5). 1000 ppm

M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 5 mL = M2 . 10 mL

M2 = 1000 ppm

b. Uji kuantitatif

NilaiA= - 0,017

B= 0,000204

r= 0,9565

Persamaan regresi kurva baku ialah y = 0,000204x 0,017

1). Susu kedelai

2). Telur bebek

3). Susu sapi

4). Telur ayam kampung

5). Telur ayam ras

6). Telur puyuh

3. Grafik

a. Kurva panjang gelombang maksimum

b. Kurva baku standar albumin

4. Reaksi

+ CuSO4 + NaOH

+ Na2SO4 + H2O

F. PembahasanPercobaan ini mengenai penentuan kadar protein dalam bahan makanan secara spektrofotometri yang bertujuan untuk memahami dan dapat melakukan penetapan kadar protein seara spektrofotometri. Protein merupakan zat makanan yang paling kompleks, terdiri dari karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, sulfur dan basa forfor. Protein merupakan makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Fungsi protein yaitu sebagai bahan bakar energi bagi tubuh, sebagai zat pembangun dan memberbaiki sel-sel yang rusak, untuk pertumbuhan, pemeliharaan jaringan, pembentukan senyawa tubuh yang esensial. Protein juga mampu membentuk antibodi, sebagai transportasi nutrien dan regulasi keseimbangan air. Fungsi protein yang tidak kalah penting yakni sebagai katalik (mempercepat laju reaksi). Protein dalam bahan pangan umumnya ditemukan pada kacang-kacangan, produk daging, telur, susu dan makanan laut.Penentuan kadar protein pada percobaan kali ini dilakukan dengan cara menentukan panjang gelombang maksimum untuk pembuatan kurva kalibrasi terlebih dahulu. Panjang gelombang maksimum merupakan panjang gelombang dimana didapatkan absorbansi maksimum pada sampel. Pemilihan panjang gelombang maksimum ini, ditentukan dengan maksud untuk mendapatkan absorbansi maksimum dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu sehingga didapatkan kepekaan yang tinggi untuk dapat ditentukan kurva kalibrasinya. Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan, dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu sinar yang digunakan dianggap monokromatis, penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama, senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut, tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi, dan indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan kurva kalibrasi menunjukkan hubungan antara konsentrasi baku dan absorbansi sehingga diperoleh persamaan regresi linier. Persamaan regresi ini digunakan untuk menghitung kadar protein didalam sampel. Larutan standar yang digunakan dalam percobaan ini adalah albumin standar. Albumin standar digunakan bertujuan sebagai pembanding antara sampel yang akan diuji. Larutan stok adalah larutan yang dibuat diawal dengan konsentrasi tinggi untuk mempermudah pembuatan larutan seri konsentrasi dengan pengenceran. Tujuan dibuatnya larutan stok adalah untuk menghindari penimbangan yang berulang-ulang dalam setiap pembuatan larutan seri konsentrasi dan mempermudah pengerjaan. Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan dengan membuat seri konsentrasi dengan menggunakan albumin standar yang diencerkan dengan aquadest dengan penambahan pereaksi biuret. Tujuan dari pengenceran ini yaitu untuk menurunkan konsentrasi albumin, karena jika terlalu tinggi maka, albumin yang akan bereaksi dengan biuret akan terlalu pekat sehingga mengganggu proses pembacaan absorbansi oleh spektrofotometer. Setelah pembuatan larutan seri konsentrasi albumin standar maka dibuat blanko standar yang berisi pereaksi biuret dengan aquades, fungsi dari blanko yaitu untuk mengukur serapan pereaksi yang digunakan sehingga jumlah serapan protein sendiri adalah nilai absorbansi larutan standar atau sampel (mengandung pereaksi) dikurang dengan serapan pereaksinya. Sedangkan larutan seri konsentrasi berfungsi untuk menentukan kurva kalibrasi dimana masing-masing larutan seri konsentrasi tersebut akan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer sehingga dapat ditentukan panjang gelombang maksimum dan kurva kalibrasinya.Pada penentuan kurva kalibrasi ini didapatkan nilai a = -0,17; b = 0,000204; dan nilai r = 0,9565, sehingga didapat persamaan regresi linear y = 0,000204x 0,017. Koefisien korelasi menunjukkan adanya hubungan proporsional antara absorbansi dan konsentrasi larutan. Nilai r positif menunjukkan korelasi yang berbanding lurus antara konsentrasi terhadap absorbansinya pada rentang konsentrasi larutan standar tersebut. Koefisien korelasi (r) dikatakan baik apabila mendekati 1. Nilai r yang diperoleh pada percobaan berada dalam rentang nilai antara -1 R 1 dan mendekati 1, sehingga dapat dikatakan linearitas data yang diperoleh antara konsentrasi dan absorbansi cukup baik dan metode tersebut dapat digunakan untuk analisis kadar protein.Prinsip dari spektofotometri berdasarkan hukum Lambert-Beer adalah apabila cahaya monokromatik melalui suatu media maka serapan cahaya tersebut diserap dan sebagian dipancarkan. Energi cahaya yang diserap kemudian akan diubah menjadi listrik dan fotosel yang akan dicatat, dimana besarnya energi listrik sebanding dengan sinar atau cahaya yang masuk sehingga semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap.Metode biuret merupakan metode yang digunakan untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung ikatan peptida (gugus amida). Uji biuret merupakan jenis pengujian untuk identifikasi protein secara umum. Berarti uji Biuret akan selalu memberikan hasil positif untuk semua jenis protein. Keuntungan dari metode biuret ini adalah bahan yang digunakan relatif murah akan tetapi kelemahan dari metode ini adalah sensitivitas terhadap bahan yang diidentifikasi rendah sehingga diperlukan bahan dalam jumlah yang tidak sedikit.Reagen biuret terdiri dari CuSO4, KI, Na-sitrat, Na2CO3 dan NaOH. CuSO4 sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. KI berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Na-sitrat dan Na2CO3 berfungsi sebagai buffer dan NaOH berfungsi sebagai penyedia suasana basa. Suasana basa akan membantu membentuk Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Hal ini membantu untuk membentuk kompleks dengan nitrogen dari karbon dari ikatan peptida dalam larutan basa. Perubahan pada warna sampel uji akan memberikan hasil yang positif atau negatif.Prinsipnya adalah pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa. Terjadinya warna ungu terbentuk dari ikatan antara Cu2+ dan N, dimana Cu2+ sebagai asam lewis dan N sebagai basa lewis. Makin panjang suatu ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk makin jelas dan makin pekat. Reagen Biuret adalah larutan berwarna biru muda, yang berubah menjadi ungu bila bercampur dengan larutan yang mengandung protein. Sebuah kompleks berwarna ungu terbentuk ketika ion tembaga dari reagen biuret bereaksi dengan ikatan peptida pada rantai polipeptida. Uji biuret ini dapat digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya ikatan peptida dalam suatu senyawa sehingga uji biuret dapat dipakai untuk menunjukan adanya senyawa protein.Penentuan kadar protein dilakukan dengan menimbang sampel dan kemudian diencerkan dengan aquades pada labu. Fungsi penambahan aquadest ini adalah sebagai pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel, kemudian ditambah NaOH 0,5 M untuk membantu melarutkan sampel, NaOH dapat menyebabkan hidrolisis ikatan peptida dari polimer protein sehingga sampel dapat larut dalam aquades. Setelah itu, ditambah dengan pereaksi biuret dan didiamkan 10 menit kemudian ditambahkan aquades dan dihomogenkan. Tujuan dari didiamkan adalah untuk memberi waktu bagi pereaksi biuret untuk bereaksi dengan protein dalam sampel dan tujuan dari penambahan biuret adalah agar Cu2+ yang terdapat pada biuret dapat membentuk ikatan kompleks ungu dengan protein pada sampel. Tujuan penghomogenan adalah untuk mempercepat reaksi antara protein dengan pereaksi biuret dengan cara meningkatkan kontak antara protein dengan ion Cu2+ yang terdapat pada pereaksi biuret. Selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 550 nm dan kemudian ditentukan kadar protein total.Dari hasil pengukuran kadar protein total pada sampel, didapatkan kadar protein total pada susu kedelai, telur bebek, susu sapi, telur ayam kampung, telur ayam ras dan telur puyuh yang didapat dari perhitungan berturut-turut adalah 12,59%, 1,76%, 37,54%, 2,30%, 1,91%, 0,98%. Berdasarkan data yang diperoleh kadar protein dari yang paling besar ke yang terkecil yaitu susu sapi, susu kedelai, telur ayam kampung, telur ayam ras, telur bebek, telur puyuh, hal ini tidak sesuai dengan literatur yang menyatakan kadar protein dari tinggi ke rendah yaitu telur ayam kampung, telur puyuh, telur bebek, telur ayam ras, susu sapi, susu kedelai. Kesalahan yang terjadi dikarenakan saat penghomogenan tidak homogen secara sempurna dan adanya koloid pada susu yang mengakibatkan absorbansi yang diperoleh tidak tepat sehingga kadar yang diperoleh kurang tepat.

G.Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:

1. Kadar protein susu kedelai adalah 12,59%

2. Kadar protein susu sapi adalah 37,54%

3. Kadar protein telur ayam kampung adalah 2,30%

4. Kadar protein telur ayam ras adalah 1,91%

5. Kadar protein telur bebek adalah 1,16%

6. Kadar protein telur puyuh adalah 0,98%

DAFTAR PUSTAKA

Carpette. 2005. An Introduction to Practical Biochemistry. Mc Graw Hill Book Company: Great Britany

Husni, Elidahanum. 2008. Analisa Zat Pengawet dan Protein dalam Makanan Siap Saji Sosis. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi Vol. 13 No.1Katili, Abu Bakar Sidik. 2009. Struktur dan Fungsi Protein Kalogen. Jurnal Pelangi Ilmu Vol. 2 No. 5

Lehninger, Albert L, 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid I. Penerbit Erlangga: Jakarta.

Maharani, Endang Triwahyuni dan Yusrin. 2010. Kadar Protein Kista Artemia Curah yang dijual Petambak Dikota Kembang dengan Variasi Suhu Penyimpanan. Jurnal Pra Sidang Seminar Nasional Vol. 1 No. 1

Poedjiadi, Anna. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia Press: Jakarta

Sandjaja. 2009. Kamus Gizi. Penerbit Buku Kompas: Jakarta

Sumarni. 2002. Estimasi Kadar Protein Dalam Bahan Pangan Melalui Analisis Nitrogen Total dan Analisis Asam Amino. Jurnal Majalah Farmasi Indonesia Vol. 1 No. 13 EMBED ChemDraw.Document.6.0

EMBED ChemDraw.Document.6.0

_1481439627.cdx

_1481439629.cdx