Top Banner
PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN ASIATIKOSIDA DARI PEGAGAN (Centella asiatica) DWI ERNAWATI DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
42

PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

Mar 28, 2019

Download

Documents

trinhnhi
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN ASIATIKOSIDA DARI PEGAGAN (Centella asiatica)

DWI ERNAWATI

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2014

Page 2: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas
Page 3: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pengoptimuman

Ekstraksi dan Pemurnian Asiatikosida dari Pegagan (Centella asiatica) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Februari 2014

Dwi Ernawati

G44090056

Page 4: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas
Page 5: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

ABSTRAK

DWI ERNAWATI. Pengoptimuman Ekstraksi dan Pemurnian Asiatikosida dari Pegagan (Centella asiatica). Dibimbing oleh LATIFAH K DARUSMAN dan WULAN TRI WAHYUNI.

Ekstraksi asiatikosida dari pegagan sudah banyak dilakukan, tetapi metode

yang optimum masih perlu dikembangkan. Penelitian ini bertujuan menentukan metode ekstraksi yang optimum dan pemurnian asiatikosida dari pegagan. Parameter ekstraksi yang digunakan ialah suhu, waktu, dan pelarut dengan bantuan ultrasonik. Kadar asiatikosida diukur dengan spektrofotometer ultraviolet-visible. Ekstrak yang mengandung asiatikosida paling tinggi difraksionasi dengan kromatografi kolom menggunakan kloroform:metanol secara gradien bertahap. Kadar dan kemurnian asiatikosida dianalisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Kondisi ektraksi yang optimum terdapat pada pelarut etanol suhu 30 °C dengan bantuan sonikasi selama 15 menit. Fraksi asiatikosida dapat dipisahkan dengan kromatografi kolom saat elusi kloroform:metanol nisbah 6:4, 5:5, dan 4:6. Kadar asiatikosida yang diperoleh ialah 23.14 mg/g fraksi KLT preparatif 1 dan 193.75 mg/g fraksi KLT preparatif 2 dengan persentase kemurnian masing-masing kurang dari 50%.

Kata kunci: asiatikosida, ekstraksi, pegagan.

ABSTRACT DWI ERNAWATI. Extraction Optimization and Purification of Asiaticoside from Centella asiatica. Supervised by LATIFAH K DARUSMAN and WULAN TRI WAHYUNI.

Extraction of asiaticoside from Centella asiatica has already reported but the

effective extraction method should be continuously developed. This study was developed to find an effective extraction and purification method of asiaticoside from this species. Extraction parameter such as temperature, time, and solvent were varied and extraction was conducted using ultrasonic. Asiaticoside content from crude extract was determined using ultraviolet-visible spectrophotometer. Asiaticoside from the extract was further isolated by column chromatography with chloroform: methanol as using step gradient elution. The concentration and purity of asiaticoside fraction from preparative TLC was determined using high performance liquid chromatography analysis. The optimum extraction conditions was that using ethanol as solvent at 30 °C for 15 min. The result showed that the best eluent to separate asiaticoside fraction was chloroform: methanol in 6:4, 5:5, and 4:6 ratios. The asiaticoside contents of fraction 1 and 2 was 23:14 mg/g preparative TLC fraction and 193.75 mg/g preparative TLC fraction with purity less than 50%.

Keywords: asiaticoside, Centella asiatica, extraction

Page 6: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas
Page 7: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

pada Departemen Kimia

PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN ASIATIKOSIDA DARI PEGAGAN (Centella asiatica)

DWI ERNAWATI

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2014

Page 8: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas
Page 9: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

Judul Skripsi : Pengoptimuman Ekstraksi dan Pemurnian Asiatikosida dari Pegagan (Centella asiatica)

Nama : Dwi Ernawati NIM : G44090056

Disetujui oleh

Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS Pembimbing I

Wulan Tri Wahyuni, SSi, MSi Pembimbing II

Diketahui oleh

Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS

Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

Page 10: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

Judul Skripsi: Pengoptimuman Ekstraksi dan Pemurnian Asiatikosida dari Pegagan (Centella asiatica)

Nama : Dwi Ernawati NIM : 044090056

Disetujui oleh

Prof Dr Ir Lati K Darusman, MS Wulan Tri Wahyuni, SSi, MSi Pembimbing I Pembimbing II

MS

Tanggal Lulus:

Page 11: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas
Page 12: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan hasil penelitian yang berjudul Pengoptimuman Ekstraksi dan Pemurnian Asiatikosida dari Pegagan (Centella asiatica) sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyampaikan terima kasih kepada Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS dan Wulan Tri Wahyuni, SSi, MSi selaku pembimbing atas arahan dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis. Ucapan terima kasih disampaikan kepada seluruh staf Laboratorium Kimia Analitik (Pak Eman, Pak Dede, dan Bu Nunung), staf Laboratorium Bersama (Mas Eko), dan analis di Pusat Studi Biofarmaka (Bu Nunuk, Mbak Lela, Mbak Ina, Mas Endi, dan Mas Antonio) yang telah memberikan bantuan dan masukan kepada penulis. Terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu, Ayah, Kakak, dan Adik tercinta atas doa, dukungan, dan kasih sayang yang selalu diberikan.

Semoga laporan hasil penelitian ini dapat bermanfaat.

Bogor, Februari 2014

Dwi Ernawati

Page 13: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi DAFTAR GAMBAR vi DAFTAR LAMPIRAN vi PENDAHULUAN 1 

BAHAN DAN METODE 2 

Alat dan Bahan 2 

Metode 2 

HASIL DAN PEMBAHASAN 5 

Kadar Air dan Abu 5 

Ekstrak Pegagan dan Kadar Asiatikosida 6 

Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom 7 

Pemurnian Asiatikosida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 9 

Kadar dan Kemurnian Asiatikosida dengan HPLC 11 

SIMPULAN DAN SARAN 12 

Simpulan 12 

Saran 13 

DAFTAR PUSTAKA 13 

LAMPIRAN 15

RIWAYAT HIDUP 27

Page 14: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

DAFTAR TABEL

1 Perlakuan parameter pelarut, suhu, dan waktu sonikasi 3 2 Nisbah eluen pada analisis KCKT 5 3 Rendemen hasil ekstraksi dengan parameter pelarut, suhu, dan waktu 7 4 Nilai Rf fraksi hasil KLTP dengan analisis KLT 10 5 Kadar asiatikosida hasil HPLC 12 6 Kadar asiatikosida 12 

DAFTAR GAMBAR

1 Tanaman pegagan 5 2 Struktur asiatikosida (Jia dan Lu 2008) 6 3 Profil analisis KLT sebelum (a) dan setelah (b) penyemprotan dengan

pereaksi Liebermann-Buchard dengan eluen kloroform-metanol-air 13:5:0.8 8 

4 Profil KLT dari kiri ke kanan fraksi 1 sampai fraksi 14 hasil kromatografi kolom 9 

5 Profil isolasi asiatikosida dengan KLTP (1) standar asiatikosida (2) noda yang memiliki intensitas warna ungu yang tinggi (3) noda yang memiliki warna ungu kehitaman 10 

6 Profil KLT dari kiri ke kanan (a) Larutan standar asiatikosida (b) fraksi KLTP 1 (c) fraksi KLTP 2 10 

7 Kromatogram hasil HPLC larutan (a) standar asiatikosida (b) fraksi KLTP 1 dan (c) fraksi KLTP 2 11 

DAFTAR LAMPIRAN

1 Diagram alir penelitian 15 2 Hasil determinasi tanaman pegagan 16 3 Penentuan kadar air simplisia pegagan 17 4 Penentuan kadar abu simplisia pegagan 17 5 Rendemen ekstraksi dengan parameter pelarut, suhu, dan waktu 18 6 Profil spektrum larutan standar asiatikosida pada pemayaran 200 nm

sampai 400 nm 20 7 Kadar asiatikosida pada pengukuran panjang gelombang 206 nm 20 8 Penentuan uji t 21 9 Nilai Rf dari eluen kloroform-metanol-air 13:5:0.8 22 10 Nilai Rf dari fraksi hasil kolom kromatografi 23 11 Persentase rendemen fraksi hasil kromatografi kolom 24 12 Kadar dan persentase kemurnian asiatikosida 25 

Page 15: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas
Page 16: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

PENDAHULUAN

Pegagan (Centella asiatica) merupakan tanaman liar yang tumbuh di berbagai tempat seperti di daerah-daerah lembap, rawa, dan pinggiran sawah. Tanaman ini banyak dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai tanaman obat karena memiliki beberapa khasiat, di antaranya untuk antioksidan, antibiotik, antidemam, antidiuretik, penyembuh luka, rematik, obat penurun panas, penambah nafsu makan, melancarkan peredaran darah, hepatoprotektor, dan meningkatkan daya ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan (Roni 2008). Menurut Kristina (2009), uji fitokimia pegagan menunjukkan hasil yang positif pada terpenoid, saponin, tanin, flavonoid, dan alkaloid. Kandungan bahan aktif yang paling penting adalah triterpenoid. Efek farmakologi utama dari pegagan diketahui berasal dari kandungan senyawa triterpenoid meliputi asiatikosida, sentellosida, madekosida, dan asam asiatikat. Senyawa asiatikosida sering menjadi marker pada tanaman pegagan. Asiatikosida terbukti dapat beRf ungsi sebagai antibakteri pada penelitian Reniza (2003).

Penelitian ekstraksi asiatikosida dari pegagan telah banyak dilakukan. Menurut Kim et al. (2009), asiatikosida dapat diekstraksi menggunakan pelarut air, metanol, dan etanol pada parameter suhu yang berbeda. Kadar asiatikosida tertinggi terdapat dalam ekstrak etanol pada suhu 78 °C, yaitu 17.7 mg/g ekstrak dengan ekstraksi maserasi selama 5 jam. Pada suhu ruang, kadar asiatikosida yang paling tinggi terdapat dalam ekstrak metanol, yaitu 8.2 mg/g ekstrak dengan ekstraksi maserasi selama 24 jam. Penelitian yang lain menunjukkan bahwa asiatikosida dapat diisolasi dari ekstrak etanol dengan metode pemisahan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Pengukuran kadar asiatikosida dapat dilakukan dengan KLT-densitometri (James et al. 2011). Reniza (2003) melaporkan isolasi asiatikosida melalui ekstraksi maserasi selama 24 jam, dan pemisahan dengan kromatografi kolom. Kadar yang terukur dengan KLT-densitometri sebesar 0.25 mg/g fraksi kolom. Pegagan juga dapat diekstraksi dengan metode sokhlet selama 8 jam menggunakan pelarut metanol dan diukur kadar asiatikosidanya menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) pada panjang gelombang 206 nm (Rafamantanana et al. 2009).

Metode ekstraksi maserasi membutuhkan waktu yang relatif lama agar sampel dapat terekstraksi secara optimum. Asiatikosida juga dapat diekstraksi dengan bantuan gelombang ultrasonik, yang relatif lebih cepat dibandingkan metode maserasi. Ekstraksi pegagan dengan pelarut etanol menggunakan bantuan sonikasi selama 30 menit memberikan kadar asiatikosida sebesar 3.14 mg/g ekstrak dengan pengukuran KCKT (Know et al. 2011). Ekstraksi asiatikosida dari pegagan telah banyak dilakukan tetapi pada penelitian Reniza (2003), Kim et al. (2009) dan Rafamantanana et al. (2009) memerlukan waktu ekstraksi yang relatif lama sedangkan pada penelitian Know et al. (2011) meskipun waktu ekstraksi lebih cepat tetapi kadar asiatikosida yang dihasilkan relatif rendah. Penentuan teknik ekstraksi dan pemurnian asiatikosida dari pegagan masih perlu dioptimumkan agar diperoleh metode yang paling efektif. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan menentukan metode yang optimum untuk ekstraksi dan pemurnian asiatikosida dari pegagan (Centella asiatica)

Page 17: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

2

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah peralatan kaca, penggiling, eksikator, oven, pembakar bunsen, tanur, penguap putar, spektrofotometer (UV-Vis), pelat KLT silika gel GF254, kolom kromatografi, bejana kromatografi, pelat KLT preparatif, lampu UV, KCKT, penangas ultrasonik, dan alat-alat lain yang lazim digunakan di laboratorium.

Bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman pegagan dari kebun Biofarmaka Cikabayan, etanol teknis, metanol teknis, metanol p.a, kloroform, akuades, silika gel GF254, standar asiatikosida, pereaksi Liebermann-Buchard, dan kertas saring.

Metode

Metode penelitian yang dilakukan meliputi beberapa tahap (Lampiran 1), yaitu penyiapan sampel, penentuan kadar air dan abu, dan ekstraksi sampel menggunakan bantuan sonikasi. Ekstrak yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Ekstrak dengan kandungan asiatikosida paling tinggi difraksionasi menggunakan kromatografi kolom sehingga diperoleh fraksi-fraksi, berdasarkan analisis dengan KLT dan pembandingan dengan larutan standar. Fraksi yang mengandung asiatikosida digabung dan difraksionasi lebih lanjut dengan KLT preparatif sehingga diperoleh fraksi asiatikosida. Kadar asiatikosida yang diperoleh ditentukan dengan KCKT.

Penyiapan Sampel

Pegagan dicuci sampai bersih lalu dikeringkan pada suhu 40-50 °C selama 6-7 hari menggunakan oven. Setelah kering, pegagan digiling sehingga diperoleh serbuk pegagan, yang siap untuk dianalisis. Penentuan Kadar Air (AOAC 2007)

Cawan porselen dikeringkan pada suhu 105 °C selama 30 menit. Setelah itu, cawan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan ditimbang. Sebanyak 2 g pegagan dimasukkan dalam cawan tersebut dan dipanaskan pada suhu 105 °C selama 5 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator selama 15 menit dan ditimbang. Prosedur dilakukan hingga diperoleh bobot konstan. Penentuan kadar air ini dilakukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo). Persen kadar air pegagan ditentukan dengan persamaan sebagai berikut:

Kadar air (%) = A-B

A ×100%

Keterangan: A = bobot contoh sebelum dikeringkan (g) B = bobot contoh setelah dikeringkan (g)

Page 18: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

3

Penentuan Kadar Abu (AOAC 2007) Cawan porselen dikeringkan ke dalam tanur listrik bersuhu 600 °C selama

30 menit. Kemudian cawan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak 2 g pegagan dimasukkan ke dalam cawan tersebut, lalu dipijarkan di atas nyala api pembakar bunsen sampai tidak berasap lagi. Setelah itu, cawan dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600 °C selama 2 jam hingga diperoleh abu. Cawan berisi abu didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan ditimbang. Prosedur dilakukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo). Kadar abu pegagan dihitung dengan persamaan sebagai berikut:

Kadar air (%) = B

A× 100 %

Keterangan: A = bobot sampel (g) B = bobot abu (g)

Ekstraksi

Tabel 1 Perlakuan parameter pelarut, suhu, dan waktu sonikasi

Pelarut Suhu (°C) Waktu (menit)

Etanol

30 15 30 60

40 15 30 60

50 15 30 60

Metanol

30 15 30 60

40 15 30 60

50 15 30 60

Ekstraksi pegagan dalam penelitian ini dilakukan dengan rancangan

percobaan faktorial lengkap. Ekstraksi dilakukan dengan bantuan sonikasi pada frekuensi gelombang 38 kHz. Serbuk pegagan ditimbang, lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan pelarut. Nisbah sampel dengan pelarut ialah 1:5 (b/v). Sonikasi dilakukan dengan meragamkan parameter jenis pelarut, suhu, dan waktu seperti pada Tabel 1. Setiap perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Ekstrak disaring menggunakan kertas saring lalu filtrat dipekatkan

Page 19: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

4

dengan penguap putar. Ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang dan ditentukan rendemennya. Pengukuran Kadar Asiatikosida dengan Spektrofotometer UV-Vis

Larutan standar asiatikosida 100 ppm dipayar pada rentang panjang gelombang 200 nm sampai 400 nm sehingga diperoleh panjang gelombang maksimum. Ekstrak yang diperoleh dari beberapa perlakuan ditimbang sebanyak 0.01 g dilarutkan dengan 10 mL metanol kemudian diencerkan 10 kali. Larutan sampel diukur pada panjang gelombang maksimum standar asiatikosida, yaitu 206 nm (Rafamantanana et al. 2009). Selanjutnya, ditentukan kadar asiatikosida dengan membandingkan nilai absorbansi sampel dengan standar.

Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

Sebanyak 40 g silika gel GF254 dicampurkan dengan pelarut kloroform. Campuran ini dimasukkan ke dalam kolom yang telah dibilas dengan eluen dan ujungnya diberi kapas. Panjang kolom 60 cm dengan diameter 2.5 cm. Selanjutnya kolom dielusi sampai tercapai kesetimbangan. Fase gerak dalam penelitian ini diatur secara gradien bertahap, yaitu kloroform-metanol dengan nisbah berturut-turut 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, dan 90:10 (v/v).

Sebanyak 2 g ekstrak yang mengandung kadar asiatikosida paling tinggi dilarutkan dengan 10 mL etanol kemudian diaplikasikan ke dalam kolom dan dielusi. Eluat ditampung setiap 5 mL dan dianalisis dengan KLT menggunakan fase gerak berupa campuran kloroform-metanol-air dengan nisbah 13:5:0.8 (Depkes RI 2008) dan fase diam pelat silika gel GF254. Noda yang diperoleh dideteksi di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Deteksi noda asiatikosida dilakukan dengan pereaksi Liebermann-Buchard. Kemudian nilai Rf dihitung dan dibandingkan dengan standar asiatikosida. Fraksi yang memiliki Rf yang sama dengan standar asiatikosida digabungkan menjadi 1 fraksi.

Pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Fraksi yang mengandung asiatikosida dipisahkan kembali menggunakan KLT preparatif. Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dalam 1 mL etanol kemudian ditotolkan pada lempeng KLT preparatif. Fraksi yang memiliki nilai Rf sama dengan standar asiatikosida dikerok, lalu dilarutkan dengan etanol. Larutan tersebut didekantasi, disaring, lalu dipekatkan. Asiatikosida yang diperoleh dianalisis kadarnya menggunakan KCKT. Analisis dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kadar dan kemurnian asiatikosida diukur sesuai metode Rafamantanana et al. (2009) yang telah dimodifikasi. Larutan sampel disiapkan dengan melarutkan 0.0040 g fraksi KLT preparatif dalam 5 mL metanol. Sebanyak 20 µL larutan diinjeksikan ke dalam kolom KCKT. Larutan standar asiatikosida 100 ppm juga diinjeksikan sehingga dapat dibandingkan luasnya. Kondisi KCKT yang digunakan ialah kolom C18 sebagai fase diam dan fase gerak asetonitril-air dengan nisbah yang ditunjukkkan pada Tabel 2. Kadar dan kemurnian asiatikosida ditentukan pada panjang gelombang 206 nm.

Page 20: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

5

Tabel 2 Nisbah eluen pada analisis KCKT Waktu (menit) Asetonitril Air

0.01 20 80 15 35 65 20 55 45 21 80 20 27 80 20 28 20 80 35 20 80

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kadar Air dan Abu

Pegagan (Gambar 1) yang digunakan dalam penelitian ini terlebih dahulu dideterminasi di Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Hasil determinasi (Lampiran 2) memastikan bahwa sampel yang digunakan ialah pegagan (Centella asiatica L. Urb). Pegagan mengandung beberapa bahan aktif, meliputi terpenoid, saponin, tanin, flavonoid, dan alkaloid (Kristina 2009).

Gambar 1 Tanaman pegagan

Kadar air pegagan yang diperoleh ialah 4.94% dan kadar abu sebesar 9.30%. Menurut Depkes RI (2008), kadar air herba pegagan tidak lebih dari 10% dan kadar abu tidak lebih dari 16.6% sehingga hasil yang diperoleh memenuhi syarat mutu herba pegagan. Hasil perhitungan kadar air dan kadar abu disajikan pada Lampiran 3 dan 4. Kadar air digunakan untuk mengoreksi rendemen hasil ekstraksi. Selain itu, berkaitan dengan ketahanan sampel terhadap bakteri karena kadar air yang tinggi akan menyebabkan simplisia rentan terhadap serangan jamur dan kapang. Kadar abu menunjukkan jumlah kandungan mineral yang terdapat pada sampel.

Page 21: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

6

Ekstrak Pegagan dan Kadar Asiatikosida

Efek farmakologi pegagan yang berkaitan dengan fungsi kognitif diketahui berasal dari kandungan senyawa triterpenoid, yaitu asiatikosida (Gambar 2).

Gambar 2 Struktur asiatikosida (Jia dan Lu 2008)

Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa ekstraksi pegagan dapat dilakukan dengan metode maserasi (Reniza 2003), sokhlet (Rafamantanana et al. 2009), dan bantuan sonikasi (Know et al. 2011). Ekstraksi pegagan dengan maserasi membutuhkan waktu yang cukup lama. Know et al. (2011) melaporkan bahwa ekstraksi yang efisien dapat dilakukan dengan bantuan sonikasi selama 30 menit. Hasil yang diperoleh tidak menunjukan perbedaan yang signifikan antara maserasi selama 24 jam dengan bantuan sonikasi selama 30 menit. Oleh sebab itu, dalam penelitian ini ekstraksi pegagan dilakukan dengan bantuan sonikasi. Ekstraksi dengan sonikasi lebih cepat dan efisien dibandingkan maserasi. Hal ini disebabkan oleh terjadinya kavitasi akibat adanya gelombang ultrasonik. Kavitasi merupakan proses pembentukan gelembung-gelembung kecil akibat adanya transmisi gelombang ultrasonik untuk membantu difusi pelarut ke dalam dinding sel tanaman (Ashley et al. 2001).

Ekstraksi dalam penelitian ini dilakukan dengan meragamkan parameter pelarut, suhu, dan waktu. Pelarut yang digunakan ialah etanol dan metanol dengan suhu yang digunakan 30 °C, 40 °C dan 50 °C. Waktu sonikasi yang digunakan ialah 15 menit, 30 menit dan 60 menit. Variasi kondisi ekstraksi dilakukan untuk menentukan metode ekstraksi asiatikosida yang optimum dari pegagan. Rendemen hasil ekstraksi asiatikosida pegagan disajikan pada Tabel 3. Syarat mutu herba pegagan memiliki rendemen hasil ekstraksi tidak kurang dari 7.2% (Depkes RI 2008). Berdasarkan hasil ekstraksi diperoleh rendemen dari masing masing kondisi ialah berkisar antara 11%-17%. Persentase rendemen yang dihasilkan lebih tinggi dari syarat mutu herba pegagan. Perhitungan persentase rendemen hasil ekstraksi dipaparkan pada Lampiran 5.

Pemayaran larutan standar asiatikosida dilakukan pada panjang gelombang 200 nm sampai 400 nm (Lampiran 6). Hasil pemayaran larutan standar asiatikosida 100 ppm memiliki nilai absorbansi yang terdeteksi pada kisaran panjang gelombang 201 nm sampai 207 nm. Menurut Rafamantanana et al. (2009) panjang gelombang maksimum asiatikosida terdapat pada 206 nm

Page 22: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

7

sehingga dalam penelitian ini dilakukan pengukuran kadar asiatikosida pada 206 nm.

Tabel 3 Rendemen hasil ekstraksi dengan parameter pelarut, suhu, dan waktu

Kondisi Pelarut Suhu (°C) Waktu

(menit) Rendemen (%)

n=3

Rerata konsentrasi 206 nm (ppm) n=3

1

Etanol

30 15 11.71 125.1163

2 30 16.56 127.7519 3 60 15.15 118.2946 4

40 15 11.72 82.7907

5 30 11.79 91.4729 6 60 16.07 110.0775 7

60 15 11.47 98.9147

8 30 14.36 105.2713 9 60 15.98 116.4341 10

Metanol

30 15 11.57 98.1395

11 30 13.72 92.2481 12 60 14.19 104.186 13

40 15 11.41 124.4961

14 30 13.11 113.0233 15 60 15.15 119.845 16

60 15 11.58 103.876

17 30 12.41 118.2946 18 60 15.12 107.4419

Tabel 3 memperlihatkan bahwa kadar asiatikosida tertinggi terdapat pada

kondisi 1 (pelarut etanol pada 30 °C selama 15 menit), kondisi 2 (pelarut etanol pada 30 °C selama 30 menit, dan kondisi 13 (pelarut metanol pada 40 °C selama 15 menit). Perhitungan kadar asiatikosida terdapat pada Lampiran 7. Optimasi ekstraksi dapat dilihat berdasarkan pertimbangan suhu dan waktu. Kondisi 1 memiliki nilai yang tidak berbeda nyata (Lampiran 8) dibandingkan dengan kondisi 2 dan 13 yang membutuhkan waktu yang lebih lama dan suhu yang lebih tinggi. Pada kondisi 1 hanya diekstraksi selama 15 menit sedangkan kondisi 2 selama 30 menit. Kondisi 13 membutukan suhu yang lebih tinggi dibandingkan kondisi 1. Oleh sebab itu, kondisi 1 dipilih sebagai ekstrak yang paling optimum untuk menghasilkan kadar asiatikosida.

Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom

Ekstrak pegagan selanjutnya difraksionasi dengan kromatografi kolom menggunakan silika gel sebagai fase diam dan eluen kloroform:metanol dengan pola gradien bertahap sebagai fase geraknya. Sampel yang akan difraksionasi dilarutkan dengan pelarut etanol kemudian dielusi dengan kloroform sebanyak 2

Page 23: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

8

kali volume kolom. Hal ini bertujuan memisahkan senyawa-senyawa yang lebih bersifat nonpolar hingga semipolar dari sampel. Kemudian elusi dilanjutkan dengan nisbah kloroform:metanol secara gradien bertahap masing masing sebanyak 1 kali volume kolom.

Fraksi hasil kromatografi kolom dianalisis menggunakan KLT. Menurut Depkes RI (2008), eluen terbaik untuk pemisahan asiatikosida dengan analisis KLT ialah kloroform-metanol-air (13:5:0.8). Profil analisis KLT sebelum penyemprotan dengan pereaksi Liebermann-Buchard (Gambar 3) tidak menunjukan adanya noda asiatikosida yang terdeteksi pada penyinaran 254 nm dan 366 nm. Identifikasi adanya asiatikosida dapat dilakukan dengan uji triterpenoid, yaitu menyemprot KLT dengan pereaksi Liebermann-Buchard .

Gambar 3 Profil analisis KLT sebelum (a) dan setelah (b) penyemprotan dengan

pereaksi Liebermann-Buchard dengan eluen kloroform-metanol-air 13:5:0.8

Hasil yang positif ditunjukkan dengan perubahan warna ungu pada lempeng KLT (Depkes RI 2008). Noda asiatikosida pada standar dan sampel berwarna ungu yang terlihat pada profil KLT setelah dilakukan penyemprotan dengan pereaksi Liebermann-Buchard (Gambar 3). Nilai Rf standar asiatikosida dan sampel masing-masing ialah 0.24 dan 0.21. Perhitungan nilai Rf yang dihasilkan tersaji pada Lampiran 9.

Eluat yang diperoleh dari kromatografi kolom dianalisis menggunakan KLT. Eluat yang memiliki noda yang sama digabung menjadi satu fraksi. Dalam penelitian ini jumlah fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom ialah 14 fraksi. Asiatikosida pada sampel terdapat pada fraksi 11 dan fraksi 12 yang dibuktikan dengan adanya noda warna ungu pada lempeng KLT setelah dilakukan penyemprotan dengan pereaksi Liebermann-Buchard (Gambar 4). Nilai Rf standar asiatikosida yang diperoleh ialah 0.24. Noda warna ungu yang terdapat pada fraksi 11 dan fraksi 12 memilki nilai Rf yang hampir sama dengan standar, yaitu 0.23. Perhitungan nilai Rf dari fraksi hasil kromatografi kolom terdapat pada Lampiran 10. Fraksi 11 dan fraksi 12 diperoleh dari hasil elusi kloroform:metanol nisbah 6:4, 5:5, dan 4:6.

Sebanyak 2 gram sampel yang dielusi ke dalam kolom memberikan persentase rendemen fraksi yang mengandung asiatikosida sebesar 37.77% dengan warna ekstrak yang dihasilkan ialah kuning keemasan. Rendemen yang

a b

Page 24: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

9

dihasilkan relatif tinggi karena fraksi masih mengandung senyawa lain selain asiatikosida. Pada analisis KLT fraksi 11 masih terdapat 3 noda dan fraksi 12 terdapat 5 noda. Hal ini menunjukan bahwa isolasi asiatikosida belum terpisah secara baik. Perhitungan persentase rendemen dari fraksi hasil kromatografi kolom terdapat pada Lampiran 11.

Gambar 4 Profil KLT dari kiri ke kanan fraksi 1 sampai fraksi 14 hasil

kromatografi kolom

Pemurnian Asiatikosida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pemurnian asiatikosida dilakukan dengan menggabungkan fraksi 11 dan 12 kemudian dianalisis dengan KLT preparatif. Analisis KLT preparatif dilakukan menggunakan fase gerak berupa kloroform-metanol-air dengan nisbah 13:5:0.8 dan fase diam berupa gel GF254. Hasil KLT preparatif dapat terlihat pada Gambar 5. Pada lempeng KLT preparatif dilakukan penotolan larutan standar asiatikosida, penotolan sampel sebagai penduga nilai Rf asiatikosida, dan penotolan sampel yang akan dimurnikan. Profil KLT preparatif tersebut menunjukan bahwa nilai Rf yang diperoleh dari standar sebesar 0.37, nilai Rf pada noda 2 sebesar 0.31 sedangkan pada noda 3 sebesar 0.22. Noda 2 dan noda 3 diduga mengandung asiatikosida karena setelah dilakukan penyemprotan dengan pereaksi Liebermann-Buchard terjadi perubahan warna dari tak berwarna menjadi ungu. Noda 2 menunjukan perubahan warna ungu dengan intensitas yang lebih tinggi sedangkan noda 3 menunjukan warna ungu kehitaman.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Page 25: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

10

Gambar 5 Profil isolasi asiatikosida dengan KLTP (1) standar asiatikosida (2)

noda yang memiliki intensitas warna ungu yang tinggi (3) noda yang memiliki warna ungu kehitaman

Sampel yang sejajar dengan noda 2 dan noda 3 dikerok lalu dilarutkan dengan etanol kemudian didekantasi dan disaring sehingga diperoleh fraksi asiatikosida. Noda 2 sebagai fraksi KLTP 1 dan Noda 3 sebagai fraksi KLTP 2. Persentase rendemen yang dihasilkan dari fraksi KLTP 1 ialah 7.37% sedangkan pada fraksi KLTP 2 sebesar 16.43%.

Gambar 6 Profil KLT dari kiri ke kanan (a) Larutan standar asiatikosida (b) fraksi KLTP 1 (c) fraksi KLTP 2

Tabel 4 Nilai Rf fraksi hasil KLTP dengan analisis KLT Fraksi Noda Jarak noda (cm) Jarak eluen (cm) Nilai Rf

Standar 1 1.92 8.00 0.24

Fraksi KLTP 1 1 1.92 8.00 0.24 2 2.56 8.00 0.32

Fraksi KLTP 2 1 1.28 8.00 0.16 2 1.92 8.00 0.24

Profil analisis KLT (Gambar 6) diatas menunjukan bahwa fraksi KLTP 1

dan fraksi KLTP 2 terbukti mengandung asiatikosida. Noda larutan standar asiatikosida sejajar dengan noda yang terdapat pada fraksi KLTP 1 dan fraksi KLTP 2. Noda tersebut menunjukan warna ungu seperti noda standar. Pemisahan asiatikosida masih belum sempurna karena masih terdapat senyawa lain pada sampel. Nilai Rf dari profil KLT tersebut disajikan pada Tabel 4. Analisis lanjutan

1 23

a b c

Page 26: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

11

dengan KLT dilakukan dengan elusi menggunakan kloroform-metanol-air nisbah 13:5:0.8 sebagai fase geraknya dan fase diam berupa gel GF254. Selanjutnya, fraksi tersebut dibandingkan dengan larutan standar asiatikosida.

Kadar dan Kemurnian Asiatikosida dengan HPLC

Kadar dan kemurnian asiatikosida yang diperoleh dapat dilihat dari nisbah kromatogram standar asiatikosida dan sampel yang terdapat pada Gambar 7. Waktu retensi asiatikosida pada larutan standar sebesar 17.040 menit, fraksi 1 sebesar 17.117 menit dan fraksi 2 sebesar 16.906 menit.

Gambar 7 Kromatogram hasil HPLC larutan (a) standar asiatikosida (b) fraksi KLTP 1 dan (c) fraksi KLTP 2

Berdasarkan Tabel 5 diketahui bahwa kadar asiatikosida fraksi KLTP 1 dan fraksi KLTP 2 sebesar 23.14 mg/g fraksi KLT preparatif dan 193.75 mg/g fraksi

a

b

c

Page 27: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

12

KLT preparatif dengan persentase kemurnian sebesar 9.15% dan 45.86%. Pemurnian asiatikosida pada penelitian ini masih belum berhasil karena persentase masih kurang dari 50%. Perhitungan kadar asiatikosida dipaparkan pada Lampiran 12.

Tabel 5 Kadar asiatikosida hasil HPLC

Larutan Waktu Retensi (menit)

Luas Area

Konsentrasi (ppm)

Kadar Fraksi KLT preparatif (mg/g)

Standar 17.040 495741 100 - Fraksi KLTP 1 17.117 91743 18.5 23.14 Fraksi KLTP 2 16.906 767782 155 193.75

Tabel 6 menunjukan bahwa fraksi KLTP 2 memiliki kadar asiatikosida yang

relatif tinggi. Isolasi asiatikosida pada penelitian Reniza (2003) diperoleh kadar sebesar 0.25 mg/g fraksi kolom dari ekstrak metanol:air (4:1). Pengukuran kadar dilakukan dengan KLT-Densitometri. Kim et al. (2009) melaporkan bahwa ekstrak etanol menghasilkan asiatikosida sebesar 5.2 mg/g ekstrak pada suhu 25 °C dengan maserasi selama 24 jam dan 17.7 mg/g ekstrak pada suhu 78 °C dengan maserasi selama 5 jam. Penelitian Know et al. (2011), ekstak etanol dengan sonikasi selama 30 menit diperoleh kadar asiatikosida sebesar 3.14 mg/g ekstrak. Dalam penelitian ini, ekstrak etanol hanya disonikasi selama 15 menit dan diperoleh kadar 12.02 mg/g ekstrak pada fraksi 2. Hasil asiatikosida yang diperoleh dalam penelitian ini memiliki kadar yang lebih tinggi dibandingkan penelitian sebelumnya kecuali pada penelitian Kim et al. (2009) yang memiliki kadar asiatikosida sebesar 17.7 mg/g ekstrak pada ekstrak etanol suhu 78 °C tetapi membutuhkan waktu ekstraksi yang lebih lama. Hal ini membuktikan bahwa metode ekstraksi yang dilakukan dalam penelitian ini lebih optimum sehingga diperoleh kadar asitikosida yang lebih tinggi dibandingkan penelitian sebelumnya.

Tabel 6 Kadar asiatikosida

Larutan kadar

mg/g fraksi KLT preparatif

mg/g fraksi kolom

mg/g ekstrak

mg/g sampel

Fraksi KLTP 1 23.14 1.71 0.64 0.07 Fraksi KLTP 2 193.75 31.81 12.02 1.41

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Ekstraksi asiatikosida yang optimum dari pegagan dilakukan dengan sonikasi menggunakan pelarut etanol pada suhu 30 °C selama 15 menit. Pemisahan asiatikosida yang optimum pada kromatografi kolom ialah saat elusi

Page 28: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

13

dengan kloroform:metanol nisbah 6:4, 5:5, dan 4:6. Kadar asiatikosida yang diperoleh pada fraksi KLTP 1 dan fraksi KLTP 2 sebesar 23.14 mg/g fraksi KLT preparatif dan 193.75 mg/g fraksi KLT preparatif dengan persentase kemurnian sebesar 9.15 % dan 45.86 %. Pemurnian asiatikosida yang diperoleh dalam penelitian ini belum berhasil karena asiatikosida masih bercampur dengan senyawa lain dan persentase kemurnian yang dihasilkan relatif rendah.

Saran

Pemurnian asiatikosida masih diperlukan pemisahan lanjutan dari fraksi KLT preparatif sehingga diperoleh persentase pemurnian yang tinggi dan perlu meragamkan pelarut kloroform-metanol-air sebagai eluen terbaik untuk elusi analisis KLT preparatif sehingga noda asiatikosida dapat terpisah lebih baik.

DAFTAR PUSTAKA

[AOAC] Association of Official Analytical Chemist Edition 2nd. 2007. Official Methods of AOAC International. AOAC 930.15 & 942.15. Arlington: AOAC International.

Ashley K, Andrew RN, Canazona L, Demange M. 2001. Ultrasonic extraction as a sample preparation technique for elemental analysis by atomic spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 16: 1147-1153.

[Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi 1. Jakarta (ID): Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Cetakan Kedua. Padmawita K & Soediro I, penerjemah. Bandung (ID): Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochemical methods.

Houghton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extract. London (GB): Chapman & Hall.

James J, Dubery L. 2011. Identification and quantification of triterpenoid centelloids in Centella asiatica (L.) Urban by densitometric TLC. Journal of Planar Chromatography. 24:82-87.

Jia G, Lu X. 2008. Enrichment and purification of madecassoside and asiaticoside from Centella asiatica extracts with macroporous resins. Journal of Chromatography A. 1193:136-141.

Kim WJ, Kim J, Veriansyah B, Kim JD, Lee YW, Oh SG, Tjandrawinata R. 2009. Extraction of bioactive components from Centella asiatica using subcritical water. Journal of Supercritical Fluid. 48:211-216.

Kristina NN, Kusumah ED, Lailani PK. 2009. Analisis fitokimia dan penampilan polapita protein tanaman pegagan (Centella asiatica) hasil konservasi in vivo. Bul.Littro. 20 (1):11-20.

Know HJ, Jae HP, Gyu TK, and Yong DP. 2011. Determination of madecassoside and asiaticoside content of Centella asiatica leaf and Centella asiatica

Page 29: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

14

containing ointment and dentifrice by HPLC-coupled pulsed amperometric detection. Microchemical Journal. 98:115-120.

Rafamantana MH, Rozet E, Raoelison GE,Cheuk K, Ratsimamanga SU, Hubert Ph, Leclercq JQ. 2009. An improved HPLC-UV method for the simultaneous quantification of triterpenic glycoside and aglycones in leaves of Centella asitica (L) Urb (APIACEAE). Journal of Chromatography B. 877:2396-2402.

Roni MD. 2008. Formulasi Minuman Herbal Instan Antioksidan dari Campuran Teh Hijau (Camellia sinensis), Pegagan (Centella asiatica), dan Daun Jeruk Purut (Citrus hystrix) [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Teknologi Pertanian, IPB.

Reniza AW.2003. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Asiatikosida dari Pegagan (Centella asiatica L. Urban) sebagai Senyawa Antibakteri [skripsi].Bogor (ID): FMIPA IPB.

Widowati L, Pedjiastuti, Indradi, dan Sundari.1992. Beberapa informasi khasiat keamanan dan fitokimia tanaman pegagan (Centella asiatica L.Urban). Warta Tumbuhan Obat Indonesia. 1(2):39-42.

Page 30: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

15

LAMPIRAN

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Pegagan segar

Simplisia

Fraksi ke 2

Fraksi asiatikosida

Fraksi ke 1

Ekstraksi dengan parameter pelarut, suhu, dan waktu

Ekstrak dengan kadar asiatikosida tertinggi difraksionasi dengan kromatografi kolom

Fraksi ke n

Kadar dan pemurnian asiatikosida

Dikeringkan dan dihaluskan

Pengukuran kadar asiatikosida dengan spektrofotometer UV-vis

Fraksionasi dengan KLT dan KLT preparatif

Analisis dengan HPLC

Page 31: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

16

Lampiran 2 Hasil determinasi tanaman pegagan

Page 32: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

17

Lampiran 3 Penentuan kadar air simplisia pegagan

Ulangan Bobot awal (g) Bobot setelah dikeringkan (g) % kadar air

1 2.0010 1.8896 5.57 2 2.0017 1.9080 4.68 3 2.0014 1.9100 4.57

Rerata 4.94

Contoh Perhitungan: Kadar air = bobot awal-bobot kering

bobot awal×100%

= 2.0010 g – 1.8896 g

2.0010 g×100%

= 5.57%

Rerata = kadar air 1 + kadar air 2+ kadar air 3 3

= 5.57+4.68+4.57

3

= 4.94%

Lampiran 4 Penentuan kadar abu simplisia pegagan

Ulangan Bobot awal (g) Bobot abu (g) kadar abu (%)

1 2.0017 0.1857 9.28 2 2.0026 0.1860 9.29 3 2.0030 0.1869 9.33

Rerata 9.30

Contoh Perhitungan: Kadar abu = Bobot abu

Bobot awal×100%

= 0.1857 g

2.0017 g×100% = 9.28%

Rerata = Kadar abu 1 + Kadar abu 2+ Kadar abu 3

3

= 9.28+9.29+9.33

3 = 9.30%

Page 33: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

18

Lampiran 5 Rendemen ekstraksi dengan parameter pelarut, suhu, dan waktu

Pelarut Suhu (°C)

waktu (s) Ulangan Bobot

sampel (g) Bobot ekstrak

(g) Rendemen

(%) Rerata

(%)

Etanol 30

15 1 5.0005 0.5528 11.05

11.71 2 5.0000 0.6102 12.2 3 5.0002 0.5938 11.88

30 1 5.0000 0.8036 16.07

16.56 2 5.0002 0.8467 16.93 3 5.0003 0.8334 16.67

60 1 5.0001 0.7608 15.22

15.15 2 5.0001 0.7801 15.6 3 5.0001 0.7309 14.62

Etanol 40

15 1 5.0001 0.5807 11.61

11.72 2 5.0003 0.5807 11.61 3 5.0004 0.5964 11.93

30 1 5.0003 0.576 11.52

11.79 2 5.0004 0.5855 11.71 3 5.0004 0.6064 12.13

60 1 5.0001 0.8185 16.37

16.07 2 5.0000 0.7858 15.72 3 5.0001 0.8058 16.12

Etanol 50

15 1 5.0002 0.5895 11.79

11.47 2 5.0003 0.577 11.54 3 5.0004 0.5535 11.07

30 1 5.0020 0.746 14.91

14.36 2 5.0001 0.691 13.82 3 5.0000 0.7167 14.33

60 1 5.0004 0.8155 16.31

15.98 2 5.0001 0.7738 15.48 3 5.0002 0.8075 16.15

Metanol 30

15 1 5.0000 0.5863 11.73

11.57 2 5.0005 0.5501 11 3 5.0002 0.5994 11.99

30 1 5.0004 0.7057 14.11

13.72 2 5.0000 0.6614 13.23 3 5.0002 0.6904 13.81

60 1 5.0002 0.7068 14.14

14.19 2 5.0002 0.6885 13.77 3 5.0001 0.7327 14.65

Page 34: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

19

Lanjutan lampiran 5 Rendemen ekstraksi dengan parameter pelarut, suhu, dan waktu

Pelarut Suhu (°C)

waktu (s) Ulangan Bobot

sampel (g) Bobot ekstrak

(g) Rendemen

(%) Rerata

(%)

Metanol 40

15 1 5.0003 0.5808 11.62

11.41 2 5.0001 0.5628 11.26 3 5.0001 0.5681 11.36

30 1 5.0003 0.6702 13.4

13.11 2 5.0003 0.6444 12.89 3 5.0002 0.6524 13.05

60 1 5.0000 0.7423 14.85

15.15 2 5.0000 0.7307 14.61 3 5.0000 0.7997 15.99

Metanol 50

15 1 5.0001 0.5638 11.28

11.58 2 5.0001 0.5787 11.57 3 5.0000 0.5943 11.89

30 1 5.0003 0.6274 12.55

12.41 2 5.0001 0.5931 11.86 3 5.0001 0.6414 12.83

60 1 5.0000 0.7827 15.65

15.12 2 5.0001 0.7463 14.93 3 5.0001 0.7389 14.78

Contoh perhitungan:

Rendemen = Bobot ekstrak

Bobot awal×100%

= 0.5528 g

5.0005 g×100%

= 11.05%

Rerata = Rendemen 1 + Rendemen 2+ Rendemen 3

3

= 11.05 % +12.20 %+11.88 %

3

= 11.71%

Page 35: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

20

Lamp

Lamp

StaKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKoKo

piran 6 Prosam

piran 7 Ka

Larutan

andar ondisi 1 ondisi 2 ondisi 3 ondisi 4 ondisi 5 ondisi 6 ondisi 7 ondisi 8 ondisi 9 ondisi 10 ondisi 11 ondisi 12 ondisi 13 ondisi 14 ondisi 15 ondisi 16 ondisi 17 ondisi 18

ofil spektrumpai 400 nm

adar asiatikoRerata ab

(n=0.60.80.80.70.50.50.70.60.60.70.60.50.60.80.70.70.60.70.6

um larutan sm

osida pada pbsorbansi =3) 645 807 824 763 534 590 710 638 679 751 633 595 672 803 729 773 670 763 693

tandar asiat

pengukuranRerata kon

(ppm) 100.00125.11127.75118.2982.7991.47110.0798.91105.27116.4398.1392.24104.18124.49113.02119.84103.87118.29107.44

tikosida pad

n panjang gensentrasi n=3 000 163 519 946

907 729 775

147 713 341

395 481 860 961 233 450 760 946 419

da pemayara

elombang 2Rerata kons(mg/g ekstra

- 125012781183828 915 1101989 10531164981 922 1041124511301198103911831074

an 200 nm

06 nm sentrasi ak) n=3

0 8 3

1

3 4

1 5 0 8 9 3 4

Page 36: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

21

Contoh perhitungan: Konsentrasi = Rata‐rata absorbansi sampel

Absorbansi standarKonsentrasi standar

= 0.8070

0.6450 ×100 ppm

= 125.1163 ppm = 125.1163 mg/L = 0.125 mg/mL

Kadar asiatikosida dalam mg/g ekstrak:

= F V F B

= . L L

. = 1250 mg/g ekstrak

Lampiran 8 Penentuan uji t

Kondisi Uji t hitung uji t tabel selang kepercayaan 95 % Keterangan

1 dan 2 1.51 4.30 tidak beda nyata 1 dan 13 1.34 4.30 tidak beda nyata 2 dan 13 1.84 4.30 tidak beda nyata

Contoh perhitungan:

t hitung = x1- x2

sd12

n1 + sd22

n2

= 125.1163- 127.7519

0.47362 3 + 2.99032

n3

= 1.51

Uji t

Keterangan H0 : rataan hasil uji tidak beda nyata H1 : rataan hasil uji beda nyata

Hipotesis H0 : µA = µB H1 : µA ≠ µB t tabel (α=0.05) pada selang kepercayaan 95% adalah 4.30.

t hitung < t tabel . Jadi H0 diterima sehingga percobaan yang diperoleh tidak beda nyata pada selang kepercayaan 95%.

Page 37: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

22

Lampiran 9 Nilai Rf dari eluen kloroform-metanol-air 13:5:0.8

Noda Jarak Noda (cm)

Jarak Eluen (cm) Nilai Rf

1 0.10 8.00 0.01 2 0.60 8.00 0.08 3 1.20 8.00 0.15 4 1.70 8.00 0.21 5 3.90 8.00 0.49 6 4.30 8.00 0.54 7 5.10 8.00 0.64 8 5.70 8.00 0.71 9 6.00 8.00 0.75

10 6.50 8.00 0.81 11 6.90 8.00 0.86 12 7.70 8.00 0.96

standar 1.92 8.00 0.24

Contoh perhitungan:

Nilai Rf = Jarak noda (cm)Jarak eluen (cm)

= 0.10 cm

8.00 cm = 0.01

Page 38: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

23

Lampiran 10 Nilai Rf dari fraksi hasil kolom kromatografi

Fraksi noda Nilai Rf Fraksi noda Nilai Rf standar 1 0.24

9

1 0.53

1 1 0.85 2 0.59 2 0.88 3 0.68 3 0.95 4 0.96

2 1 0.89

10

1 0.38 2 0.96 2 0.44

3 1 0.86 3 0.46 2 0.89 4 0.53 3 0.98 5 0.60

4

1 0.66 6 0.71 2 0.75 7 0.96 3 0.86

11 1 0.11

4 0.98 2 0.23

5

1 0.65 3 0.96 2 0.75

12

1 0.11 3 0.81 2 0.23 4 0.85 3 0.46 5 0.94 4 0.53

6 1 0.88 5 0.59 2 0.96

13

1 0.10

7

1 0.68 2 0.20 2 0.80 3 0.44 3 0.86 4 0.96 4 0.89

14

1 0.10

8 1 0.66 2 0.20 2 0.96 3 0.45

4 0.98

Contoh Perhitungan:

Nilai Rf = Jarak noda (cm)Jarak eluen (cm)

= 6.80 cm8.00 cm

= 0.85

Page 39: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

24

Lampiran 11 Persentase rendemen fraksi hasil kromatografi kolom

Fraksi Eluat Bobot awal (g) Bobot ekstrak (g) Rendemen(%)

1 1- 9 2.0036 0.1854 9.25 2 10-14 2.0036 0.0833 4.16 3 15-17 2.0036 0.0332 1.66 4 18-41 2.0036 0.1315 6.56 5 42-51 2.0036 0.0637 3.18 6 52-53 2.0036 0.0057 0.28 7 54-68 2.0036 0.0795 3.97 8 69-72 2.0036 0.0737 3.68 9 73-82 2.0036 0.0669 3.34

10 83-99 2.0036 0.2623 13.09 11 dan 12 100-150 2.0036 0.7567 37.77

13 151-194 2.0036 0.4543 22.67 14 195-231 2.0036 0.0511 2.55

Contoh perhitungan: Rendemen Fraksi 11-12 = Bobot ekstrak

Bobot awal×100%

= 2.0036 g

0.7567 g×100%

= 37.77%

Page 40: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

25

Lampiran 12 Kadar dan persentase kemurnian asiatikosida Larutan Puncak Waktu Retensi Luas Area

Standar

1 1.375 4603 2 1.590 38893 3 1.764 2129 4 2.594 474585 5 3.042 1121 6 3.459 164874 7 3.667 24455 8 5.329 3500 9 14.803 6973

10 17.040 495741

Fraksi KLTP 1

1 1.276 48197 2 1.626 976024 3 2.461 446148 4 2.924 1553 5 3.330 165288 6 3.484 16127 7 3.812 31913 8 4.649 35837 9 5.168 8421

10 17.117 91743

Fraksi KLTP 2

1 1.291 27425 2 1.664 1138667 3 2.340 130815 4 2.474 365259 5 2.950 1457 6 3.346 165109 7 3.494 7621 8 4.090 1741 9 5.191 2927

10 14.395 427213 11 15.651 4629 12 16.906 767782

Bobot awal fraksi KLTP 1 dan fraksi KLTP 2 sebanyak 0.0040 g dalam 5 mL. Penentuan kadar asiatikosida Fraksi KLTP 2 :

= Luas puncak sampelLuas Puncak standar

×[standar]

= 767782495731

×100 ppm

Page 41: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

26

= 155 ppm = 155 mg/L = 0.155 mg/mL

Kadar fraksi KLTP 2 dalam mg/g fraksi KLT preparatif: = Fraksi x Volume

Bobot fraksi KLTP

=0.155 mg

mL x 5 mL

0.0040 g

= 193.75 mg/g fraksi KLT preparatif Kadar fraksi KLTP 2 dalam mg/g fraksi kolom: = mg asiatikosida

g fraksi KLT preparatif x g fraksi KLT preparatif

g fraksi kolom

= 193.75 mg asiatikosida

g fraksi KLT preparatif x 16.42 g fraksi KLT preparatif

100g fraksi kolom

= 31.81 mg/g fraksi kolom Kadar fraksi KLTP 2 dalam mg/g ekstrak:

= mg asiatikosidag fraksi kolom

x g fraksi kolomg ekstrak

= 31.81 mg asiatikosida

g fraksi kolom x 37.77 g fraksi kolom

100 g ekstrak

= 12.02 mg/g fraksi ekstrak Kadar fraksi KLTP 2 dalam mg/g sampel:

= mg asiatikosidag ekstrak

x g ekstrakg sampel

= 12.02 mg asiatikosida

g ekstrak x 11.71 g ekstrak

100 g sampel

= 1.41 mg/g sampel

%Kemurnian fraksi KLTP 2:

= Luas area sampel

Luas area total sampelLuas area standar asiatikosida

Luas area total standar

x Kemurnian standar

= 767782 3040645495731 1216864

x 74.2%

= 0.2525

0.40738 x 74.2% = 45.99%

Page 42: PENGOPTIMUMAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN … · ingat (Widowati 1992). Pegagan mengandung vitamin C sehingga dapat dimanfaatkan sebagai campuran minuman herbal instan yang memiliki aktivitas

27

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pangandaran pada tanggal 22 Mei 1991 dari ayah

Darnudi dan ibu Parti. Penulis adalah anak kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Pangandaran. Selanjutnya, pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai staf Koperasi Mahasiswa (2009-2010), staf Departemen Syiar and Sains SERUM G (2010-2011), bendahara Departemen Pendidikan MIPA Go Field (2010-2011), bendahara Departemen Advokasi dan Kesejahteraan Mahasiswa BEM G IPB (2011-2012). Penulis menjadi asisten praktikum Azas Kimia Analitik pada tahun ajaran 2011/2012, asisten praktikum Kimia Analitik Layanan pada tahun ajaran 2012/2013, asisten praktikum Kimia Bahan Alam tahun ajaran 2013/2014, dan asisten praktikum Kimia TPB pada tahun ajaran 2013/2014. Selain itu, penulis juga aktif sebagai tentor kimia pada Bimbingan Belajar Katalis IPB pada tahun 2010-2013. Bulan Juni hingga Agustus 2012 penulis melakukan Praktik Lapangan di Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia (BPOM RI) Jakarta Pusat dengan judul Penetapan Kadar Sukrosa dalam Madu dengan Menggunakan Metode Luff Schoorl.