pembuatan larutan stok dan media MS

LAPORAN PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN TANAMAN

"PEMBUATAN LARUTAN STOK DAN MEDIA MS

(Murashige & Skoog )"

NOPITA SARI

D1A012072

AGRONOMI H

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS JAMBI

2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kultur jaringan tanaman adalah suatu teknik isolasi bagian-bagian tanaman,

seperti jaringan, organ, ataupun embrio, lalu dikultur pada medium buatan yang steril

sehingga bagian-bagian tanaman tersebut mampu beregenerasi dan berdiferensisi

menjadi tanaman lengkap.

Keberhasilan budidaya jaringan tanaman sangat dipengaruhi oleh media

tanamnya. Selain sebagai tempat tumbuh, media tanam merupakan penyedia unsur hara

dan zat-zat lain yang diperlukan eksplan untuk tumbuh. Seperti halnya dengan tanaman

utuh, jaringan tanaman juga memerlukan unsur hara makro dan unsur hara mikro.

Karena yang ditanam adalah sepotong kecil jaringan atau sekelompok sel, media tanam

haruslah dapat menyediakan bahan-bahan lain yang dapat mendukung pertumbuhan dan

perkembangan jaringan tanaman sehingga tanaman dapat melakukan regenerasi.

Hasil yang lebih baik dapat dijangkau atau diperoleh, bila ke dalam media

tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh.

Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen

yang tidak jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air kelapa, yeast

exstracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang

lebih tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering

digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih merupakan

komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek.

Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan

tingkat keberhasilan perbanyakan tanaman secara invitro, dalam hal ini adalah kultur

jaringan. Berbagai formulasi atau komposisi media tanam telah banyak ditemukan

untuk mmengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan.

Media biakan adalah bahan atau campuran bahan yang dapat digunakan untuk

membiakkan mikroorganisme karena memiliki daya dukung yang tinggi terhadap

pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Dalam media semi sintetik selain bahan hasil

pertanian, digunakan pula zat-zat kimia yang komposisinya diketahui dengan tepat.

Berdasarkan hal tersebut di atas, maka perlu diadakan praktikum mengenai cara

pembuatan media kultur jaringan. Hal ini dimaksudkan agar segala hal yang diketahui

tentang kultur jaringan bukan hanya sekedar mengetahui tentang adanya kultur jaringan,

tetapi dapat membuat bibit tanaman melalui kultur jaringan. Agar semua yang diketahui

tentang kultur jaringan bukan sekedar teori, tetapi dapat diaplikasikan dalam praktikum

untuk dijadikan pengabdian kepada masyarakat.

1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum pembuatan media kultur jaringan ini yaitu untuk

mengetahui sifat dan komposisi pembuatan media, untuk mengetahui teknik aseptic

pembuatan media, untuk mengetahui dan memahami rumus perhitungan larutan stok

dan mengetahui cara pembuatan larutan stok dan media tanam dari stok-stok bahan

kimia terutama untuk media MS.

Adapun kegunaannya yaitu sebagai bahan informasi bagi mahasiswa khususnya

mengenai pembuatan media kultur jaringan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Media Tanaman

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.

Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan

diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan

hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.

Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya

maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.

Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media

yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf

(Suryowinoto, 1991).

Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stok.

Larutan stok dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-bahan kimia

khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang karena hal

ini kurang praktis. Larutan stok disimpan di dalam lemari pendingin agar tidak mudah

rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh mikroba penyebab

kontaminasi. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok

yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di lemari es, dan larutan stok yang

terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi (Anonim2, 2012).

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur murni,

tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media tumbuh,

garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam konsentrasi tertentu,

sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar sesuai dengan

ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Yuwono, 2008).

Untuk memenuhi faktor pertumbuhan tanaman, media kultur jaringan yang baik

mengandung (Anonim, 2011) :

1. Hara anorganik

Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa

hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan

normal dalam kultur jaringan, unsur – unsur penting ini harus dimasukkan dalam

media kultur.

2. Hara organik

Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof dan dapat

mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman in vitro dapat

mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin dalam

jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin mesti

ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting, selain itu asam

nikotin, piridoksin dan inositol biasanya ditambahkan. Selain bahan organik tersebut,

bahan kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate,

air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain – lain. Penambahan bahan kompleks

ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian yang cukup,

semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu, mungkin tambahan

suatu vitamin atau asam amino.

3. Sumber karbon

Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka

tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke

dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energi bagi pertumbuhan tanaman dan

juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang

diperlukan untuk tumbuh. Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 – 5% digunakan

sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa

dan laktosa juga digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk

menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman

dalam kultur.

4. Agar

Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan

menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel.Konsentrasi agar

yang digunakan berkisar antara 0.7 – 1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi

sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat

buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih

murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan.

5. pH

Media biasanya diatur pada kisaran 5.6 – 5.8 tapi tanaman yang berbeda

mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih

tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2,

agar tidak dapat memadat.

6. Zat Pengatur Tumbuh

Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur tumbuh.

7. Air

Distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab

menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi,

menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan bahan

organik dan non-organik pada media.

8. Pemilihan Media

Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media MS (Murashige dan

Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi

dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil.

Untuk inisiasi kalus, 2.4-D ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 – 5 mgL-1

.

Untuk multiplikasi tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin,

seperti NAA pada konsentrasi yang rendah.Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi

1 – 2 mgL-1 ditambahkan.

Komponen media kultur yang lengkap adalah sebagai berikut :

1. Air destilasi (aquades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solvent

2. Hara-hara makro dan ikro

3. Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi

4. Vitamin, asam amino dan bahan organic lain

5. Zat pengatur tumbuh

6. Suplemen berupa bahan-bahan alami

7. Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media

2.2 Jenis-jenis Media

Menurut Suryowinoto (1991), adapun jenis-jenis media kultur jaringan adalah

sebagai berikut :

a) Media Knop

Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya

ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam

kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine,

cysteine-HCl dan IAA.

b) Media White

Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga

matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih

tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada

media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal

yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan

Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada

media-media lain yang umum digunakan sekarang.

c) Media Knudson dan media Vacin and Went

Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam

di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N

dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+

disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji

anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.

Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup

tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan

ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang

menurun.

Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor

tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan

ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai

pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang

diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller.

d) Media Murashige & Skoog (media MS)

Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam

anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau.

Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk

NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media

Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi

dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM.

Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur

makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini

sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling

banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan

media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS

tersebut, antara lain media :

1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro

MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM,

sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan

senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk

penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin

& Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.

2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan

1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi

konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.

3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi

NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea

glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan

persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan

yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih

sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang

mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan,

maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983).

Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur

tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya

belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya

menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang

tetap.

e) Media Gamborg B5 (media B5)

Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat

dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5

dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar

untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga

digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4,

media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang

lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan

setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et

al, 1968).

f) Media Schenk & Hildebrant (media SH)

Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman

monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip

dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+,

Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan

jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari

spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14%

kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang

diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas

penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.

g) Media WPM (Woody Plant Medium)

Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media

dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan

khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang

digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak

digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.

h) Media N6

Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄⁺ dan NO₃⁻ yang jauh

perbandinganya. Amonium yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄ hanya sebanyak

363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l.

Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan sterilisasi

untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Untuk media kultur

yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan

autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara

20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media

dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada

tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan

waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37

menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama.

Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan

sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila

tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up).

Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan

menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter

filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan.

Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik.

Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik:

carbenocilin (Anonimous, 2009).

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Pembuatan Media ini dilaksanakan pada hari Jum'at tanggal 7

November 2014 pukul 10.00 WIB dan bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan

Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Jambi.

3.2 Alat dan Bahan

Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas ukur, gelas

piala (ukuran 2 L), timbangan digital, hot plate dan termometernya, stirer, pH meter,

corong, botol kultur, karet dan plastik, dan pipet tetes.

Bahan-bahan yang diperlukan dan digunakan dalam praktikum pembuatan

media yaitu berupa bahan media MS yang isinya berupa :

1. Unsur hara makro :

KNO3 = 712,500 mg/l

NH4NO3 = 618,750 mg/l

CaCl2.2H2O = 165,000 mg/l

MgSO4.7H2O = 138,750 mg/l

KH2PO4 = 63,750 mg/l

2. Unsur hara mikro :

MnSO4.4H2O = 8,363 mg/l

ZnSO4.7H2O = 3,225 mg/l

KI = 0,311 mg/l

Na2MoO4.2 H2O = 0,094 mg/l

CuSO4.5H2O = 0,009 mg/l

3. Besi

FeSO4.7H2O = 10,425 mg/l

Na2-EDTA.2H2O = 13,975 mg/l

4. Vitamin

Mio-inositol = 37,500 mg/l

Thiamin HCl = 0,045 mg/l

Piridoksin HCl = 0,195 mg/l

Glisin = 0,045 mg/l

5. ZPT

Sitokinin = 1 mg/l

Auksin = 1 mg/l

6. Bahan pemadat (agar) = 10,5 g/l

7. Sukrosa = 45 g/l

8. KOH atau NaOH = 1 M

9. HCl = 1 M

3.3 Prosedur Kerja

1. Pembuatan larutan stok

a. Larutan stok A, merupakan larutan unsur hara makro

1. Menimbang pesenyawaan NH4NO3 sebanyak 20,625 gr

2. Memasukan bahan yang telah ditimbang tersebut ke dalam gelas piala bersih yang

telah berisi aquades atau air bebas ion kurang lebih 250 ml. Selanjutnya

melakukan pengadukan hingga larut merata dengan menggunakan hotplate, jika

berhasil larutan berwarna bening

3. Memindahkan larutan tersebut ke dalam botol dan ditutup dengan plastik dan

diikat dengan karet serta diberi label "A". Selanjutnya menyimpan larutan stok ke

dalam ruangan pendingin.

b. Larutan stok B KNO3 (23,750 gr)

c. Larutan stok C merupakan campuran KH2PO4 (8,500 gr), H3BO3 (0,310 gr), Kl (0,042

gr), Na2MoO4 . 2H2O (0,013 gr) dan CoCl2 . 6H2O (0,001 gr)

d. Larutan stok D merupakan CaCl2 . 2H2O (22,000 gr)

e. Larutan stok E merupakan campuran MgSO4 . 7H2O (18,500 gr), MnSO4 . 4H2O (1,115

gr), ZnSO4 . 4H2O (0,430 gr) dan CuSO4 . 5H2O (0,001 gr)

f. Larutan Stok F merupakan campuran Na2EDTA (1,865 gr) dan FeSO4 . 7H2O (1,390 gr)

** Untuk langkah kerja larutan stok B, C, D, E dan F hampir sama dengan larutan stok A

hanya berbeda dijumlah senyawa dan pemberian nama label.

2. Pembuatan Medium Kultur

a. Menimbang sukrosa (gulaku) sebanyak 45 gr dan agar-agar sebanyak 10,5 gr

b. Menyiapkan gelas piala berukuran 2000 ml (2 liter) lalu dimasukkan vitamin (15 ml),

sukrosa (45 gr) dan agar-agar (10,5 gr) serta larutan A (30 ml), larutan B (30 ml),

larutan C (7,5 ml), larutan D (7,5 ml), larutan E (7,5ml) dan Larutan F (7,5 ml)

c. Menambahkan aquades ke dalam gelas piala hingga mencapai volume 1500 ml

(dilebihkan sedikit untuk mengantisipasi larutan yang menguap)

d. Menghomogenkan larutan hingga merata dengan menggunakan Hot Plate dan

Magnetik stirrer dan ditunggu hingga mendidih kemudian diukur pH nya. pH larutan

diukur menggunakan pH meter elektrik hingga mencapai pH yang dibutuhkan yaitu

5,7 – 5,8. Jika terlalu asam tambahkan NaOH atau KOH 1 M, dan jika terlalu basa

tambahkan HCl 1 M.

e. Medium yang telah mendidih tersebut dituangkan ke dalam botol-botol kultur.

f. Botol kultur ditutup menggunakan plastik dan karet yang telah disterilkan dan

disimpan di ruang kultur.

Sterilisasi Media

a. Botol kultur yang sudah berisi medium dimasukkan ke dalam autoclave dengan tekanan

15 - 17,5 psi pada suhu 120 oC selama 20 menit, sampai tiga kali.

b. Botol diangkat dan disimpan dalam ruang inkubasi sampai siap digunakan.

c. Medium siap digunakan.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Praktikum

a. Pembuatan Larutan Stok

Komposisi Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) pada pH 5,6 - 5,8

Stok Senyawa per liter stok Pemakaian

Stok per liter medium

A NH4NO3 20,625 gr 30,0 ml 618,750 mg

B KNO3 23,750 gr 30,0 ml 712,500 mg

C KH2PO4 8,500 gr 7,5 ml 63,750 mg

H3BO3 0,310 gr 2,325 mg

Kl 0,042 gr 0,311 mg

Na2MoO4 . 2H2O 0,013 gr 0,094 mg

CoCl2 . 6H2O 0,001 gr 0,009 mg

D CaCl2 . 2H2O 22,000 gr 7,5 ml 165,000 mg

E MgSO4 . 7H2O 18,500 gr 7,5 ml 138,750 mg

MnSO4 . 4H2O 1,115 gr 8,363 mg

ZnSO4 . 4H2O 0,430 gr 3,225 mg

CuSO4 . 5H2O 0,001 gr 0,009 mg

F Na2EDTA 1,865 gr 7,5 ml 13,975 mg

FeSO4 . 7H2O 1,390 gr 10,425 mg

Myo-inositol 2,500 gr 15,0 ml 37,500 mg

Glisin 0,050 gr 0,750 mg

Niasin 0,013 gr 0,195 mg

Piridoksin-HCl 0,013 gr 0,195 mg

Tiamin-HCl 0,003 gr 0,045 mg

Sukrosa 45,000 mg

Agar - agar 10,500 mg

No. Gambar Keterangan

1.

Proses pembuatan larutan stok

2.

Larutan stok yang telah selesai dan harus

disimpan di tempat yang dingin (kulkas)

b. Pembuatan Media MS

No. Gambar Keterangan

1.

Penimbangan sukrosa (gula) sebanyak 45 gram

2.

Penimbangan agar-agar sebanyak 10,5 gram

3.

Memasukkan agar-agar (10,5 gr), sukrosa (45

gr), vitamin 15 ml, larutan stok A, B, C, D, E

dan F ke dalam gelas piala ukuran 2 liter lalu

ditambahkan aquades hingga mencapai 1500

ml

4.

Media yang telah mendidih (berwarna bening)

dan selanjutnya dipindahkan ke botol-botol

kultur

5.

Media yang telah dipindahkan ke botol-botol

kultur dan ditutup rapat dengan plastik dan

karet lalu disimpan atau disusun di ruang

kultur

4.2 Pembahasan

a. Pembuatan Larutan Stok

Media merupakan suatu bahan yang penting untuk pertumbuhan kultur. Media

untuk pertumbuhan kultur dapat berupa media padat dan media cair. Media padat

biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian diinduksi menjadi tanaman

lengkap, sedangkan media cair biasanya digunakan untuk kultur sel. Komponen yang

penting dalam suatu media adalah senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat

pengatur tumbuh, dan suplemen organik (Yuwono 2008).

Larutan Stok Media merupakan tempat tumbuhnya tanaman. Semua kebutuhan

yang diperlukan oleh tanaman untuk tumbuh dan berkembang harus terkandung dalam

media tersebut. Dalam media kultur jaringan (kuljar) telah tersedia unr makro, unsur

mikro, vitamin, hormon (zat perangsang tumbuh) dan lain-lain. Formula ini memang

memudahkan pekerjaan, tapi untuk suatu penelitian yang memerlukan perubahan

komposisi dalam satu atau beberapa komponen, maka pemisahan komponen-komponen

penyusun media perlu dilakukan. Secara umum kebutuhan nutrisi setiap tanaman sama,

tetapi secara khusus kebutuhanya berbeda. Kesamaanya adalah tanaman memerlukan

hara makro dan mikro, vitamin-vitamin, karbohidrat, asam amino dan N-organik, ZPT,

zat pemadat dan kadang ada penambahan seperti air kelapa, ekstrak ragi, jus tomat,

ekstak kentang, bufer organik maupun arang aktif. Kebutuhan tiap tanaman berbeda

pada hal komposisi dan jumlah yang diperlukan.

Pada praktikum kali ini yaitu pembuatan larutan stok. Diawali dengan

penimbangan media komponen penyusun larutan stok dengan menggunakan timbangan

analitik. Setelah dilakukan penimbangan sesuai dengan kebutuhan yaitu berdasarkan

kepekatan atau konsentrasi yang dinginkan, maka dilakukan proses pelarutan dengan

menggunakan aquades murni yang tidak mengandung ion. Untuk larutan stok yang

terdiri lebih dari satu persenyawaan maka proses pelarutan dilakukan pada tempat yang

berbeda hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya reaksi kimia antara masing-msing

persenyawaan misalnya reaksi penggaraman yang dapat meyebabkan degradasi atau

penurunan dari larutan stok itu sendiri.

Larutan stok A mengandung NH4NO3 sebanyak 1.650,000 mg. Untuk membuat

larutan stok A kita memerlukan 82,500 gr. Tetapi dalam praktikum ini hanya membuat

larutan stok A hanya 250 ml dengan kepekatan 50 saja, maka kami hanya memerlukan

NH4NO3 sebanyak 20,625 g (82,500 gr : 4). Pembuatan larutan stok A, yaitu dengan

menimbang NH4NO3 sebanyak 20,625 g, kemudian memasukkannya ke dalam gelas

kimia dan menambahkan akuades sekitar 250 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan

magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut

sempurna, larutan persenyawaan tersebut dituangkan pada botol yang telah disiapkan

dan ditutup rapat kemudian diberi lebel A. Larutan harus terlarut sempurna agar pada

waktu diletakkan dilemari es tidak terjadi endapan. Biasanya larutan yang sudah

mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok

umumnya terjadi bila kepekatan dapat dihindari dengan membuat larutan yang tidak

terlalu pekat atau tidak menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu

larutan stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi

simpan juga diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu

tinggi atau cahaya.

Pembuatan larutan stok B, yaitu dengan menimbang KNO3 sebanyak 23,750 g,

kemudian memasukkannya ke dalam gelas kimia dan menambahkan akuades sekitar

250 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya

menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan

tersebut dituangkan pada botol dan diberi lebel B.

Pembuatan larutan stok C, yaitu masing-masing media dimasukkan ke dalam

gelas kimia secara terpisah dan menambahkan akuades masing-masing 30 ml, kemudian

sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate.

Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut digabung pada

labu ukur secara berurut yaitu KH2PO4, H3BO3, KI, Na2MoO4.2H2O, dan CoCl2.6H2O,

supaya tidak terjadi penggumpalan atau pengendapan, dan ditepatkan volumenya

dengan menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah

ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan botol ditutup rapat kemudian diberi

lebel C.

Karena kami di dalam praktikum ini membuat larutan stok D hanya 250 ml

dengan kepekatan 50, maka kami hanya memerlukan CaCl2.2H2O sebanyak 22 g,.

Pembuatan larutan stok D, yaitu dengan menimbang CaCl2.2H2O sebanyak 22 g,

kemudian memasukkannya ke dalam botol kultur dan menambahkan akuades sekitar

100 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya

menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan

tersebut dituangkan pada labu ukur dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan

aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok

tersebut dipindahkan ke botol ditutup rapat kemudian diberi lebel D.

Pembuatan larutan stok E, yaitu dengan menimbang MnSO4.7H2O, MgSO4.7

H2O, kemudian memasukkannya ke dalam botol kultur dan menambahkan akuades

sekitar 250 ml. Larutan dimasukkan ke dalam botol yang terpisah, kemudian sambil

diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah

larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut digabung pada labu ukur

secara berurut yaitu MgSO4 kemudian KH2PO4 supaya tidak terjadi penggumpalan atau

pengendapan, dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan aquades sampai batas

250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan ke

botol ditutup rapat kemudian diberi lebel E.

Larutan stok F mengandung FeSO4.7H2O dan Na2.EDTA sebanyak 1,865 g dan

1,390 g. Pembuatan larutan stok F, yaitu dengan menimbang FeSO4.7H2O dan Na2.EDTA

masing-masing sebanyak 1,865 g dan 1,390 g, kemudian memasukkannya ke dalam

gelas piala secara terpisah dan menambahkan akuades masing-masing sekitar 100 ml,

kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan

hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut

digabung pada labu ukur secara berurut yaitu FeSO4.7H2O kemudian Na2.EDTA supaya

tidak terjadi penggumpalan atau pengendapan, dan ditepatkan volumenya dengan

menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka

larutan stok tersebut dipindahkan botol ditutup rapat kemudian diberi lebel F.

Setelah selesai membuat larutan stok, larutan stok yang telah jadi disimpan

pada lemari pendingin secara berurutan (A-F). gelas Erlenmeyer tersebut (tempat

larutan stok) sebelumnya telah dibaluti dengan aluminium foil yang telah disterilkan.

Untuk penggunaannya dalam pembuatan media yaitu dengan cara mengencerkan

larutan stok yang telah dipipet sesuai dengan kebutuhan dengan menggunakan aquades.

Dengan adanya larutan stok dapat memberi keuntungan antara lain yaitu menghemat

waktu pekerjaan, menimbang bahan media setiap kali ingin membuat media, mengatasi

kesulitan menimbang dalam konsentrasi kecil dan mengurangi kerusakan bahan kimia

akibat terlalu sering dibuka dan ditutup. Larutan stok dalam bentuk cair disimpan di

dalam lemari es. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan

stok yang terlalu pekat akan mengalami penendapan di dalam lemari es. Jika terjadi

pengendapan, maka sebelum larutan stok digunakan terlebih dahulu harus dipanaskan.

Pembuatan media dikelompokan berdasarkan jenis bahan kimia yang

digunakan, sehingga jika bahan kimia tersebut dicampur tidak terjadi interaksi yang

menghasilkan senyawa baru. Biasanya pengelompokan dilakukan berdasarkan stok hara

makro, stok hara mikro, vitamin dan stok hormone, terutama jika larutan stok tidak

disimpan terlalu lama.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan

persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang

mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah

Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur

C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. “Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak

penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh

pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan

grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang

tetap (Dalton et al, 1983)“.

b. Pembuatan Media MS

Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan media yang digunakan

hampir pada semua macam tanaman terutama herbaceous. Media ini memiliki

konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi, terutama kebutuhan garam anorganik

yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau dan senyawa N

dalam bentuk NO3- dan NH4

+.

Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) dalam Gunawan (1988), sel-sel tanaman

membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–5,8. Pengaturan pH, biasa

dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL

pada waktu semua komponen sudah dicampurkan. Pada praktikum yang telah di

laksanakan dilakukan penambahan NaoH untuk mencapai pH netral.

Agar dapat mencukupi kebutuhan karbon, maka sukrosa harus ditambahkan

ke dalam media. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena

mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya. Sumber karbon ini menyediakan

energy bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk

memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh.

Bahan pemadat media yang digunakan adalah agar-agar. Agar-agar adalah

campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur,

diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na

(Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992).

Smith (1992) menyatakan pemilihan media kultur jaringan merupakan kunci

sukses dalam kultur jaringan. Hal ini menyebabkan banyak diadakan penelitian untuk

memodifikasi media-media yang memberikan respon berbeda terhadap berbagai macam

tanaman. Sumber karbon merupakan salah satu faktor yang sangat penting untuk

menentukan keberhasilan kultur jaringan selain kombinasi zat tumbuh (ZPT). Sumber

karbon berfungsi sebagai sumber energi yang dibutuhkan oleh sel untuk dapat

melakukan pertumbuhan (Kimball, 1994). Glukosa dan fruktosa sebagai hasil hidrolisis

sukrosa dapat merangsang pertumbuhan beberapa jaringan. Konsentrasi sukrosa

berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus (Srilestari, 2005).

Pada praktikum yang kami lakukan penambahan NaOH pada larutan sebab pH

larutan berada di bawah kisaran pH yang dianjurkan yaitu sebesar 5,6 karena bahan

pembuat medianya kebanyakan golongan asam. Kemudian dilakukan pengukuran pH

dan ditetapkan sampai 5.8. Pengaturan pH dilkukan untuk menjamin ketersediaan

unsure hara bagi eksplan di dalam botol kultur. Karena pada praktikum ini, media yang

digunakan adalah media padat maka diperlukan bahan pemadat berupa agar. Agar yang

diberikan yaitu sebesar 10,5 gram dimasukkan kedalam larutan penyusun media dan

dipanaskan. Pengukuran pH tidak lagi dilakukan karena apabila larutan media yang

telah ditambahkan agar diukur pH-nya maka akan merusak pH-meter. Konsentrasi agar

yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah eksplan

sehingga pengambilan hara dan zat tumbuh berkurang, sedangkan zat penghambat dari

eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan. Setelah mencapai titik didih yang ditandai

dengan larutan berwarna bening dan terdapat gelembung maka larutan dituangkan ke

dalam botol-botol kultur. Kemudian botol ditutup dengan plastik dan diikat dengan

karet yang sebelumnya telah disterilkan dan dilakukan sterilisasi basah dengan

menggunakan autoclave selam 20 menit pada suhu 1200C dan pada tekanan 15 psi.

Setelah itu botol-botol kultur diletakan di dalam ruang kulur pada rak-rak yang telah

tersedia.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :

Dengan adanya larutan stok dapat memberi keuntungan antara lain yaitu menghemat

waktu pekerjaan, menimbang bahan media setiap kali ingin membuat media,

mengatasi kesulitan menimbang dalam konsentrasi kecil.

Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa dalam proses pembuatan larutan stok

yang terdiri dari stok A-F melalui beberapa tahapan antara lain: penimbangan

persenyawaan, pelarutan senyawa kimia dengan menggunakan aquades, penetapan

volume akhir, pelabelan dan panyimpanan pada lemari es.

Sterilisasi merupakan suatu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau

benda dari semua mikroorganisme. Sterilisasi yang digunakan pada praktikum ini

dengan menggunakan senyawa kimia dan pemanasan uap air bertekanan (Autoklaf)

Media Murashige dan Skoog (MS Medium) adalah media yang khusus dibuat untuk

pertumbuhan kalus dalam kultur jaringan, tetapi bisa diapikasikan ke semua jenis

tanaman walau kurang spesifik.

5.2 Saran

Sebaiknya dalam praktikum pembuatan media menggunakan massa atau

konsentrasi senyawa yang sesuai agar tidak terjadi pengendapan pada botol stok dan

mahasiswa diberi waktu yang cukup untuk lebih mengenal dan memahami media-media

yang digunakan dalam kultur jaringan agar mahasiswa lebih memahaminya.

DAFTAR PUSTAKA

Gunawan, L.W. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan Pusat Antar Universitas

(PAU) Bioteknologi IPB Bogor. 165 hal.

Hendaryono dan Ir Ari Wijayani, 2007. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta

Kimball, J.W. 1994. Biologi. Erlangga. Bogor

Lawalata, Imelda Jeanette.2011. Pemberian Beberapa Kombinasi ZPT Terhadap

Regenerasi Tanaman Gloxinia (Siningia speciosa) dari Eksplan Batang dan

Daun Secara In Vitr. J.Exp. Life Sci. Vol. 1 No. 2, Feb 2011.Ambon

Marlin, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian Universitas

Bengkulu, Bengkulu.

Nugroho, A dan H. Sugianto. 1997. Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan.

Penebar Swadaya, Jakarta.

Sitorus, Ertina Novaria, DKK. 2011. Induksi Kalus Binahong (Basella rubra L.)

Secara In Vitro Pada Media Murashige & Skoog Dengan Konsentrasi

Sukrosa Yang Berbeda. BIOMA, Juni 2011 ISSN: 1410-8801 Vol. 13, No.

1.Semarang

Smith, R.S. 1992. Plant Tissue Culture Techniques and Experiments. Academic Press.

USA.

Srilestari, R. 2005. Induksi Embrio Somatik Kacang tanah Pada Berbagai Macam

Vitamin dan Sukrosa. Ilmu pertanian Vol. 12. No. 1. Hal 43-51.

Yusnita, 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Srcara Efisien. P.T

Agromedia Pustaka, Tangerang.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman : Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya.

Bumi Aksara, Jakarta