Penyakit Layu Stewart pada Tanaman Jagung di Bali: Karakter … · 2017. 6. 4. · 5 Pantoea stewartii subsp stewartii pertama kali dilaporkan telah muncul di Indonesia pada tahun

1

2

3

Penyakit Layu Stewart pada Tanaman Jagung di Bali: Karakter Molekuler

Patogen dan Peta Sebarannya

I Gede Rai Maya Temaja*, G.N. Alit Susanta Wirya*, Ni Made Puspawati*

dan Khairun Nisak Syahdu**

*Fakultas Pertanian Universitas Udayana

**Mahasiswa S2 Bioteknologi Pertanian Universitas Udayana

ABSTRAK

Survei penyakit menemukan gejala menyerupai penyakit layu stewart yaitu garis

hijau pucat sampai kekuningan pada tanaman jagung (Zea mays L) di daerah Denpasar,

Tabanan, Gianyar dan Karangasem. Deteksi patogen dengan metode polymerase chain

reaction dilakukan menggunakan DNA total yang diisolasi dari daun tanaman bergejala

dan pasangan primer CPSL1/CPSR2c. Amplikon dengan ukuran sesuai yang

diharapkan (~1100 bp) berhasil diperoleh dari sampel asal Denpasar. Analisis sekuen

nukleotida dari produk PCR tersebut memastikan bahwa patogen penyebab gejala layu

stewart tersebut adalah Pantoea stewartii subsp stewartii. Analisis homologi sekuen

nukleoitda dan filogenetika menunjukkan bahwa Pantoea stewartii subsp stewartii

isolat Bali memiliki tingkat homologi yang tinggi (98,97-99,08%) dan berada satu klade

dengan isolat asal Kanada, USA, dan Jepang. Hasil deteksi dan identifikasi ini

merupakan laporan pertama di provinsi Bali mengenai Pantoea stewartii subsp

stewartii yang menginfeksi tanaman jagung.

ABSTRACT

Typical symptoms of stewart’s wilt disease ie pale-green to yellow, linear

streaks symptoms occur on leaves was observed on corn (Zea mays L) around Denpasar,

Tabanan, Gianyar and Karangasem, during a survey in 2015. Pathogen detection based

on polymerase chain reaction was carried out using total DNA isolated from

symptomatic leaf samples and a pairs of primers, CPSL1/CPSR2c. The expected size

(~1100 bp) amplicon was detected from samples from Denpasar. Sequence analysis

confirmed that stewart’s wilt diseases symptom caused by Pantoea stewartii subsp

stewartii bacteria. Nucleotide sequence and phylogenetic analysis showed that Pantoea

stewartii subsp stewartii from Bali has high homology (98.97-99.08%) to and belongs

to the same clade with isolates from Canada, USA and Japan. This is the first report of

Pantoea stewartii subsp stewartii on corn in Bali.

PENDAHULUAN

Jagung sebagai bahan pangan pokok kedua setelah beras, selain sebagai sumber

karbohidrat juga merupakan sumber protein yang penting dalam menu masyarakat di

Indonesia. Akan tetapi, dengan pesatnya perkembangan industri peternakan, jagung

merupakan komponen utama (60%) dalam ransum pakan. Diperkirakan lebih dari 55%

4

kebutuhan jagung dalam negeri digunakan untuk pakan, sedangkan untuk konsumsi

pangan hanya sekitar 30%, dan selebihnya untuk kebutuhan industri lainnya dan bibit

(Kasryno et al., 2007). Dalam kurun waktu lima tahun terakhir kebutuhan jagung untuk

bahan baku industri pakan, makanan, dan minuman meningkat 10-15% per tahun,

sementara itu pertumbuhan produksi hanya 6,11%. Kecenderungan konsumsi jagung di

Indonesia yang makin meningkat lebih tinggi dari peningkatan produksi, menyebabkan

makin besarnya jumlah impor.

Untuk memenuhi kebutuhan jagung Indonesia melakukan impor dari beberapa

negara antara lain USA, Jepang, Brazil, Argentina, India, Thailand, Pakistan, Myanmar,

dan Ukraina. Dengan tingginya impor jagung ke Indonesia semakin tinggi kemungkinan

terbawa masuk dan tersebar OPTK A1 yang dapat terbawa melalu biji jagung, salah

satunya adalah Pantoea stewartii subsp. stewartii. Pantoea stewartii subsp stewartii

merupakan bakteri penyebab penyakit layu stewart yang endemik di Amerika Serikat

dan telah tersebar dibeberapa negara didunia, antara lain di Eropa (Austria, Yunani,

Polandia, Rumania, Rusia), Asia (China, Jepang, Malaysia, Thailand, Vietnam) dan

Amerika (Kanada, Meksiko, Amerika Serikat) (Munkvold, 2001; EPPO, 2007). Bakteri

ini biasanya menginfeksi tanaman jagung varietas jagung manis (Thai Agricultural

Standard, 2008). Pantoea stewartii subsp. stewartii menghasilkan exstraceluler

polysacharide (EPS) yang berhubungan dengan patogenisitas dan virulensi (Bradbury,

1967). Umumnya gejala penyakit layu stewart berupa luka pada daun, goresan hijau

sampai kuning dengan pinggiran yang tak beraturan dan bergelombang di sepanjang

tulang daun dan juga pada seluruh permukaan daun (Zuroidah et al., 2012). Tanaman

jagung manis lebih rentan terinfeksi layu bakteri, dengan gejala daun menjadi hijau

pucat, terdapat garis sejajar tulang daun. Garis tersebut lama kelamaan mengering dan

menjadi kecoklatan (EPPO, 2007). Pantoea stewartii subsp stewartii mempunyai inang

utama tanaman jagung dan inang sekundernya adalah gandum. Selain itu Pantoea

stewartii subsp stewartii juga menginfeksi tanaman dari family Poaceae yang

dibudidayakan di Amerika Utara seperti Tripsacum dactyloides, dan Zea mexicana.

Beberapa gulma juga menjadi inang alternatif dari Pantoea stewartii subsp stewartii dan

tidak memperlihatkan adanya gejala pada gulma yang terinfeksi tersebut. Pantoea

stewartii subsp stewartii dapat ditularkan melalui vektor Chaetocnema pulicaria dan

juga benih jagung yang telah terinfeksi (Pataky, 2004)

5

Pantoea stewartii subsp stewartii pertama kali dilaporkan telah muncul di

Indonesia pada tahun 2010, yaitu di Padang, Sumatera Barat (Rahma et al., 2010).

Survey yang dilakukan penulis pada tahun 2015, menemukan beberapa insiden penyakit

yang menunjukkan gejala menyerupai infeksi penyakit layu stewart yang ciri-cirinya

seperti garis hijau pucat sampai kekuningan pada daun jagung di desa Kesiman

Kertalangu, kota Denpasar. Penelitian dilakukan untuk mengidentifikasi penyebab

gejala layu stewart pada tanaman jagung.

BAHAN DAN METODE

Survei Penyakit

Survei dilakukan untuk mendapatkan gambaran mengenai penyebaran

penyakit layu stewart pada tanaman jagung di Bali. Survei dilakukan di semua

Kabupaten dan Kota di Bali. Pengamatan meliputi jenis jagung yang menunjukkan

gejala layu stewart. Pengambilan sampel di lapangan dilakukan dengan metode

purposive random sampling yaitu dengan mengambil tanaman yang bergejala secara

acak. Pengambilan dilakukan untuk masing-masing sampel dengan cara mencabut

tanaman jagung yang bergejala kemudian dimasukkan kedalam plastik sampel untuk

dibawa ke laboratorium dan selanjutnya dilakukan deteksi patogen dengan

menggunakan metode Polymerase Chain Reaction. Insiden dan intensitas penyakit

dihitung dengan rumus:

a. Insiden Penyakit

IP = (n / N) x 100%

Keterangan :

n = jumlah tanaman yang menunjukkan gejala penyakit

N = jumlah total tanaman yang dihitung dalam satu luasan lahan

b. Intensitas Penyakit

Keterangan :

I = Intensitas penyakit

ni =Jumlah daun dari tiap kategori serangan

vi = nilai skala dari tiap kategori serangan

N = Jumlah daun yang diamati

vmax = nilai kategori serangan tertinggi

6

Deteksi patogen dengan PCR

Ekstraksi DNA dan Amplifikasi gen CPS. DNA total diekstraksi dari daun

jagung bergejala menggunakan Kit DNeasy Plant Minikit (Qiagen). Amplifikasi gen

capsule biosynthesis (CPS) dilakukan dengan teknik PCR menggunakan pasangan

primer CPSL1 (CCTGTCAGTCTCGAACC); dan CPSR2c (ATCTCGAA

CCGGTAACC) dengan produk PCR 1100 bp. Amplifikasi dilakukan pada Gene Amp

PCR System 9700 thermocycler, dengan program: predenaturasi pada 94°C selama 5

menit, dilanjutkan dengan 25 siklus denaturasi 940C selama 1 menit; Annealing 54

0C

selama 1 menit dan ekstensi 720C 30 detik. Siklus terakhir ditambah tahapan sintesis

selama 10 menit, kemudian siklus berakhir dengan suhu 4°C. Produk PCR

dielektroforesis pada gel agarose 1,2% yang dijalankan pada 80 V selama 1 jam. Gel

diwarnai dalam 2 µg/ml ethidium bromida dalam buffer elektroforesis (40 mM Tris, 20

mM sodium acetate, dan 1 mM EDTA, pH 7,0) dan divisualisasi pada UV

transluminator.

Sekuensing dan Analisis Filogenetik. Fragmen DNA hasil PCR ditentukan

dengan menggunakan ABIPrism 3100-Avant Genetic Analyzer. Sekuen DNA

selanjutnya diedit menggunakan program software ChromasPro versi 1.5. Analisis

sekuen untuk mengetahui tingkat homologinya dengan sekuen yang telah didepositkan

pada GenBank dilakukan dengan software BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool) melalui situs resmi: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (Thompson et la.,

1997). Data sekuen nukleotida yang terpilih kemudian dimodifikasi dan analisis

spesifisitas nukleotida dilakukan dengan program multiple alignment (ClustalW) yang

terintegrasi pada program software MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)

versi 6.0. Pohon filogeni dikonstruksi menggunakan program software PAUP 4.0b10

dengan metoda Neighbor Joining (NJ) berdasarkan pendekatan MP (Maximum

Parsimony) dan bootstrap 1.000 ulangan (Brady et al., 2012). Kemudian, pohon filogeni

ditampilkan menggunakan program software TreeGraph 2.0 (Stover & Muller, 2010).

7

HASIL

Keberadaan pertanaman jagung, terutama jagung manis sangat berkaitan erat

dengan munculnya gejala layu stewart yang disebabkan oleh bakteri Pantoea stewartii

subsp stewartii. Pada penelitian ini gejala tanaman jagung yang terinfeksi layu stewart

terdapat di Desa Kesiman Kertalangu, Kota Denpasar, Desa Kediri Kabupaten Tabanan,

Desa Blahbatuh Kabupaten Gianyar dan Desa Manggis Kabupaten Karangasem. Gejala

layu stewart yang menginfeksi tanaman jagung didaerah tersebut, pada daunnya terlihat

adanya garis lurus berwarna hijau muda kekuningan yang sejajar dengan tulang daun

(Gambar 1).

Berdasarkan tanaman yang bergejala layu stewart di lapangan, insiden penyakit

tertinggi (23 %) terjadi di desa Kesiman Kertalangu, Denpasar, sedangkan insiden

penyakit paling rendah (11 %) di desa Manggis, Karangasem (Tabel 1). Intensitas

penyakit tertinggi terdapat di kota Denpasar dan Kabupaten Gianyar sebesar 10% dan

terendah terdapat di Kabupaten Karangasem yaitu sebesar 3%.

Deteksi dengan PCR hanya berhasil mengamplifikasi pita DNA dari sampel asal

Desa Kesiman Kertalangu, Kota Denpasar. Pita DNA berukuran ~1100 bp didapatkan

dari amplifikasi menggunakan pasangan primer CPSL dan CPSR2c yang

mengamplifikasi gen CPS (Gambar 2). Fragmen DNA yang dihasilkan selanjutnya

dipurifikasi dan disekuensing untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan kemiripan

dengan spesies bakteri yang telah teridentifikasi di Genbank. Berdasarkan hasil

penjajaran sekuen dengan database GenBank menggunakan program BLAST, bakteri

isolat Denpasar (yang selanjutnya dinamakan Isolat Bali) memiliki kekerabatan yang

dekat dengan Pantoea stewartii subsp stewartii isolate DOAB 021 (EU215383.1) asal

Kanada, Pantoea stewartii subsp stewartii strain DC283 (AF077292.2) asal USA,

Pantoea stewartii subsp stewartii cpsD (AB894429.1) asal Jepang, dan Pantoea

stewartii subsp stewartii isolate DOAB 022 (EU215384.1) asal Kanada, masing-

masing dengan tingkat kesamaan 98,97; 98,97; 99,08; dan 99,08% (Tabel 2). Hasil

analisis pohon filogeni menggunakan metoda Neighbor Joining (NJ) dengan 1000 kali

ulangan Bootstrap dan pendekatan Maximum Parsimony menunjukkan bahwa Isolat

Bali adalah Pantoea stewartii subsp stewartii, karena satu klade dengan sekuen-sekuen

bakteri Pantoea stewartii subsp stewartii dengan dukungan 100% Bootstrap Support

(BS) (Gambar 3).

8

Gambar 1. Gajala Layu Stewart yang ditemukan di pertanaman jagung Desa Kesiman

Kertalangu, Denpasar yaitu pada daunnya terlihat adanya garis lurus

berwarna hijau muda kekuningan yang sejajar dengan tulang daun.

Tabel 1. Insiden dan Intensitas Penyakit Layu Stewart di Provinsi Bali

Sampel Insiden

Penyakit

(%)

Intensitas

Penyakit

(%)

Gejala Penyakit

Denpasar 23 10 Garis kuning membujur sejajar tulang daun.

Tabanan 16 5 Garis kuning membujur sejajar tulang daun.

Gianyar 21 10 Garis kuning tidak beraturan sejajar tulang daun

Karangasem 11 3 Bercak kuning pada daun dan layu

Gambar 2. Hasil PCR menggunakan primer CPSL1 dan CPSR2c berhasil

mengamplifikasi isolat dari Denpasar (1,2). Sedangkan isolat-isolat

dari Tabanan (3,4); Gianyar (5,6); dan Karangasem (7,8) tidak

teramplifikasi. M: Marker DNA 100bp (Fermentas)

1100bp

1 2 M 3 4 5 6 7 8

9

Tabel 2. Matrik similaritas Pantoea stewarti subsp stewartii isolat Bali dan isolat

homologinya yang terdaftar di GeneBank berdasarkan sekuen gen CPS (%)

Keterangan:

1. Erwinia tasmaniensis strain ET1 99 (CU468135.1), 2. Erwinia pyrifoliae

DSM 12163 (FN392235.1), 3. Erwinia pyrifoliae strain Ep1 96 (FP236842.1), 4.

Pantoea ananatis PA13 (CP003085.1), 5. Pantoea ananatis LMG 5342

(HE617160.1), 6. Isolate Bali, 7. Pantoea stewartii subsp stewartii isolate DOAB

021 (EU215383.1), 8. Pantoea stewartii subsp stewartii strain DC283

(AF077292.2), 9. Pantoea stewartii subsp stewartii cpsD (AB894429.1), 10.

Pantoea stewartii subsp stewartii isolate DOAB 022 (EU215384.1), 11.

Pantoea rwandensis strain ND04 (CP009454.1), 12. Cedecea neteri strain ND02

(CP011427.1), 13. Serratia liquefaciens ATCC 27592 (CP006252.1), 14. Pantoea

ananatis AJ13355 DNA (AP012032.2), 15. Pantoea ananatis strain R100

(CP014207.1), 16. Pantoea ananatis LMG 20103 (CP001875.2), 17. Pantoea

agglomerans strain FDAARGOS 160 (CP014129.1), 18. Pantoea vagans C9 1

(CP00220.1), 19. Erwinia billingiae strain Eb661 (FP236843.1), 20. Erwinia

amylovora ATCC BAA 2158 (FR719191.1), dan 21. Erwinia amylovora

CFBP1430 (FN434113.1)

10

Gambar 3. Filogeni kekerabatan P. stewartii subsp stewartii isolat Bali terhadap isolat-

isolat homologinya yang terdaftar di GeneBank. Hasil analisis

menggunakan metoda Neighbor Joining (NJ) dengan menggunakan 1000

kali ulangan Bootstrap dan pendekatan Maximum Parsimony menunjukkan

bahwa Isolat Bali adalah Pantoea stewartii subsp stewartii, karena satu

klade dengan sekuen-sekuen bakteri Pantoea stewartii subsp stewartii

dengan dukungan 100% Bootstrap Support (BS).

PEMBAHASAN

Gejala seperti serangan penyakit layu stewart pada tanaman jagung di Desa

Kesiman Kertalangu, Kota Denpasar; Desa Kediri Kabupaten Tabanan; Desa Blahbatuh

Kabupaten Gianyar dan Desa Manggis Kabupaten Karangasem, umumnya daunnya

terlihat adanya garis lurus berwarna hijau muda kekuningan yang sejajar dengan tulang

daun. Gejala layu stewart yang terdapat pada pertanaman jagung ini sesuai dengan yang

diungkapkan oleh Stack et al. (2002), yang mengatakan bahwa daun memperlihatkan

garis hijau pucat sampai kuning. Berdasarkan gejala ini, intensitas penyakit

menunjukkan bahwa tingkat infeksi penyakit di lapangan adalah ringan dan belum

ditemukan adanya vektor kumbang Chaetocnema pulicaria. Menurut Suparyono &

Pataky (1989), jagung dikategorikan rentan apabila intensitas penyakit mencapai 40 –

100%.

11

Amplifikasi berhasil mendapatkan fragmen berukuran ~1100 bp dari sampel

daun asal Denpasar, sedangkan sampel dari kabupaten Tabanan, Gianyar dan

Karangasem menunjukkan hasil negatif. Hal ini sesuai dengan apa yang didapatkan

pada uji morfologi koloni bakteri yaitu hanya sampel dari Denpasar yang dapat

dikulturkan.

Hasil BLAST menunjukkan bahwa bakteri isolat Denpasar (yang selanjutnya

dinamakan Isolat Bali) memiliki kekerabatan yang dekat dengan isolat Pantoea

stewartii subsp stewartii asal Kanada (EU215383.1 dan EU215384.1), asal USA

(AF077292.2), dan asal Jepang (AB894429.1). Analisis pohon filogeni menunjukkan

bahwa Isolat Bali adalah Pantoea stewartii subsp stewartii, karena satu klade dengan

sekuen-sekuen bakteri Pantoea stewartii subsp stewartii dengan dukungan 100%

Bootstrap Support (BS). Dharmayanti (2011) menyatakan bahwa untuk cabang-cabang

dalam topologi filogenetika dapat diprediksi menjadi signifikan jika set data resampled

seharusnya berulang kali (sebagai contoh > 70%) dalam memprediksi cabang-cabang

yang sama.

Kedekatan jarak genetik antara isolat Pantoea stewartii subsp stewartii isolat

Bali dengan isolat Pantoea stewartii subsp stewartii dari Kanada, USA dan Jepang

dimungkinkan karena adanya lalulintas komoditi pertanian antar negara dan antar area,

sehingga bakteri tersebut dapat terbawa memalui benih yang masuk ke wilayah Propinsi

Bali. Penyakit layu stewart yang disebabkan oleh bakteri Pantoea stewartii subsp

stewartii muncul pertama kali di Indonesia pada tahun 2010 (Rahma et al, 2010) dan

sesuai dengan Peraturan Menteri Pertanian No.51/ Tahun 2015 Pantoea stewartii subsp

stewartii merupakan OPTK (Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina) golongan

A1 yaitu OPTK yang tidak dapat dibebaskan melalui perlakuan. Persebaran Pantoea

stewartii subsp stewartii di Propinsi Bali masih sedikit dan hanya bersifat spot didaerah

tertentu saja.

Berdasarkan hasil identifikasi di atas dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri

yang berasal dari desa Kesiman Kertalangu, Denpasar merupakan bakteri Pantoea

stewartii subsp. stewartii yang menyebabkan penyakit layu stewart pada tanaman

jagung di Denpasar. Penyakit ini baru ditemukan hanya di kota Denpasar dan belum

pernah dilaporkan di provinsi Bali. Penelitian dasar untuk mengetahui karakter

12

molekuler dan biologi Pantoea stewartii subsp. stewartii perlu dilakukan sebagai

landasan menyusun strategi pengendalian.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini dibiayai oleh Direktorat Riset dan Pengabdian Masyarakat,

Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan, Kementerian Riset, Teknologi,

dan Pendidikan Tinggi melalui Penelitian Fundamental dengan Surat Perjanjian

Penugasan Pelaksanaan Penelitian No. 486.132/UN14.2/PNL.01.03.00/2016.

DAFTAR PUSTAKA

Bradbury JF. 1967. CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria No. 123. CAB

International, Wallingford, UK.

Brady CL, Cleenwerck I, Westhuizen LVD, Venter SN, Coutinho TA, Vos PD. 2013.

Pantoea rodasii sp. nov., Pantoea rwandensis sp. nov. and Pantoea wallisii sp.

nov., isolated from Eucalyptus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 1457–1464.

Dharmayanti NLPI. 2011. Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi Organisme

Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa. 21(1): 15-18.

EPPO. 2007. Pantoea stewartii subsp. stewartii. Data Sheet on Quarantine Pests: EPPO

Kasryno F, Pasandaran E, Suyamto, Adnyana MO. 2007. Gambaran Umum Ekonomi

Jagung Indonesia. Di dalam: Hermanto, Suyamto, Sumarno, editor. Jagung.

Teknik Produksi dan Pengembangan. Puslitbang Tanaman Pangan. Bogor. hlm.

474-497.

Munkvold GP. 2001. Corn Stewart’s Desease. Iowa: Iowa State University, University

Extension.

Pataky JK. 2004. Stewart’s Wilt of Corn, The Plant Health Instructor. Illionis:

University of Illionis

Rahma H, Nurbailis, Liswarni Y, Puspita Y. 2010. Uji virulensi beberapa isolat Pantoea

stewartii penyebab layu stewart pada bibit jagung (Zea mays L). Manggaro.

11(1): 12-17

Stack J, Chaky J, Giesler L. 2002. Publication Wilt of Corn in Nebraska.

http://www.unl.edu/unpub/search/default.shtml. [ 5 Februari 2016].

Stover BC, Muller KF. 2010. TreeGraph 2: combining and visualizing evidence from

different phylogenetic analyses. BMC Bioinformatics. 11 (7): 1-9.

Suparyono, PatakyJK. 1989. Influence of host resistance and growth stage at the time of

inoculation on Stewart’s wilt and Goss’s wilt development and sweet corn

hybrid yield. Plant Disease. 73:339-345

Thai Agriculture Standard. 2008. Diagnostic Protocol for Pantoea stewartii subsp

stewartii Bacterial Wilt of Maize. National Bureau of Agriculture Commodity

and Food Standard. Ministry of Agriculture and Cooperatives, Bangkok

13