Pembentukan Galur Unggul Padi Tahan Penyakit Blas ...

III. PENELITIAN BIOTEKNOLOGI DAN SUMBER DAYA GENETIKA PERTANIAN

84

Pembentukan Galur Unggul Padi Tahan Penyakit Blas (Pyricularia grisea) Berbasis Seleksi Diferensial Standar dan Marka Molekuler untuk

Lokus Gen Pib, Piz, Pita, dan Pik

Sebanyak 100 isolat blas terkoleksi di Bank Gen Mikroba BB Biogen telah diuji patogenesitasnya pada varietas diferensial/monogenic lines, dilanjutkan dengan analisis keragaman genetiknya berdasarkan marka Simple Sequence Repeat (SSR) dan marka Expressed Sequence Tag (ESTs) (Gambar III.45). Sebanyak 50 individu tanaman populasi haploid ganda turunan hasil per-silangan ganda: Parekaligolara/IR54//Bio110/Markuti, diuji respon ketahanan-nya terhadap isolat-isolat blas terkarakterisasi lain selain isolat/ras yang telah digunakan sebagai isolat uji kegiatan tahun sebelumnya.

Analisis keragaman genetik isolat blas dilakukan berdasarkan profil pola pita DNA yang diperoleh dari hasil analisis PCR. Skoring secara biner dilakukan berdasarkan pola pita DNA yang diperoleh tersebut sebagai data genotipe. Analisis keragaman genetik dan analisis asosiasi antara data fenotipe (patotipe) dan data genotipe yang telah diperoleh dilakukan menggunakan program Power Marker 3.25 dan program Tassel 3.1. Informasi patogenesitas ras/isolat terkoleksi disajikan berdasarkan sistem standar diferensial dan keragaman genetik 96 isolat koleksi baru, telah dilakukan menggunakan 16 marka molekuler ESTs, SSR, Mating type dan avr-ACE1.

Evaluasi patogenesitas isolat blas pada koleksi isolat yang telah ada di-lakukan pada isolat yang telah diketahui memiliki kelompok ras yang berbeda, yaitu Ras033, Ras101, Ras123, Ras133, dan Ras173. Kelima ras ini adalah ras yang dominan pada beberapa lokasi endemik penyakit blas di Indonesia. Hal

Gambar III.45. Salah satu keragaan genotipe isolat koleksi baru menggunakan marka ESTs, SSR,

dan avr-ACE1. Keterangan urutan primer : 1–12 = ESTMo1-ESTMo12; 13–22 = SSR blas; 23–24 = Mat 1–2; 25–26 = Guy dan CM28.

LAPORAN TAHUN 2014

85

tersebut menunjukkan bahwa di antara 5 ras uji yang digunakan Ras173 memiliki spektrum serangan paling luas terhadap varietas diferensial yang me-miliki gen ketahanan yang berbeda-beda. Sementara itu Ras033 memiliki spektrum serangan paling sempit, yaitu hanya menyerang gen Piks pada varietas diferensial IRBLks-F5. Keragaan respon patogenesitas kelima ras blas tersebut pada beberapa varietas diferensial monogenic lines ditunjukkan pada Gambar III.46. Gen ketahanan blas bersifat tahan/resistan terhadap Ras173 adalah gen Pish dan Pita2. Namun demikian, perlu diuji kembali ketahanan kedua gen ini di lapang endemis penyakit blas. Data potogenesis yang diper-oleh selanjutnya dianalisis keragamannya sehingga diperoleh dendrogram keragaman seperti pada Gambar III.47. Keragaman respon patogenesis isolat blas pada dendrogram tersebut menunjukkan bahwa pada tingkat kesamaan 89% terdapat 13 kelompok isolat dengan tingkat patogenesitas yang berbeda-beda (Gambar III.48).

Hasil analisis asosiasi menunjukkan bahwa terdapat 8 pasang marka dan alel gen yang terdapat dalam varietas diferensial, monogenic lines yang bersifat signifikan (P val <0,05) terhadap karakter ketahanan. Marka PYR409/410 penanda alel gen Pia yang terdapat pada monogenic lines IRBLa-A dan ber-asosiasi dengan respon peka dari varietas diferensial yang diuji terhadap isolat yang diinokulasikannya. Di samping itu, terdapat indikasi bahwa marka ESTMO4 dan PYR409/410 dapat digunakan sebagai penanda isolat yang bersifat virulen terhadap gen Pia dan Piks. Marka lain yang berasosiasi dengan sifat tahan adalah marka ESTMO5 dan ESTMO8. Marka ESTMO5, penanda dari alel gen Pikm dan Pita berasosiasi dengan respon tahan. Sementara itu marka

Gambar III.46. Keragaan kelima ras uji pada beberapa varietas diferensial.

Ras173 IRBLa

Ras173 IRBL1

Ras133 IRBLa

Ras123 IRBL1

Ras101 IRBLa

Ras033 IRBLks

Ras033 IRBLa


86

ESTMO8, penanda dari alel gen Pita dan Piz yang juga berasosiasi dengan respon tahan.

Di antara tanaman yang tahan ini terdapat 4 tanaman monogenic lines yang memiliki gen Pi tertentu, yaitu IRBLz5-CA (Piz5), IRBL1-CL (Pi1), IRBL5-M (Pi5) dan IRBLkm-Ts (Pikm) dan 1 tanaman tetua dari populasi haploid ganda, yang merupakan tanaman donor sifat ketahanan terhadap penyakit blas, yaitu Bio110 (Pir). Lima galur terpilih sebagai kandidat galur harapan hasil pengujian di lapang (Subang dan Sukabumi) (Gambar III.48) selanjutnya diikutsertakan dalam pengujian UDHP, UDHL dan uji multilokasi. Kelima galur tersebut adalah IPBM2-3-2 (BMIP2), IPBM32-1-2-1-1 (BMIP3), BMIP24-1-4-2 (BMIP29), BMIP40-2-1-1 (BMIP30), dan BMIP40-2-1-2 (BMIP31).

Analisis Integrasi Genom Tungro dalam Genom Padi sebagai Penanda Sifat Ketahanan Padi terhadap Tungro

Hasil pengujian terhadap beberapa galur yang diuji ketahannya terhadap tungro menunjukkan terdapat tiga galur yang sifat ketahanan yang stabil ter-

Gambar III.47. Keragaan pengujian patogenisitas beberapa isolat terkoleksi. A = isolat 165, B =

isolat 171, dan C = isolat 130.

Monogenic lines Indonesian differentian varieties

IRBLta IRBLks-F5 IRBLS-M IRBLkm-Ts IRBL1-FS LTH

IRBLks-F5 IRBLa-A Cisadane Cisanggarung Kencana Bali

IRBLta-ct2 IRBLi-F5 LTH Krueng Aceh Cisanggarung

A

B

C

LAPORAN TAHUN 2014

87

hadap semua strain tungro yang menginfeksi, yaitu Bio5-AC-Blas/BLB, Bio62-AC-Blas/BLB-03, dan Bio111-BC-Pir7. Tingkat ketahanan ketiga galur tersebut setara dengan Utri Merah dan Utri Rajapan sebagai kontrol tahan. Hasil peneliti-an sebelumnya menyatakan bahwa Bio5-AC-Blas/BLB, dan Bio111-BC-Pir7 telah dilepas sebagai varietas tahan terhadap BLB dan blas dengan nama Inpari HDB dan Inpari Blas.

Deteksi sekuen RTBV yang terintegrasi dalam genom padi dilakukan pada sejumlah galur dan varietas lokal yang ada dikoleksi padi bank gen BB Biogen. Hasil deteksi menunjukkan bahwa probe RTBV dapat mendeteksi lebih dari 15 copy fragmen RTBV dalam genom padi lokal. Fragmen berukuran sangat variatif, mulai dari di bawah 0,6 kb hingga lebih 10 kb. Hasil yang sama juga diperoleh untuk deteksi fragmen RTBV pada varietas-varietas yang berbeda tingkat ketahanannya. Profil galur Bio5 (Inpari HDB), Bio111 (Inpari Blas), dan Utri Merah tidak berbeda dengan varietas lainnya yang rentan terhadap tungro (Gambar III.49).

Sementara itu hasil deteksi pada padi liar menunjukkan adanya perbedaan sifat ketahanan terhadap tungro. Terdapat beberapa pita DNA spesifik di O. latifolia yang berbeda dibanding dengan O. nivara, O. glumaepatula, dan O. oficinalis (Tabel III.34). Jumlah kopi RTBV dalam genom O. latifolia yang ber-sifat tahan terhadap tungro terlihat lebih banyak dibanding dengan spesies padi

Gambar III.48. Dendrogram keragaman 96 isolat blas berdasarkan respon patogenesitasnya pada

varietas diferensial lokal dan monogenic lines.


88

liar lainnya. Namun demikian, pita DNA yang berukuran sekitar 2 kb dan 0,7 kb tidak berhasil diklon dan sekuensing sehingga belum diketahui gen atau fragmen RTBV apa yang telah terintegrasi dalam genom padi liar (Gambar III.50).

Hasil identifikasi marka gen ketahanan terhadap tungro pada tanaman padi menggunakan pasangan primer SF dan SR mendapatkan pita tunggal yang berukuran 300 bp disajikan pada Gambar III.51. Primer SF dan SR didesain dari sekuen gen ketahanan tungro pada Utri Merah yang mengkodekan eukaryotic translation initiation factor 4 g (eIF4G). Primer tersebut ternyata mampu mengamplifikasi gen eIF4G dari Inpari HDB, Inpari Blas, O. rufipogon, dan Utri Merah, tetapi tidak pada varietas TN1. Dengan demikian, primer ini bisa digunakan sebagai marka untuk mendeteksi gen ketahanan tungro eIF4G.

Gambar III.49. Pengujian blas di Sukabumi. A = keragaan tanaman tahan dan

peka pada kondisi lapang di Sukabumi. B = distribusi respon ketahanan galur haploid ganda dan beberapa tanaman kontrol yang diuji di Sukabumi.

Tabel III.34. Reaksi ketahanan padi liar terhadap tungro strain Bogor.

Spesies padi liar Skor Reaksi

O. nivara 105623 (02) 5,6 S O. australiansis 105273 6,9 S O. latifolia 100165 (53) 1,1 R O. Barthii 104384 7,6 S O. rufipogon Nepal 2,0 R O. rhizomatis 103417 7,6 S O. rufipogon 105349 1,8 R O. latifolia 102164 (54) 1,1 R O. nivara 01 1,8 R O. glumaepatula 101960 K 7,8 S TN1 8,9 S Utri Merah 1,3 R

30

25

20

15

10

5

00-2,99 (T) 3,00-4,99 (MT) 5,00-9,00 (P)

A B

LAPORAN TAHUN 2014

89

Dari hasil sekuensing diperoleh fragmen sekuen DNA sepanjang 315 bp

yang setelah dianalisis BlasN memastikan sekuen tersebut adalah parsial sekuen dari eukaryotic translation initiation factor 4 g (eIF4G). Protein eIF4G memiliki tiga domain utama, yaitu domain middle portion of eIF4G (MIF4G), domain methyl adenine (MA-3) dan domain acidic aromatic (AA) box. Domain

Gambar III.50. Deteksi sekuen RTBV dalam genom aksesi padi lokal Indonesia. A = gel

elektroforesis hasil pemotongan genom aksesi padi lokal dengan enzim restriksi EcoR1, B = hasil deteksi sekuen RTBV dengan Southern blot menggunakan probe RTBV, 1 = Pelita, 2 = Bio62, 3 = Ciherang, 4 = Utri Merah, 5 = Bio123, 6 = Bio111, 7 = Bio5, 8 = Bio129.

Gambar III.51. Hasil elektroforesis produk PCR gen ketahanan tungro yang

diamplifikasi dengan pasangan primer SF dan SR. 1 = Inpari HDB, 2 = Inpari Blas, 3 = Utri Merah, 4 = O. rufipogon, 5 = TN1, 6 = 100 bp DNA Ladder.

500 bp

1 2 3 4 5 6

2,1 kb

23,1 kb 23,1 kb

4,4 kb

2,1 kb

0,6 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 A B


90

MIF4G berfungsi untuk mengikatkan RNA dengan protein eIF4A, sedangkan domain MA-3 akan melekat pada situs pengikatan kedua dari protein eIF4A. Kemudian domain AA berikatan pada mitogen-activated protein kinase-interacting kinases (MNKs) untuk memulai proses fosforilasi dan mengatur aktivitasnya (Gambar III.52).

Tingkat similaritas gen eIF4G pada Inpari HDB, Inpari Blas dan O. rufipogon dengan gen yang sama pada O. sativa dari group Indica dan Japonica hanya 93%. Hasil analisis Clustal W menunjukkan bahwa beberapa sekuen nukleotida dan asam aminonya telah mengalami mutasi jika dibanding dengan varietas TN1 dan O. japonica. Titik mutasi bukan hanya terjadi oleh adanya perubahan nukleotida atau asama amino tetapi juga kehilangan kedua senyawa tersebut. Hal tersebut menunjukkan bahwa produk ekspresi eIF4G yang dikodekan oleh sejumlah gen-gen resesif dimanfaatkan terlebih dahulu oleh virus sebelum digunakan oleh inang untuk proses translasi di dalam selnya sendiri. Oleh karena itu, dengan mutasi yang terjadi pada gen eIF4G menyebabkan virus tidak mampu memanfaatkan protein eIF4G. Hasil ini sama dengan yang terjadi pada O. glaberrima yang tahan terhadap Rice yellow mottle virus (RMYV).

ANALISIS GENOM DAN SIDIK JARI DNA KOMODITAS PERTANIAN STRATEGIS : PADI, KELAPA SAWIT, JARAK PAGAR, KEDELAI, JAGUNG,

CABAI MERAH, KAKAO, PISANG, KENTANG, DAN SAPI

Next Generation Sequencing (NGS) technology is leading to a new molecular breeding revolution that has landmark significance for scientific research and enables to launch multi-level and multi-extent studies in the fields of crop genetics, genomics, and crop breeding. Genomics could be one of the breakthrough to accelerate breeding programs of strategic commodities in Indonesia such as rice, soybean, maize, physic nut, oil palm, cocoa, chili, potato, banana and cattle. In 2014, a genomic research was conducted and consisted of six experimental activities. Here we presented achievements of their respective research activities: (1) Genome-wide association study (GWAS) to develop a SNP markers set and rice lines associated with the yield component and early maturity. Based on GWAS, a number of markers i.e. 12, 4, 9, 5, and 8 SNP markers were significantly associated with flowering and days

Gambar III.52. Peta gen eIF4G berdasarkan sekuen database sekuen Oryza sativa grup Japonica

(No. akasesi BAD30897).

LAPORAN TAHUN 2014

91

to maturity, number of productive tillers per plant, panicle length, number of grains per panicle, and weight of 1.000 grains, respectively. In addition to the profiles of morpho-agronomical characters observed in the greenhouse and field, DNA fingerprinting of 467 and 288 rice accessions was obtained using 1536-SNPs and 384-SNPs. (2) Development of a genetic map of SNP markers and drought tolerant-QTL on rice (Zea mays L.). In this study, a collection of SNP/Indel was arranged in a genomic database (Genome Browser). F3:4 population derived from a cross of CML440 and MR13 for further drought test and genomic DNA were obtained. (3) Development of a genetic map of SNP markers and mapping population resistant to wilt disease caused by Fusarium in banana (Musa sp.). Genome-wide SNPs/Indels were arranged in a Genome Browser. F1 populations from crosses of Fusarium resistant-and susceptible-banana varieties were developed and confirmed their heterozygosity using molecular markers. (4) Development of a genomic map of physic nut and genetic maps of SNP markers of oil palm, cocoa and cattle, and F1 mapping population of cocoa. Genomic variations of physic nut, oil palm, cocoa and cattle were obtained and arranged in Genomic Browsers We acquired packages of SNP markers of oil palm and cocoa which were veried using gel-based method. F1 population from a cross of DR1 X Sca12 was developed and will be continued to get adequate number. (5) Genomic analysis for the improvement of soybean varieties with high productivity. F7 (recombinant inbred line RIL) population from a cross of B3293 X B3462 has been obtained. Data of yield components of 400 soybean accessions observed in the field were collected. A collection of almost 10.000 SNPs based on genome sequences of Indonesian soybean varieties acquired and was arranged in genomic database (IAARDGC) and could be used as SNP chip candidates. (6) Development of genetic maps of SNP markers and mapping populations of chili for antraknose resistance and potato for virus disease resistance. We acquired genomic maps with the genomic variation of chili and potato. F1 populations from crosses of chili varieties resistant and susceptible to anthracnose, and F1 population of potatoe for virus resistance have been obtained. The heterozigocity of the chili and potato populations was confirmed using molecular markers.

Analisis Asosiasi Genom (GWAS) untuk Mendapatkan Set Marka SNP dan Galur Padi Terkait dengan Sifat Komponen Hasil Unggul dan Umur Genjah

Analisis GWAS

Analisis asosiasi genom (GWAS) dilakukan berdasarkan data genotyping dengan marka 1.536 SNP dan sifat komponen hasil dan umur padi. Plot Manhattan dan sebaran marka-marka SNP yang menggambarkan asosiasi antara marka 1.536 SNP dengan karakter umur (berbunga dan panen), tinggi tanaman, dan komponen hasil (jumlah anakan produktif, panjang malai, karakter butir per malai, dan bobot 1.000 butir) tercantum pada Gambar III.53


92

(A, B, C, dan D). Beberapa lokus SNP diketahui berasosiasi nyata dengan sifat komponen hasil dan umur padi dan sebaran Manhattan plot menunjukkan posisi SNP signifikan tersebut di atas diagonal.

Beberapa lokus SNP berasosiasi dengan gen yang mengontrol pem-bungaan dan maturity (heading date) seperti WD domain dan Hd13. Marka SNP yang berasosiasi dengan karakter umur panen dan berbunga padi terletak di kromosom 1 (5 SNP), kromosom 2 (2 SNP), kromosom 3, 4, dan 5 masing-

Gambar III.53. Sebaran Manhattan plot dan sebaran marka-marka SNP pada tiap kromosom

sebagai hasil asosiasi antara 1536 marka SNP dari 467 aksesi plasma nutfah padi. A = karakter umur berbunga dan panen, B = tinggi tanaman dan jumlah anakan produktif, C = panjang malai, dan D = karakter butir per malai (A1 & A2) dan bobot 1.000 butir (B1 & B2).

B

A

C

D

LAPORAN TAHUN 2014

93

masing 1 SNP, dan kromosom 12 (2 SNP). Marka SNP (TBGI068738) memiliki posisi genetik sama dengan WD domain di kromosom 1, pada 41,84–41,88Kb. Pada kromosom 12, SNP signifikan (id2007629 dan id12008894) yang ter-petakan pada kisaran 22,73–24,95 kb sama dengan posisi gen Hd13. Marka SNP tersebut bersifat polimorfis untuk aksesi dengan umur yang berbeda, misalnya antara IR72 (umur bunga 84 hari; umur panen 116 hari) dan Dodokan (umur bunga 64 hari; umur panen 103 hari).

Ada 18 marka SNP (di kromosom 1, 3, 4, 5, 8, 11, dan 12) yang berasosiasi dengan tinggi tanaman, dan 4 marka dengan jumlah anakan produktif. Posisi SNP tersebut terkait dengan posisi genetik QTL qph3-1 (id3017469) yang ber-kontribusi pada karakter tinggi tanaman dan qnt1-1 (id101097) terkait pada karakter jumlah anakan produktif. Sembilan marka SNP yang tersebar di kromosom 1, 5, 6, 10, 11, dan 12 berasosiasi nyata dengan panjang malai dan beberapa SNP tersebut terdapat pada posisi QTL untuk karakter panjang malai (Tabel III.35). Terutama TBGI048522 diidentifikasi berada pada posisi QTLqpl11-1 dan id12003066 pada QTL qpl12-1 yang mengontrol panjang malai padi. Selain itu, lima marka SNP (kromosom 3, 7, 8, an 9) berasosiasi dengan jumlah butir per malai dan 8 SNP (kromosom 1, 3, 6, 9, 10, dan 12) berasosiasi dengan bobot 1.000 butir gabah. Diantara marka-marka SNP signifikan, 3 marka SNP terdeteksi pada posisi QTL yang berkontribusi membentuk karakter jumlah butir per malai, yaitu masing-masing id8003808 terpetakan pada posisi QTL qgn8-1 di kromosom 8; TBGI272511 terpetakan pada posisi QTL qtgw6-1 di kromosom 6 dan id10004689 pada QTL qtgw10-1, di kromosom 10. Beberapa marka SNP signifikan selanjutnya divalidasi dengan teknik SNAPSHOT/ Fragment Analysis SNP untuk mengetahui peran SNP tersebut sebagai marka fungsional dalam menyeleksi keragaan genotipe aksesi plasma nutfah yang memiliki variasi karakter target.

Tabel III.35. Analisis pembandingan posisi genetik marka SNP yang signifikan dengan gen-gen target.

Trait Marker Chrom Map (Kb) MAF P val Gen/QTL

Date to flower (DF) TBGI066976 1 39,91 0,19 0,003 WD dom Date to harvesting (DH) id12007629

id12008894 id3018559

12 22,73–24,95 0,46 0,001 Hd13

Plant height (PH) id3017469 3 36,2 0,21 0,0002 qph3-1 Number productive tiller (NT)

id1010973 1 19,9–24,4 0,47 0,002 qnt1.1

Panicle length (PL) TBGI048522 1 29,9 0,23 0,0009 qp1-1 pl1.1

id12003066 12 7,7 0,14 0,001 qpl12-1 Grain number (GN) id8003808 8 13,99 0,04 0,004 qgn8-1

IPA1 Total grain weight (TGW) TBGI272511 6 3,01 0,36 0,002 qtgw6 id10004689 10 17,35 0,33 0,0001 qtgw10


94

Analisis Sidik Jari DNA

Untuk identifikasi profil genotipe (sidik jari DNA) 288 aksesi plasma nutfah padi sebagai penciri varietas, telah didesain chip yang berisi 384 total marka SNP yang mencakup 12 kromosom padi. Desain 384-SNP untuk chip dilakukan dengan pertimbangan marka SNP menyebar di seluruh 12 kromosom genom padi tanpa ada gen-gen target tertentu. 384-SNP chip ini diharapkan dapat menjadi high throughput tool yang akurat dan diskriminasi tinggi untuk meng-identifikasi profil sidik jari DNA plasma nutfah padi sesuai latar belakang genetik dan subspesiesnya (Gambar III.54).

Total marka telah SNP dievaluasi untuk total aksesi padi berdasarkan major alel, genetic diversity index, PIC dan heterozygocity. Total 69 marka SNP terseleksi dengan major allele frequency (MAF) minimal 0,4, genetic diversity index dari 0,599–0,696, heterozygocity sampai 0,0431 dan PIC dari 0,5005 sampai 0,585. Profil sidik jari DNA dilakukan lintas subspesies sebanyak 60 aksesi dari kelompok Indica–Tropical Japonica, dan beberapa pembanding dari kelompok japonica, penentuan frekuensi alel dengan polimorfisme tinggi dilakukan pada tiap kelompok subspesies. Ada 29 aksesi terpilih yang terdiri dari kelompok indica yang memiliki latar belakang genetik mayoritas indica, dan kelompok Tropical Japonica untuk analisis penentuan set marka SNP spesifik sesuai subspesies. Sebanyak 32 marka SNP yang diketahui mempunyai diferensiasi tinggi untuk profiling sidik jari DNA pada subspesies indica dan 19 marka SNP pada kelompok tropical japonica atau japonica.

Genome-wide genotyping dengan 384-SNP chip yang terseleksi dari total 1536-SNP tersebut pada berbagai kelompok aksesi plasma nutfah padi berhasil membedakan dengan tegas antara varian alel dalam bentuk homozigot dan heterozigot. Genotyping ini juga menggambarkan bahwa teknologi SNP ter-gantung pada pilihan apakah hanya beberapa SNP yang disurvei untuk banyak aksesi plsma nutfah atau banyak SNP dari lokus yang berbeda yang digunakan

Gambar III.54. Sebaran marka-marka SNP yang didesain sebagai 384 SNP chip untuk identifikasi

sidik jari DNA plasma nutfah padi. A = sebaran masing-masing kromosom, B = sebaran lintas subspesies.

Kr-1 Kr-2 Kr-3 Kr-4 Kr-5 Kr-6 Kr-7 Kr-8 Kr-9 Kr-10 Kr-11 Kr-12

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

Kromosom

A

0

10

20

30

40

40

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1 = I/I 2 = I/J 3 = I/TJ 4 = J/TJ 5 = J/J 6 = TJ/TJ 7 = I/I (Cornell) 8 = I/I/I (Cornell)

9 = I/I/J (Cornell) 10 = I/J/I (Cornell) 11 = I/TJ/I (Cornell) 12 = TJ/TJ/I (Cornell) 13 = J/TJ/I (Cornell) 14 = TJ/TJ/J (Cornell) 15 = J/J/J (Cornell) 16 = I/J/J (Cornell)

Lintas subspesies

B

LAPORAN TAHUN 2014

95

untuk observasi hanya beberapa individu/aksesi. Berdasarkan data karakter morfologi dan agronomi di rumah kaca dan data genotipe aksesi-aksesi plasma nutfah terpilih untuk analisis sidik jari DNA yang diperoleh selanjutnya diguna-kan dalam analisis asosiasi (Tabel III.36).

Sampai dengan akhir bulan September 2014, update data masih terus dilakukan seiring dengan koleksi data morfoagronomi maupun ketahanan ter-hadap cekaman biotik ataupun abiotik. Mengingat akses ke server sampai sekarang masih terkendala maka update database variasi genetik yang telah terbentuk sebelumnya belum dapat dilakukan. Oleh karena itu, disusun data-base baru yang berisi variasi genetik plasma nutfah baik padi dan juga patogen. Rencana pengembangan database di atas akan di linked kan dengan database yang tersimpan di server untuk kelengkapan data. Keragaan database tersebut seperti pada Gambar III.55.

Tabel III.36. Hasil analisis asosiasi antara data morfologi-agronomi dengan data genotype meng-gunakan 384-SNP untuk tujuan deteksi sidik jari DNA.

Karakter morfologi Marka Krom Posisi F P Keterangan

Panjang malai id8000575 8 11.337.691 6,2E+15 0,0010 Indica/Japonica Permukaan daun id2001831 2 3.230.773 1,2E+16 0,0011 Indica/Japonica Sudut daun bendera TBGI424381 11 25.558.936 7,6E+15 0,0012

Indica/Japonica Sudut daun bendera TBGI427505 11 22.726.755 1,1E+16 0,0014 Sudut daun bendera TBGI129273 3 3.489.234 1,1E+16 0,0014 Bentuk lidah daun

id2010357 2 25.352.506 9,81228E+15 0,000499 Indica/Indica Diameter ruas batang bawah Poros malai Warna leher daun

Gambar III.55. Database variasi genetik plasma nutfah padi dan patogen (Blas dan HDB), dan

IAARD GC database genom yang memuat data-data genom hasil penelitian di BB Biogen, termasuk data padi, yang saat ini sudah terbentuk (launching bulan Oktober 2014).


96

Pembentukan Peta Genetik Marka SNP dan Pemetaan QTL Toleran Kekeringan Pada Jagung (Zea mays L.)

Beberapa tetua jagung telah berhasil diresekuensing dengan kualitas basa cukup tinggi berdasarkan Q30. Sebaran panjang bacaan (read) hasil se-kuensing genom lima genotipe jagung menunjukkan kemiripan dengan ke-banyakan bacaan yang panjangnya sekitar 95 bp. Analisis variasi dalam genom sedang berlangsung dan penting sebagai data genom untuk Genome Browser jagung. Selain itu, variasi genom seperti SNP, Indel, dan SSR dapat menjadi informasi penting sebagai sumber marka molekuler untuk diaplikasikan dalam evaluasi dan seleksi dalam populasi persilangan jagung yang pada tahun ini merupakan generasi F2:3 (Gambar III.56). Sejumlah perangkat lunak digunakan untuk mendapatkan presisi tinggi variasi dalam genom jagung. Contoh sebaran panjang bacaan hasil sekuensing genom jagung dan kerapatan SNP jagung SP070 dipresentasikan pada Gambar III.57. Sejumlah variasi berdasarkan dam-pak pada gen cukup tinggi, sekitar 0,53% dan sebagian besar mutasi adalah silent (53,3%) dan missense (46%).

Gambar III.56. Keragaan tanaman jagung untuk pembentukan generasi F2:3 populasi MR13 X

CML440 di lapangan.

Gambar III.57. Sebaran panjang bacaan hasil sekuensing genom 5 genotipe jagung (LBP54, LK245,

PSG, SPO70, dan Pulu24) hasil next generation sequencing (NGS) dan contoh kerapatan SNP jagung SP070.

LAPORAN TAHUN 2014

97

Pembentukan Peta Genetik Marka SNP dan Populasi Pemetaan Gen Ketahanan Penyakit Layu Fusarium pada Pisang (Musa sp.)

Dalam usaha mengembangkan populasi pisang yang tahan penyakit layu Fusarium, persilangan dengan menggunakan kedua pasang tetua (Calcuta X Ameh Pasaman dan Calcuta X Microcarpa) telah berhasil mendapatkan buah F1 masing-masing sebanyak satu tandan per pasangan persilangan (Gambar III.58). Satu tandan masing-masing terdiri dari 5 sisir dan setiap sisir mengan-dung 15–17 buah pisang. Setiap buah yang dipanen mengandung 10–15 biji yang mengandung, sehingga diharapkan akan diperoleh setidaknya 750 biji berembrio atau maksimum sekitar 1.235 benih F1 dengan embrio.

Saat ini telah diperoleh masing-masing 500 benih F1 berembrio dari masing-masing persilangan. Benih F1 pisang bersifat rekalsitran sudah dikultur-kan secara in vitro pada media MS. Hasilnya hanya benih putatif F1 populasi Calcuta X Microcarpa yang tumbuh dan berkembang dengan mengalami pembengkakan benih dalam kultur. Benih F1 putatif populasi Calcuta X Ameh Pasaman tidak berkembang di kultur MS atau benih tersebut steril (tanpa embrio). Dari 500 benih yang diperoleh dari populasi Calcuta X Microcarpa, 50 benih sudah dikulturkan pada media MS dan hasil perkembangan dari ke-cambah ini diaklimatisasi di rumah kaca. Populasi yang akan digunakan pada penelitian ini adalah F1 Calcuta X Microcarpa. DNA genomika setiap tanaman F1 putatif diuji heterosigositasnya dengan menggunakan marka kodominan (SSR atau SNAP untuk kedua alel) polimorfik antara kedua tetua persilangan. Tanaman riil F1 harus menunjukkan heterozigot dan digunakan pada penelitian pelabelan gen ketahanan terhadap penyakit layu Fusarium.

Secara keseluruhan berdasarkan hasil penelitian tahun 2013–2014, telah diresekuen 12 genotipe tetua-tetua pemuliaan pisang Balai Penelitin Tanaman Buah Tropika (Balitbu). Saat ini dilaporkan hasil penjajaran data resekuen pisang Kole dengan sekuen genom rujukan pisang. Hasil sementara me-nunjukkan telah diperoleh 1.243.332 variasi SNP. Hasil penjajaran memperoleh satu variasi SNP pada setiap 267 basa genom pisang (Tabel III.37). Sebagian

Gambar III.58. Proses persilangan tanaman tahan dan peka Fusarium. A = Tepung sari (polen) dari

tetua jantan (Microcarpa), B = Bunga betina (sel telur) tetua betina (Calcuta), C = Benih F1 putatif hasil persilangan Calcuta X Microcarpa.

A B C


98

besar variasi yang diperoleh lokasinya pada intergenic region (26,04%), di hulu (upstream) gen (29,23%), di hilir (downstream) gen (28,76%) dan intron (13,18%). Hanya sebagian kecil variasi (1,62%) variasi ada di protein coding region (ekson) (Tabel III.38). Dari 48.382 variasi (SNP dan Indel) yang diperoleh berada di eksón, 56,997% adalah mutasi missense, 1,29% mutasi nonsense, dan 41,72% mutasi silent.

Pembentukan Peta Genom Jarak Pagar Dan Peta Genetik Marka SNP Kelapa Sawit, Kakao, dan Sapi, serta Populasi Pemetaan F1 Kakao

Jarak pagar

Penelitian peta genom jarak pagar saat ini telah menghasilkan genome browser data genom jarak pagar. Penelitian ini bekerjasama dengan Seoul National University (SNU), Korea, untuk menyelesaikan pemetaan genetik

Tabel III.37. Sebaran variasi genetis pada 11 kromosom pisang, kuantitas perubahan dan frekuensi perubahan basa pada genom pisang.

Kromosom Panjang Variasi Rerata variasi

1 27.573.629 103.419 266 2 22.054.697 82.341 267 3 30.470.407 116.677 261 4 30.051.516 118.792 252 5 29.377.369 126.031 233 6 34.899.179 121.449 287 7 28.617.404 105.259 271 8 35.439.739 124.224 285 9 34.148.863 128.172 266 10 33.665.772 123.657 272 11 25.514.024 93.311 273

Total 331.812.599 1.243.332 266

Tabel III.38. Lokasi variasi genom yang diperoleh dari hasil penjajaran data resekuen genom pisang Kole dengan sekuen genom rujukan pisang.

Lokasi variasi genom Jumlah Persentase

DOWNSTREAM 855.128 28,761 EXON 48.382 1,627 INTERGENIC 774.327 26,043 INTRON 391.795 13,177 SPLICE_SITE_ACCEPTOR 182 0,006 SPLICE_SITE_DONOR 244 0,008 SPLICE_SITE_REGION 5.080 0,171 TRANSCRIPT 134 0,005 UPSTREAM 869.078 29,23 UTR_3_PRIME 24.361 0,819 UTR_5_PRIME 4.534 0,152

LAPORAN TAHUN 2014

99

genom jarak pagar. Genom browser ini mengandung banyak tampilan terkait data genom jarak pagar yang dapat diakses oleh publik (Gambar III.59).

Kelapa sawit

Analisis lebih detil penjajaran data resekuen kelapa sawit genotipe Dura Indonesia dengan sekuen genom rujukan kelapa sawit menghasilkan data sebanyak 3,33 juta variasi genom yang terdiri dari 3,03 juta SNP, lebih dari 204 ribu insersi, dan lebih dari 98 ribu delesi yang sebagian besar homozigot (Tabel III.39). Kebanyakan (56%) dari SNP dan Indel yang ditemukan pada penelitian ini berupa missense mutation, diikuti oleh silent mutation (41,51%), dan sebagian kecil merupakan mutasi nonsense, 1,54%. Variasi genom kelapa sawit

Gambar III.59. Genome browser jarak pagar (Jatropha genome browser) dengan alamat web di

http://plantgenomics.snu.ac.kr.

Tabel III.39. Jumlah dari pengaruh variasi genom kelapa sawit berdasarkan tipe dan lokasinya.

Tipe variasi yang diperoleh Jumlah Persentase

CODON_CHANGE_PLUS_CODON_DELETION 140 0,003 CODON_CHANGE_PLUS_CODON_INSERTION 248 0,006 CODON_DELETION 207 0,005 CODON_INSERTION 175 0,004 DOWNSTREAM 551.772 12,340 FRAME_SHIFT 1.531 0,034 INTERGENIC 2.782.751 62,232 INTRAGENIC 4.234 0,095 INTRON 492.316 11,010 NON_SYNONYMOUS_CODING 30.106 0,673 NON_SYNONYMOUS_START 10 0,000 SPLICE_SITE_ACCEPTOR 284 0,006 SPLICE_SITE_DONOR 285 0,006 START_LOST 124 0,003 STOP_GAINED 843 0,019 STOP_LOST 259 0,006 SYNONYMOUS_CODING 22.157 0,496 SYNONYMOUS_STOP 70 0,002 UPSTREAM 584.063 13,062


100

umumnya berada pada intergenik, intragenik, intron, dan pada hulu (upstream) dan hilir (downstream) dari gen. Distribusi lokasi variasi genom berbeda antara satu kromosom dengan kromosom lainnya.

Data SNP dan Indel yang diidentifikasi dari sekuen genom total tiga genotipe kelapa sawit Indonesia telah ditata dan ditampilkan dalam genome browser database (Gambar III.60). Dengan genome browser ini peneliti dapat menampilkan setiap SNP dan Indel serta menggunakan data SNP dan Indel

Gambar III.60. Genome Browser data genom peta genetik SNP dan Indel hasil analisis sekuen

genom total tiga genotipe kelapa sawit Indonesia (Dura, Psifera, dan Oleifera).

Gambar III.61. Contoh pola pita hasil amplifikasi dari primer SNP/Indel yang didesain berdasarkan

variasi genom kelapa sawit yang diverifikasi pada beberapa genotipe pada agarosa 4%. M = 100 bp ladder, 1–24: primer indel hasil desain (1 = OP-EG5 5.1, 2 = OP-EG5 7.1, 3 = OP-EG5 4.1, 4 = OP-EG5 6.1, 5 = OP-EG5 6.2, 6 = OP-EG5 13.1, 7 = OP-EG5 2.2, 8 = OP-EG5 2.1, 9 = OP-EG5 9.2, 10 = OP-EG5 10.1, 11 = OP-EG5 4.2, 12 = OP-EG5 14.1, 13 = OP-EG5 9.1, 14 = OP-EG5 10.2, 15 = OP-EG5 7.2, 16 = OP-EG5 13.2, 17 = OP-EG5 16.2, 18 = OP-EG5 3.2, 19 = OP-EG5 15.2, 20 = OP-EG5 1.1, 21 = OP-EG5 5.2, 22 = OP-EG5 8.1, 23 = OP-EG5 12.1, 24 = OP-EG5 3.1). Tiap primer mengamplifikasi pada 4 genotipe kelapa sawit (Dura, SN3D, PSF, dan 25C802).

LAPORAN TAHUN 2014

101

yang menjadi target penelitiannya. Sampai tahun ini minimal 25 primer Indel/ SNP telah didesain pada daerah koding yang diaplikasikan dengan gel-based method untuk diverikasi pada tetua genotipe yang disikuen (Dura, Pisifera, dan Oleifera). Sebagai langkah awal, berikut contoh amplikon beberapa primer yang telah diverifikasi dan digunakan genotyping pada beberapa genotip kelapa sawit (Gambar III.61).

Kakao

Peta genetik kakao dalam upaya mendukung pemuliaan kakao tahan penyakit Phytophthora dilakukan dengan membentukan populasi hasil per-silangan antara tetua tahan penyakit Phytophthora (Sca12) dan tetua peka (DR1). Persilangan dilakukan di Kebun milik PTPN XII Banyuwangi, Jawa Timur. Untuk memandu dalam proses seleksi molekuler hasil persilangan, di-lakukan pengujian SNP hasil identifikasi genom kakao yang diresekuen dengan genom rujukan. SNP dideteksi dengan metode Tetra Arm PCR menggunakan dua pasang primer (terdiri dari dua inner primer dan dua outer primer) yang didesain sedemikian rupa untuk amplifikasi kedua alel SNP putatif. Aplikasi primer Tetra Arm PCR ini masih memerlukan optimasi lebih lanjut. Selain marka SNP, marka SSR dikonfirmasi pada tetua persilangan (DR1 dan Sca12) maupun generasi F1 (Gambar III.62). Hasil verifikasi primer berbasis genom ter-sebut akan digunakan untuk evaluasi genotipe kakao lainnya.

Dalam pemetaan genetik SNP tetua-tetua pemuliaan kakao diperoleh lebih dari 2,5 juta SNP dan Indel telah diidentifikasi dari data resekuen 5 genotipe

Gambar III.62. Hasil PCR DNA tetua kakao untuk persilangan dan F1 menggunakan primer SSR,

dan beberapa genotipe kakao dengan primer Indel/SSR berbasis genom hasil desain baru. A = konfirmasi marka SSR pada DR1 (A) dan Sca12 (B), B = pola pita marka SSR hasil desain pada tetua dan contoh progeni kakao.

100 bp

1.000 bp

1.000 bp

500 bp

100 bp


102

kakao. Data dari setiap SNP dan Indel yang telah diidentifikasi disajikan dalam bentuk genome browser data genom kakao Indonesia (Gambar III.63).

Sapi

Secara keseluruhan pada tahun 2013 telah diresekuen 8 rumpun sapi lokal Indonesia (sapi Aceh, Pesisir Selatan, Katingan, Ongol Sumba, Bali, Madura, Jawa Brebes, dan sapi PO) setiap rumpun diwakili dua genotipe (satu jantan dan satu betina). Berdasarkan penjajaran data resekuen sapi Aceh dengan sekuen genom rujukan, 20.899.326 variasi genom yang terdiri dari 18.606.950 SNP, 1.192.654 insertion, dan 1.100.722 deletion berhasil diidentifikasi dan di-ketahui satu variasi pada setiap 127 basa genom sapi (Tabel III.40). Sebagian besar variasi terdapat di intergenic region (65,998%), intron (25,675%), dan hanya sebagian kecil variasi (0,514) ada di protein coding region (exon) (Tabel III.41). Selain perubahan kodon asam amino, juga ditemukan kodon insersi, kodón delesi, frame ship, synonymous, nonsynonymous, splice site acceptor dan donor, start codón gain atau lost, stop codón gain atau lost, dsb. (Tabel III.42). Dari 120.234 variasi (SNP dan Indel) yang diperoleh verada di exón, 41,22% adalah mutasi missense, 58,21% mutasi nonsense, dan 0,57% mutasi silent.

Data SNP dan Indel yang diidentifikasi dari sekuen genom total rumpun-rumpun sapi lokal Indonesia telah ditata dan ditampilkan dalam genome browser database (Gambar III.64). Genome browser ini menampilkan setiap SNP dan Indel pada tiap kromosom yang diidentifikasi berdasarkan sekuen genom total rumpun-rumpun sapi lokal Indonesia.


genom total lima genotipe kakao Indonesia.

LAPORAN TAHUN 2014

103

Tabel III.40. Sebaran variasi genetis pada 30 kromosom sapi, kuantitas perubahan dan frekuensi perubahan basa pada genom sapi (termasuk kromosom seks, X dan Y).

Kromosom Panjang Perubahan Rerata perubahan

1 158.337.067 1.269.638 124 2 137.060.424 1.079.640 126 3 121.430.405 926.468 131 4 120.829.699 1.014.489 119 5 121.191.424 900.612 134 6 119.458.736 978.068 122 7 112.638.659 887.714 126 8 113.384.836 886.186 127 9 105.708.250 831.325 127 10 104.305.016 829.921 125 11 107.310.763 787.444 136 12 91.163.125 795.954 114 13 84.240.350 683.392 123 14 84.648.390 666.285 127 15 85.296.676 763.945 111 16 81.724.687 644.525 126 17 75.158.596 618.354 121 18 66.004.023 479.079 137 19 64.057.457 485.024 132 20 72.042.655 619.522 116 21 71.599.096 581.776 123 22 61.435.874 491.340 125 23 52.530.062 438.687 119 24 62.714.930 535.377 117 25 42.904.170 324.419 132 26 51.681.464 430.794 119 27 45.407.902 431.550 105 28 46.312.546 414.596 111 29 51.505.224 452.392 113 MT 15.791 235 67 X 148.823.899 650.535 228

Total 2.660.922.196 20.899.326 127

Tabel III.41. Lokasi variasi genom yang diperoleh dari hasil penjajaran sekuen sapi Aceh dan sekuen genom rujukan sapi.

Type (alphabetical order) Jumlah Persen

DOWNSTREAM 899.092 3,85 EXON 120.234 0,51 INTERGENIC 15.433.712 66 INTRON 6.004.252 25,68 NONE 623 0,003 SPLICE_SITE_ACCEPTOR 684 0,003 SPLICE_SITE_DONOR 642 0,003 UPSTREAM 879.321 3,76 UTR_3_PRIME 41.065 0,18 UTR_5_PRIME 5.636 0,02


104

Tabel III.42. Tipe perubahan variasi genom yang diperoleh dari hasil penjajaran sekuen sapi Aceh dan sekuen genom rujukan sapi.

Type (alphabetical order) Jumlah Persen

CODON_CHANGE 180 0,001 CODON_CHANGE_PLUS_CODON_DELETION 125 0,001 CODON_CHANGE_PLUS_CODON_INSERTION 177 0,001 CODON_DELETION 164 0,001 CODON_INSERTION 110 0,000 DOWNSTREAM 899.092 3,845 EXON 7.692 0,033 FRAME_SHIFT 1.305 0,006 INTERGENIC 15.433.712 65,998 INTRAGENIC 540 0,002 INTRON 6.004.252 25,675 NONE 42 0,000 NON_SYNONYMOUS_CODING 45.477 0,194 NON_SYNONYMOUS_START 5 0,000 SPLICE_SITE_ACCEPTOR 684 0,003 SPLICE_SITE_DONOR 642 0,003 START_GAINED 731 0,003 START_LOST 39 0,000 STOP_GAINED 644 0,003 STOP_LOST 38 0,000 SYNONYMOUS_CODING 64.283 0,275 SYNONYMOUS_STOP 36 0,000 UPSTREAM 879.321 3,760 UTR_3_PRIME 41.065 0,176 UTR_5_PRIME 4.905 0,021


genom total rumpun-rumpun sapi lokal Indonesia.

LAPORAN TAHUN 2014

105

Analisis Genom untuk Perbaikan Varietas Kedelai Produktivitas Tinggi

Pada penelitian ini, data 400 genotipe kedelai yang ditanam di lapang KP Cikemeuh Bogor, Jawa Barat diamati, terutama keragaman karakter kom-ponen hasil, waktu berbunga dan waktu panen. Ringkasan hasil pengamatan karakter-karakter tersebut disajikan pada Tabel III.43.

Berdasarkan hasil penjajaran data resekuen kedelai varietas Indonesia dengan peta genom rujukan kedelai varietas Williams 82, lebih dari 10.000 genome-wide SNP kedelai pada ekson (protein coding region) telah diidentifi-kasi berdasarkan sekuen gen pengode protein (protein coding regions). Seba-nyak lebih dari 9.500 SNP pada gen (gene-based SNP) yang telah diidentifikasi tersebut telah dipetakan pada 20 kromosom kedelai (kromosom 1–20). Sebagai contoh, peta SNP pada kromosom 1–3 kedelai disajikan pada Gambar III.65. Sebagian SNP terpilih digunakan sebagai kandidat SNP chip yang di-harapkan dapat membentuk minimal 3K SNP chip kedelai yang mengandung 3.000 SNP. Data total SNP dengan deskripsi gen di kedelai tersebut juga telah

Tabel III.43. Ringkasan rataan data agronomi 400 genotipe kedelai yang diobservasi di KP Cikemeuh, Bogor, Jabar.

Parameter Nilai minimal Nilai maksimal Rataan+SD Skewness

Umur berbunga (hari) 28 58 44,27+0,08 0,20 Umur masak (hari) 73 101 85,22+0,51 1,28 Tinggi tanaman (cm) 31 128 69,14+2,72 0,29 Jumlah cabang/tanaman 1 8 3,29+0,07 0,35 Jumlah polong/tanaman 15 99 50,16+2,93 0,77 Bobot 100 biji (g) 4 32 8,2+0,1 3,8 Yield/plot (g) 10 390 179,42+15,6 0,09

Gambar III.65. Keragaan peta genetik SNP pada tiga kromosom kedelai (kromosom 1 sampai

dengan kromosom 3). Peta SNP kedelai telah dikonstruksi pada 20 kromosom kedelai, namun hanya 3 kromosom disajikan pada Gambar ini.

59802-55880847bp (471 SNP)

I II III SNP1 SNP2SNP3 SNP4SNP5 SNP6SNP7 SNP8SNP9 SNP10

0.2

SNP11 SNP12SNP13 SNP14SNP15 SNP16SNP17 SNP18SNP19

0.3

SNP20 SNP210.5SNP220.7SNP231.1SNP24 SNP25SNP261.3SNP27 SNP28SNP29 SNP301.4SNP311.5SNP32 SNP33SNP34 SNP351.6SNP36 SNP37SNP38 SNP39SNP40 SNP41

1.7

SNP42 SNP43SNP441.8SNP45 SNP46SNP47 SNP48SNP49 SNP50SNP51

1.9

SNP52 SNP53SNP54 SNP552.0SNP562.1SNP572.5SNP58 SNP59SNP60 SNP61SNP62 SNP63SNP64

2.8

SNP652.9

chr3a

SNP662.9SNP67 SNP68SNP69 SNP703.0SNP71 SNP723.1SNP73 SNP74SNP75 SNP763.2SNP77 SNP78SNP79 SNP80SNP81 SNP82

3.3

SNP83 SNP84SNP853.4SNP86 SNP87SNP88 SNP89SNP90 SNP91SNP92 SNP93SNP94 SNP95SNP96 SNP97SNP98 SNP99

3.5

SNP100 SNP101SNP1023.6SNP1033.7SNP104 SNP1053.8SNP106 SNP107SNP1083.9SNP109 SNP110SNP111 SNP1124.0SNP113 SNP1144.1SNP115 SNP1164.2SNP1174.3SNP118 SNP119SNP120 SNP121SNP122 SNP123SNP124

4.5

SNP125 SNP126SNP127 SNP128SNP129

4.6

SNP1304.7

chr3b

SNP131 SNP132SNP133 SNP134SNP135 SNP136SNP137 SNP138SNP139 SNP140SNP141

4.8

SNP142 SNP143SNP1444.9SNP145 SNP1465.0SNP147 SNP1485.1SNP149 SNP150SNP151 SNP1525.2SNP153 SNP1545.3SNP155 SNP156SNP157 SNP158SNP159 SNP160SNP161

5.5

SNP162 SNP163SNP1645.6SNP1655.7SNP1665.8SNP167 SNP1685.9SNP169 SNP170SNP1716.1SNP1726.5SNP1736.7SNP174 SNP175SNP176 SNP177SNP178 SNP179SNP180

6.8

SNP181 SNP1826.9SNP183 SNP184SNP1857.1SNP1867.2SNP187 SNP188SNP189 SNP1907.5

chr3c

SNP191 SNP192SNP193 SNP194SNP195 SNP196SNP197 SNP198SNP199 SNP200SNP201 SNP202SNP203 SNP204SNP205 SNP206SNP207

7.5

SNP208 SNP209SNP210 SNP211SNP212 SNP213SNP214 SNP215SNP216 SNP217SNP218 SNP219SNP220 SNP221

7.6

SNP222 SNP223SNP224 SNP225SNP226 SNP227SNP228 SNP229SNP230 SNP231SNP232 SNP233SNP234 SNP235SNP236 SNP237SNP238 SNP239SNP240 SNP241SNP242 SNP243SNP244 SNP245

7.8

SNP246 SNP247SNP248 SNP249SNP250 SNP251

8.0


8.1

chr3d

SNP261 SNP2628.1SNP263 SNP2648.2SNP2658.4SNP2668.6SNP2678.7SNP2689.1

SNP269 SNP27010.6

SNP27114.4SNP27216.7SNP27316.9SNP27417.8SNP275 SNP276SNP277 SNP278SNP279 SNP280SNP281 SNP282

19.3

SNP28319.4SNP28419.7SNP285 SNP28620.1SNP287 SNP288SNP28920.2SNP290 SNP291SNP29220.3SNP293 SNP294SNP29520.6SNP29620.7SNP297 SNP29820.9SNP29921.0SNP30021.1

chr3eSNP321 SNP322SNP323 SNP32429.0SNP325 SNP32629.6SNP327 SNP328SNP329 SNP330SNP331 SNP332

29.9

SNP333 SNP33430.7SNP33531.0SNP33631.3SNP33733.2SNP33834.4SNP33934.7SNP34035.1SNP341 SNP34235.4SNP34335.5SNP34435.9SNP345 SNP346SNP34736.0SNP348 SNP349SNP350 SNP351SNP352 SNP353

36.1

SNP354 SNP355SNP356 SNP35736.2SNP35836.4SNP359 SNP360SNP361 SNP36237.0SNP363 SNP364SNP365 SNP366SNP367 SNP368SNP369 SNP370SNP371 SNP372SNP373 SNP374SNP375 SNP376

37.4

SNP37737.6SNP378 SNP37937.7SNP38037.8

chr3f


37.8


37.9

SNP392 SNP39338.0SNP39438.1SNP39538.4SNP39638.6SNP39739.3SNP398 SNP39939.4SNP400 SNP401SNP402 SNP403SNP404 SNP405

39.6

SNP406 SNP407SNP408 SNP40939.7SNP410 SNP411SNP412 SNP41339.9SNP414 SNP415SNP41640.0SNP417 SNP418SNP419 SNP420SNP421 SNP422SNP423 SNP424SNP425 SNP426SNP427 SNP428SNP429 SNP430SNP431 SNP432SNP433 SNP434SNP435 SNP436SNP437

40.1

SNP438 SNP439SNP44040.2

chr3g

SNP441 SNP442SNP443 SNP444SNP445 SNP446SNP447 SNP448SNP449 SNP450SNP451 SNP452

40.2

SNP453 SNP454SNP455 SNP456SNP457 SNP458SNP459 SNP460SNP461 SNP462

40.3


40.4


40.5

SNP475 SNP476SNP477 SNP47840.6SNP479 SNP480SNP481 SNP482SNP483

40.7


40.8


40.9

chr3h

SNP501 SNP502SNP50340.9SNP504 SNP505SNP50641.0SNP50741.3SNP508 SNP509SNP510 SNP511SNP512 SNP513

41.6

SNP514 SNP51542.0SNP51642.2SNP51742.9SNP518 SNP519SNP520 SNP521SNP522 SNP523SNP524 SNP525SNP526 SNP527

43.0

SNP528 SNP52943.3SNP530 SNP531SNP532 SNP533SNP534 SNP535SNP536 SNP537SNP538 SNP539SNP540 SNP541SNP542

43.4


43.5

SNP548 SNP549SNP550 SNP55143.6SNP552 SNP553SNP554 SNP555SNP556 SNP557SNP558

44.8

SNP559 SNP560SNP561 SNP562SNP563 SNP564SNP565

44.9

chr3i

SNP1 SNP2SNP30.2SNP40.3SNP5 SNP6SNP7 SNP80.4SNP9 SNP10SNP11 SNP12SNP13 SNP14SNP15 SNP16

0.6

SNP17 SNP18SNP19 SNP20SNP21 SNP22SNP23 SNP24SNP25 SNP26SNP27 SNP28SNP29

0.7

SNP30 SNP31SNP32 SNP33SNP34 SNP35SNP36 SNP37

0.8

SNP38 SNP390.9SNP401.4SNP41 SNP42SNP432.1SNP44 SNP45SNP46 SNP472.2SNP482.6SNP493.0SNP503.7SNP51 SNP523.9SNP53 SNP544.0SNP55 SNP56SNP57 SNP58SNP59

4.1


4.2

chr2aSNP66 SNP67SNP684.2SNP69 SNP70SNP71 SNP72SNP73 SNP74

4.3


4.4


4.5

SNP90 SNP91SNP92 SNP934.6SNP94 SNP954.7SNP96 SNP97SNP98 SNP99SNP100 SNP101

4.8

SNP102 SNP103SNP104 SNP1054.9SNP106 SNP1075.2SNP1085.3SNP1095.5SNP110 SNP111SNP112 SNP113SNP114 SNP115SNP116 SNP117SNP118 SNP119

5.6

SNP1205.7SNP121 SNP122SNP123 SNP1246.2SNP125 SNP126SNP127 SNP128SNP129 SNP130

6.9

chr2b

SNP131 SNP1326.9SNP1337.0SNP134 SNP135SNP136 SNP137SNP138

7.1

SNP139 SNP140SNP1417.5SNP1429.2SNP143 SNP144SNP145 SNP14610.3SNP147 SNP14810.8SNP14911.0SNP15011.5SNP151 SNP15211.6SNP15311.7SNP154 SNP155SNP15611.8SNP15711.9SNP158 SNP159SNP16012.0SNP16112.1SNP16212.8SNP163 SNP16414.0SNP16514.1SNP166 SNP167SNP168 SNP169SNP170

14.4

SNP171 SNP172SNP17314.5SNP174 SNP17514.6SNP17614.9SNP17715.4SNP17815.7SNP17916.8SNP180 SNP181SNP182 SNP18327.3SNP184 SNP18527.4

chr2cSNP186 SNP18727.4SNP18829.9SNP18930.5SNP19034.3SNP19136.4SNP19240.0SNP193 SNP194SNP195 SNP19641.9SNP197 SNP198SNP199 SNP20042.0SNP20142.4SNP20242.6SNP203 SNP204SNP205 SNP20642.8SNP20743.1SNP20843.7SNP209 SNP210SNP21143.8SNP212 SNP21344.1SNP214 SNP215SNP216 SNP217SNP218 SNP219SNP220

44.8

SNP221 SNP22245.4SNP22345.5SNP224 SNP22545.6SNP226 SNP227SNP228 SNP229SNP230 SNP231SNP232 SNP233SNP234 SNP235SNP236

45.7


45.8

SNP24545.9

chr2dSNP246 SNP247SNP248 SNP249SNP250 SNP251SNP252 SNP253

45.9

SNP254 SNP255SNP256 SNP257SNP258 SNP259SNP260 SNP261SNP262 SNP263

46.0


46.1

SNP273 SNP27446.2SNP275 SNP276SNP27746.9SNP278 SNP27947.1SNP280 SNP281SNP282 SNP28347.3SNP284 SNP285SNP286 SNP287SNP288 SNP289SNP290 SNP291

47.4


47.5

SNP298 SNP29947.6SNP300 SNP301SNP302 SNP303SNP304 SNP305SNP306 SNP307SNP308

47.8

SNP30948.0SNP31048.2

chr25SNP311 S NP312SNP31348.2SNP314 S NP315SNP316 S NP317SNP318 S NP319

48.3

SNP320 S NP321SNP322 S NP323SNP324 S NP325SNP326 S NP327

48.4

SNP32848.6SNP32948.7SNP330 S NP331SNP332 S NP333SNP334 S NP335SNP336 S NP337SNP338 S NP339SNP340 S NP341SNP342

48.8

SNP343 S NP344SNP345 S NP346SNP347 S NP348

48.9

SNP34949.1SNP350 S NP351SNP352 S NP353SNP354 S NP355SNP356

50.2

SNP357 S NP358SNP359 S NP360SNP361 S NP362SNP363 S NP364SNP365 S NP366SNP367 S NP368SNP369 S NP370

50.3

SNP371 S NP372SNP373 S NP374SNP375

50.4

chr2fSNP 376 SNP377SNP 378 SNP379SNP 380 SNP381SNP 382 SNP383SNP 384 SNP385SNP 386 SNP387

50.4

SNP 38850.5SNP 389 SNP390SNP 391 SNP392SNP 393 SNP394SNP 395 SNP396SNP 397 SNP398SNP 399 SNP400SNP 401 SNP402SNP 403 SNP404SNP 405 SNP406SNP 407 SNP408

50.6

SNP 409 SNP410SNP 411 SNP41250.7SNP 413 SNP414SNP 415 SNP416SNP 417 SNP418SNP 419 SNP420SNP 421

51.2

SNP 422 SNP423SNP 424 SNP425SNP 426 SNP427SNP 428 SNP429SNP 430 SNP431SNP 432 SNP433SNP 434

51.3

SNP 435 SNP436SNP 437 SNP438SNP 439 SNP440

51.4

chr2g

SNP441 SNP44251.4SNP443 SNP444SNP445 SNP446SNP447 SNP448SNP449 SNP450SNP451 SNP452

51.5


51.6

chr2h

SNP1 SNP20.1SNP3 SNP4SNP5 SNP6SNP7 SNP8

0.3

SNP90.5SNP10 SNP11SNP120.9SNP13 SNP14SNP15 SNP16SNP17 SNP18SNP19 SNP20SNP21

1.0

SNP221.4SNP23 SNP24SNP251.5SNP26 SNP27SNP28 SNP29SNP30

1.8

SNP31 SNP322.7SNP33 SNP34SNP35 SNP36SNP37 SNP38SNP39 SNP40

2.8

SNP41 SNP42SNP43 SNP443.2SNP453.6SNP463.7SNP47 SNP48SNP49 SNP50SNP51

4.0

SNP526.8SNP537.0SNP547.3SNP558.8SNP5611.5SNP5724.9SNP5825.6SNP59 SNP6029.6

chr1aSNP61 SNP62SNP63 SNP64SNP65 SNP66SNP67 SNP68

29.6

SNP69 SNP70SNP7132.4SNP72 SNP7332.6SNP74 SNP75SNP76 SNP7732.7SNP78 SNP79SNP80 SNP8132.8SNP82 SNP83SNP8434.0SNP85 SNP86SNP87 SNP8835.2SNP8935.6SNP9035.8SNP91 SNP92SNP9335.9SNP94 SNP9536.0SNP96 SNP97SNP98 SNP99SNP100 SNP101

36.1

SNP10236.2SNP103 SNP104SNP105 SNP10636.4SNP107 SNP108SNP109 SNP110SNP111 SNP112SNP113

36.7

SNP114 SNP11536.8SNP116 SNP11737.0SNP11837.2SNP119 SNP12037.3

chr1bSNP12138.3SNP122 SNP123SNP124 SNP125SNP126 SNP127

38.6

SNP128 SNP12938.7SNP130 SNP13140.0SNP132 SNP13341.2SNP134 SNP13541.5SNP13642.0SNP13742.1SNP13843.1SNP139 SNP140SNP14143.6SNP142 SNP14343.7SNP144 SNP145SNP146 SNP147SNP148

43.9

SNP149 SNP150SNP15144.0SNP152 SNP15344.1SNP154 SNP15544.2SNP15644.3SNP157 SNP158SNP159 SNP16044.4SNP161 SNP162SNP163 SNP164SNP165

44.5

SNP16644.8SNP16745.2SNP16846.5SNP169 SNP17046.8SNP17147.0SNP172 SNP173SNP174 SNP175SNP176 SNP177SNP178

47.1

SNP17947.4SNP18047.6

chr1cSNP18147.7SNP18248.1SNP183 SNP18448.2SNP185 SNP186SNP18748.3SNP18848.6SNP18948.7SNP19048.9SNP191 SNP192SNP193 SNP194SNP195 SNP196SNP197 SNP198SNP199 SNP200SNP201 SNP202

49.0


49.1

SNP216 SNP21749.3SNP21849.4SNP219 SNP220SNP221 SNP222SNP223 SNP224SNP225 SNP226SNP227 SNP228SNP229 SNP230SNP231

49.5


49.6

chr1dSNP241 SNP242SNP243 SNP24449.6SNP245 SNP24649.9SNP247 SNP248SNP249 SNP25050.0SNP251 SNP252SNP253 SNP254SNP255 SNP256SNP257 SNP258

50.1

SNP259 SNP260SNP26150.2SNP26250.5SNP263 SNP264SNP265 SNP266SNP267 SNP268SNP269

50.6

SNP270 SNP27150.7SNP272 SNP273SNP274 SNP275SNP276

50.8

SNP27751.7SNP278 SNP279SNP280 SNP28151.8SNP282 SNP283SNP28451.9SNP285 SNP28652.2SNP287 SNP288SNP28953.2SNP290 SNP291SNP29253.3SNP293 SNP294SNP295 SNP296SNP297 SNP298SNP299 SNP300

53.6

chr1e


53.6

SNP314 SNP315SNP316 SNP317SNP318 SNP319SNP320 SNP321SNP322 SNP323SNP324 SNP325SNP326 SNP327SNP328 SNP329

53.7

SNP330 SNP331SNP332 SNP333SNP334 SNP335SNP336

53.8


53.9


54.0


54.1

SNP36054.2

chr1f


54.3


54.4

SNP379 SNP380SNP381 SNP38254.5SNP383 SNP384SNP385 SNP386SNP387 SNP388SNP389 SNP390SNP391 SNP392SNP393 SNP394SNP395 SNP396SNP397

54.6

SNP398 SNP39954.9SNP400 SNP401SNP402 SNP403SNP404 SNP405SNP406 SNP407SNP408

55.3


55.4

chr1g


55.4

SNP426 SNP427SNP428 SNP429SNP430 SNP431SNP432 SNP433SNP434 SNP435SNP436 SNP437SNP438 SNP439

55.5


55.6


55.7


55.8

SNP469 SNP470SNP47155.9

chr1h

234681-51621388bp (458 SNP)

179522-47365695bp (668 SNP)


106

dientry di database genom Balitbangtan, IAARD Genome Center yang di launcing pada Oktober 2014 (iaardgc.or.id-).

Untuk verifikasi SNP/indel hasil analisis bioinformatik, telah dipilih 64 SNP dan 22 Indel secara acak yang berdistribusi merata pada semua kromosom kedelai. Satu pasang primer SNAP telah didesain dari setiap SNP. Primer indel dan SSR juga didesain untuk diverifikasi pada genotipe kedelai yang di-resekuen total genomnya pada kegiatan selanjutnya. Selain IAARDGC, data SNP dan Indel yang diidentifikasi dari sekuen genom total delapan genotipe kedelai Indonesia telah ditata dan ditampilkan dalam bentuk grafis antara muka dalam genome browser database (Gambar III.66). Dengan genome browser ini peneliti dapat menampilkan setiap SNP dan Indel serta menggunakan data SNP dan Indel yang menjadi target penelitiannya.

Pembentukan Peta Genetik Marka SNP Cabai dan Kentang dan Populasi Pemetaan Gen Ketahanan Antraknose pada Cabai dan

Penyakit Virus pada Kentang

Cabai

Dua populasi generasi F1 hasil persilangan tetua-tetua (Tanjung-2 x 0207 dan Kencana x 0207) untuk pemetaan telah diidentifikasi berdasarkan karakter kualitatif (morfologi) dan kuantitatif (agronomi) seperti ditampilkan pada Tabel III.44 dan Tabel III.45. Generasi F1 hasil persilangan Tanjung-2 x 0207 dan Kencana x 0207 memperlihatkan keseragaman karena tetua telah homozigot, dan menunjukkan keberhasilan persilangan (Gambar III.67).

Uji molekuler mendukung karakterisasi fenotipe populasi F1. Berdasarkan karakterisasi dengan 9 marka SSR khusus cabai, ada satu primer (CAK58) yang menunjukkan polimorfisme antara tetua rentan (Tanjung-2) dan tahan (0207). Tanaman F1 juga menunjukkan heterozigot (mengandung pita yang berasal dari kedua tetua).

Berdasarkan hasil aligment sikuen genom beberapa tetua cabai dengan sikuen genom rujukan, telah teridentifikasi jutaan SNP termasuk SNP umum dan SNP spesifik genotipe (Gambar III.68A). Peta genom cabai (circos) ber-


genom total delapan varietas kedelai lokal Indonesia.

LAPORAN TAHUN 2014

107

dasarkan variasi SNP dari 3 genotipe telah diperoleh (Gambar III.68B). Variasi SNP dan motif lain seperti indel dan SSR merupakan sumber marka potensial untuk mengoptimalkan pemanfaatan plasma nutfah cabai.

Kentang

Karakterisasi morfologi dan ketahanan terhadap penyakit virus telah di-lakukan pada tetua persilangan, Granola (tahan penyakit virus) dan Atlantik (peka penyakit virus) untuk mendukung pembentukan populasi pemetaaan. Beberapa genotipe kentang termasuk tetua persilangan dianalisis SSR/STS untuk gen-gen terkait katahanan penyakit virus yang didesain dari database atau berasosiasi dengan penyakit tersebut (Gambar III.69). Untuk proses pemetaan genomik, sebanyak 200 individu populasi F1 telah dipilih secara

Tabel III.44. Hasil identifikasi karakter kualitatif yang mengacu pada protokol PPI pada generasi F1 (Tanjung-2 X 0207).

Karakteristik Tanjung-2 X 0207 Kencana X 0207

Notasi Ekspresi Notasi Ekspresi

Pewarnaan anthocianin pada hipokotil 9 Ada 9 Ada Tipe tumbuh 5 Agak tegak 3 Agak tegak Pemendekan buku 1 Tidak ada 1 Tidak ada Pewarnaan antosianin pada buku 5 Sedang 5 Sedang Warna daun 5 Hijau 5 Hijau Bintil daun 3 Kurang Menonjol 3 Kurang Menonjol Posisi tangkai bunga 7 Tidak tegak 7 Tidak tegak Posisi tangkai karangan bunga 7 Tidak tegak 7 Tidak tegak Jumlah bunga per nodus 1 Satu bunga 1 Satu bunga Warna buah sebelum matang 3 Hijau 3 Hijau Intensitas warna buah sebelum matang 5 Sedang 5 Sedang Posisi buah 7 Menggantung 7 Menggantung Rasio panjang buah/diameter buah 9 Sangat besar 9 Sangat besar Predominat penampang membujur buah 9 Bentuk Tanduk 9 Bentuk Tanduk Bentuk penampang melintang buah 1 Elip * * Kedalam lekukan pada permukaan buah 7 Agak dalam 7 Agak dalam Permukaan buah 2 Agak Mengkerut 2 Agak Mengkerut Warna buah matang 3 Merah * * Intensitas warna buah matang 5 Sedang * * Kemengkilapan permukaan buah 5 Sedang * * Rongga pada tangkai buah 1 Tidak Ada 1 Tidak Ada Bentuk ujung buah 1 Runcing 1 Runcing Kedalaman lokul 3 Dangkal 3 Dangkal Jumlah lokul 2 2 dan 3 * * Ketebalan tangkai buah 5 Sedang 5 Sedang Kelopak buah 2 Menutup 2 Menutup Bentuk pangkal buah 3 Tumpul 3 Tumpul Bentuk tepi kelopak 5 Agak bergerigi 5 Agak bergerigi Kandungan capsaicin pada placenta - - - - Tingkat kepedasan - - - - Ketahanan terhadap virus - - - - Ketahanan terhadap antraknose * * * *

(-) tidak diamati; (*) belum diamati.


108

acak, dan dianalisis menggunakan marka SSR/STS terpilih untuk menentukan heterosigositasnya. Amplikon yang dihasilkan dari SSR/STS pada tanaman F1 menunjukkan pola kedua tetua, Granola dan Atlantik.

Sampai saat ini sejumlah genotipe kentang telah berhasil diresikuen dengan Hiseq2000. Berdasarkan analisis bioinformatika pensejajaran data resekuen tetua-tetua pemuliaan kentang Indonesia dengan data genom rujuk-an kentang, variasi struktural dalam genome berhasil diidentifikasi. Peta hapus-an pada genome 6 genotipe kentang telah diperoleh seperti dapat dilihat pada peta circos sebagai visualisasi variasi hapusan dalam genom kentang (Gambar III.70). Marka yang dikembangkan dari variasi genom tersebut akan bermanfaat dalam pemuliaan kentang.

Tabel III.45. Hasil identifikasi keseragaman karakter kuantitatif generasi F1 (Tanjung-2 x 0207) berdasarkan marka morfologi.

Karakteristik Tanjung-2 X 0207 Kencana X0 207

Kisarantn Kk (%) Kisarantn Kk (%)

Tinggi Tanaman (cm) 88,95–102,28 6,07 124,63–135,81 5,57 Tinggi Batang (cm) 17,15–18,45 3,77 18,83–20,69 5,25 Diameter batang (cm) 1,30–1,48 11,15 1,40–1,54 4,33 Panjang daun (cm) 5,73–6,93 11,13 5,23–5,80 4,83 Lebar daun (cm) 1,40–1,58 14,54 2,58–3,28 12,65 Panjang tangkai daun (cm) 2,85–3,08 30,61 2,10–2,60 13,72 Panjang Mahkota Bunga (cm) 1,10–1,33 15,79 1,17–1,30 13,62 Tinggi Filamen (cm) 0,53–0,57 9,19 0,58–0,70 15,58 Panjang buah (cm) 14,08–16,60 8,06 – – Lebar Buah (cm) 1,65–1,78 7,08 – – Panjang tangkai buah (cm) 2,85–3,08 10,82 – – Bobot buah (g) 10,45–15,95 17,90 – – Tebal daging buah (cm) 0,10–0,20 33,70 – – Lebar Kanopi (cm) – – 95,03–100,98 6,40 Panjang tangkai daun (cm) – –

*) nyata berbeda pada P < 0.05, **) nyata berbeda pada P < 0.01, tn) tidak berbeda nyata.

Gambar III.67. Pengamatan identifikasi morfologi dimulai pada saat buah di cabang pertama mulai

memerah. A = pertanaman F1 hasil persilangan Tanjung-2 x 0207 menunjukkan keseragaman, B = buah hijau F1 (Tanjung-2 x 0207) yang diambil dari 24 plot yang berbeda menunjukkan keseragaman.

A B

LAPORAN TAHUN 2014

109

Gambar III.68. Analisis genom kentang. A = discovery SNP pada cabai berdasarkan analisis

alignment 5 genotipe dengan sekuen genom rujukan dan menunjukkan sejumlah private SNP dan shared-SNp frequency, B = peta genom cabai berdasarkan variasi SNP dari 3 genotipe. Perbedaan SNP digambarkan sebagai kotak-kotak berbeda warna pada lingkaran terdalam. Lingkar oranye dan biru menunjukkan posisi tiap gen dan daerah duplikasi pada genom cabai. Lingkar hijau menunjukkan kerapatan jumlah bacaan hasil sekuensing genom yang terpetakan pada sekuen genom cabai.

Gambar III.69. Pola pita yang dihasilkan dari amplifikasi primer SSR/STS pada beberapa genotipe

kentang. A = Hasil elektroforesis gel agarose 4% dengan menggunakan primer RGH-SSR 21, B = Hasil elektroforesis gel agarose 4% dengan menggunakan primer RGH-SSR 8. M = 100 bp DNA ladder, 1 = Atlantik, 2 = Granola Kembang, 3 = Repita, 4 = Merbabu 17, 5 = Medians, 6 = GM 05, 7 = CIP 397078.7, 8 = Maglia, 9 = CIP 394613.139, 10 = CIP 392781.1, 11 = Margahayu, 12 = Granola, 13 = Amabile, 14 = Tenggo.

M 1 2 3 54 7 6 9 8 10 11 12 1413

PRIMER RGH SSR 21

A

500 bp

100 bp

PRIMER RGH SSR 8

M 1 2 3 13 141211109 876 54B

500 bp

100 bp

A 9000

80007000

600050004000300020001000

01/1/1900 1/2/1900 1/2/1900 1/3/1900 1/4/1900 1/5/1900 1/6/1900

700000

600000

500000

400000

300000

200000

100000

0

Private-SNP Shared-SNP Frequency

B


110

BIOPROSPEKSI SENYAWA BIOAKTIF UNTUK PENGENDALIAN SERANGGA HAMA HELICOVERPA ARMIGERA DAN PATOGEN TANAMAN

Bioprospection of bioactive compounds for controlling insects pest Helicoverpa armigera and plant pathogens in 2014 activity has been done using all compounds that potential to control plant pests-pathogens from available genetic resources. Insects have a chemical communication system during copulation (mating). Chemical compounds used in this communication called as sex pheromone, which was produced and distributed by adult female insects. The sex pheromones that have been identified, were Z-11-16: Ald and Z-9-16: Ald. Two of these components could elicited male insects hormones both in the field and laboratory. Similarly, bioprospetion using potential entomopathogenic fungi and bacterial isolates groups had been done using microbial genetic resources available for biological agents against plant pathogens. The results showed that pheromone glands of all female insect populations contained active components i.e; Z-11 and Z-hexadecenal-9- hexadecenal. The Z-9-hexadecenal showed a relatively high quantity. In contrast with that was reported abroad, the Z-11-hexadecenal component was the dominant component (major components). The results of the field test, showed good attractive ratio between the Z-11-16 Ald. : Z-9-16 Ald to H. armigera were the ratio of 50:50 to 10:90, respectively with the best quantity between 1000-1500 ug/rubber septa. Insect control of fruit caterpillars using pheromon traps can be mounted using 6 traps/ha if population was lower and 9-12 traps/ha if the population of H. armigera was higher. In bioprospection

Gambar III.70. Peta hapusan pada genome enam genotipe kentang. Dari

luar ke dalam: Amudera-CIP392081-Margahayu-Merbabu-PP29-Repita). Tinggi histogram dalam tiap lingkar kromosom menunjukkan kerapatan jumlah hapusan dalam setiap 1 Mb urutan basa DNA.

LAPORAN TAHUN 2014

111

activity of potential microbes, it was indicated that bacterial isolates E.31 showed good inhibition to Rhizoctonia solani fungus, while the lowest inhibition sown by E.95 and E.73 isolates. The largest total phenolic content was indicated by E.73 bacterial isolates, whereas largest peroxidase activity shown by bacterial isolates E.95. Serratia marcescens MK5 isolate capable of producing prodigiosin pigment, but the efficacy against R. solani was still lower. Isolation of soil-rhizosphere microbes from Cianjur was obtained 31 isolates that produce growth hormone (IAA). The highest bacterial isolates producing IAA from Sukabumi showed by cucumber isolates originated from Bojong Gentong with a concentration of 82 833 mg/mL, while bacterial isolates originated from Pacet that produced high concentration of IAA was isolate Taro(1). The characterization results of chitinase isolates originated from of South Kalimantan, Sulawesi and Pacet, also showed bacterial isolates producing the highest chitinolytic activity namely isolates LP2. About 24 bacterial isolates obtained from Cianjur showed a high index value of chitinolytic activity i.e; C3A, C3D, and C5D isolates. The highest chitinase of bacterial isolates from Pacet showed by Mustard(1) isolate. The highest glucanolytic activity was obtained by PP2 isolate, while the highest specific activity was obtained by PR14 isolate. Bacterial isolates corn(1) also showed the highest glucanolytic index. The ITS primers has successfully amplified four entomopathogenic fungus of B. bassiana i.e; STGD 7(14)2, STGD 2(14)1, STGD 0113, and STGD 5(14)2 isolates

Aspek bioprospeksi dalam pengelolaan sumber daya genetik (SDG) belum dilakukan secara maksimal. Bioprospeksi merupakan isu yang relatif baru dan hangat dalam pengelolaan SDG. Bioprospeksi dilakukan melalui rangkaian kegiatan termasuk koleksi, riset dan penggunaan sumber daya genetik secara sistematis untuk mendapatkan komposisi kimia baru, gen, organisme dan produk alamiah. Di bidang pertanian, bioprospeksi dapat digunakan sebagai alternatif strategis pemanfaatan sumber daya tanaman yang mempunyai sifat-sifat unggul, sehingga dapat meningkatkan produksi baik kuantitas maupun kualitasnya. Untuk program pengendalian serangga hama yang bersifat ramah lingkungan, kajian bioprospeksi juga dapat memanfaatkan senyawa bioaktif yang bersifat repelan atau antraktan. Feromon seks adalah salah satu kajian bioprospeksi yang sangat penting dalam pengelolaan serangga hama yang ramah lingkungan. Potensi dan peluang ini harus dikelola dengan baik dan terencana serta terarah untuk menghindari peluang pencurian oleh negara lain, yang selanjutnya dapat menjadi pesaing produk yang sama meskipun sumber plasma nutfahnya dari Indonesia. Oleh karena itu, penelitian bioprospeksi senyawa bioaktif untuk pengendalian serangga hama H. armigera dan patogen tanaman dilakukan dengan memanfaatkan potensi SDG yang sudah tersedia. Teknologi ini sangat mendukung program pembangunan pertanian industrial berkelanjutan yang berbasis sumber daya lokal.


112

Bioprospeksi Senyawa Bioaktif untuk Pengendalian H. armigera

Hasil analisis kimia terhadap ekstrak kelenjar feromon senyawa yang paling banyak dan sering terdeteksi pada kelenjar feromon adalah Z-9-16:Ald dan komponen kedua adalah Z-11-16:Ald, keadaan ini agak berbeda dengan yang telah dilaporkan di luar negeri, di mana komponen utamanya adalah Z-11-16:Ald sedangkan komponen minornya, adalah Z-9-16:Ald; akan tetapi pada beberapa sampel, kadang-kadang terdeteksi Z-11-16:Ald saja atau hanya Z-9-16:Ald.

Pada tanaman cabai, jumlah imago jantan yang paling banyak tertangkap pada perlakuan D (rasio 50 : 50) dengan rerata 122 ekor per perangkap dan total jumlah imago tertangkap mencapai 365 ekor. Jumlah tangkapan yang tinggi juga terjadi pada perlakuan formulasi E dan F dengan rerata tangkapan 93 dan 89 ekor per perangkap secara berurutan dan Jumlah tangkapan pada formulasi E mencapai 279 ekor dan 266 ekor, sedangkan pada perlakuan A, B, C, G, dan H rerata jumlah serangga dewasa H. armigera yang tertangkap rendah. Jumlah serangga H. armigera yang tertangkap secara keseluruhan pada tanaman cabai selama lima kali pengamatan adalah 1189 ekor.

Dari hasil uji yang dilakukan pada tanaman kedelai dan cabai, respon H. armigera terhadap dua komponen aktif memiliki kisaran terbaik antara rasio 50 : 50 sampai 10 : 90 antara Z-11-16:Ald : Z-9-16:Ald. Jumlah tangkapan ter-tinggi di peroleh pada formulasi dengan rasio 10 : 90 untuk senyawa aktif yang sama, oleh karena itu untuk populasi Brebes (Indonesia) rasio terbaik yang di-rekomendasikan adalah 10 : 90.

Uji kuantitas senyawa aktif pada karet septa dilakukan juga di lokasi Desa Wanacala, Kecamatan Songgom, Brebes. Pengujian dilakukan pada rasio yang terbaik hasil pengamatan sebelumnya. Hasil dari jumlah imago H. armigera yang tertangkap selama dari tujuh kali pengamatan, dapat dilihat pada Gambar III.71. Pada tanaman kedelai, rerata tangkapan imago H. armigera tertinggi tercatat pada perlakuan D dengan kuantitas senyawa aktif 1.000 ug/karet septa dengan nilai 76 ekor per perangkap, total imago tertangkap adalah 229 ekor. Sedangkan nilai tertinggi kedua rerata jumlah tangkapan didapatkan pada perlakuan E dengan kuantitas 1.500 ug/karet septa dengan nilai 69 ekor/perang-kap dan total jumlah tangkapan 206 ekor. Jumlah tangkapan lebih rendah di-dapatkan pada perlakuan dengan kuantitas 100–500 µg/karet septa. Jumlah imago H. armigera yang tertangkap pada tanaman kedelai mencapai 694 ekor (Gambar III.72). Pada tanaman cabai, rerata tangkapan imago H. armigera tertinggi pada perlakuan E dengan kuantitas 1.500 µg/karet septa dengan nilai 137 ekor/perangkap, dan jumlah tangkapan mencapai 410 ekor. Rerata tangkapan imago H. armigera tertinggi kedua didapatkan pada perlakuan D dengan kuantitas 1.000 ug/karet septa, yaitu 65 ekor/perangkap, dengan jumlah total tangkapan mencapai 196 ekor. Pada kuantitas bahan aktif yang lebih

LAPORAN TAHUN 2014

113

rendah, rerata jumlah tangkapan juga makin rendah. Secara keseluruhan, jumlah imago H. armigera yang tertangkap pada tanaman cabai tahap uji kuantitas mencapai 776 ekor. Kuantitas feromon sintetik antara 1.000–1.500 µg/ karet septa sangat menarik imago jantan H. armigera (Gambar III.73). Pada perlakuan jumlah perangkap/hektar terlihat pada perlakuan jumlah tangkapan 12/hektar pada pertanaman kedelai dan cabai dapat dilihat dalam Gambar III.74.

Bioprospeksi Senyawa Bioaktif untuk Pengendalian Patogen Tanaman

Hasil uji efektifitas beberapa perlakuan isolat endofit yang dilakukan ter-hadap patogen Rhizoctonia solani, memberikan pengaruh penghambatan yang cukup besar (Tabel III.46). Penghambatan yang paling besar ditunjukkan oleh isolat E.31 dengan persen penghambatan sebesar 57,27%. Hal ini menunjukkan bahwa isolat E.31 cukup efektif untuk digunakan sebagai antagonis atau agen

Gambar III.71. Jumlah imago jantan H. armigera yang tertangkap pada berbagai tingkat rasio Z-11-

16:Ald dengan Z-9-16:Ald pada tanaman cabai.

Gambar III.72. Jumlah imago jantan H. armigera yang tertangkap pada berbagai tingkat kuantitas

komponen aktif (Z-11-16:Ald dengan Z-9-16:Ald) pada tanaman kedelai.

0

50

100

150

200

250

A B C D E F G Kuantitas Feromon

Jum

lah

imag

o te

rtang

kap

(eko

r) Im

0

50

100

150

200

250

300

350

400

A B C D E F G HRatio Feromon

Jum

lah

imag

o te

rtang

kap

(eko

r) Im ...


114

biokontrol tunggal. Beberapa isolat yang lain dapat memberikan persen peng-hambatan yang cukup signifikan meskipun tidak mencapai 50% dalam meng-hambat infeksi cendawan, sehingga perlu dilakukan pengendalian secara gabungan menggunakan beberapa agen antagonis. Kandungan fenol total dari sampel yang diuji ditentukan secara spektrofotometri menggunakan reagen Folin-Cicocalteu. Standar yang digunakan dalam percobaan adalah asam galat. Kandungan total fenol tertinggi diperoleh dari perlakuan isolat bakteri E.73 dan E.76 yang menunjukkan kadar fenol lebih besar dibanding dengan kontrol (Gambar III.75). Aktivitas peroksidase yang melebihi kontrol terlihat pada tanaman padi yang diberi perlakuan isolat bakteri E.31, E.66, dan E.95, sedangkan untuk sampel yang diberi perlakuan isolat E.64, E.65, E.73, dan E.76 menunjukkan aktivitas peroksidase yang cukup jauh berada dibawah kontrol (Gambar III.76).

Pengujian Indole Acetic Acid (IAA) dilakukan terhadap isolat yang berasal dari Pangkep, Sulawesi Selatan (6), Cianjur (31), Sukabumi (26). Isolat PS7, PG24, dan PG13 menunjukkan kadar IAA yang lebih tinggi dibanding isolat lain. PS7 menghasilkan IAA tertinggi dari semua isolat dengan konsentrasi 221,45

Gambar III.73. Jumlah imago jantan H. armigera yang tertangkap pada berbagai tingkat kuantitas

komponen aktif (Z-11-16:Ald dengan Z-9-16:Ald) pada tanaman cabai.

Gambar III.74. Jumlah serangga tangkap dari hasil efikasi feromon H. armigera di pertanaman di

Brebes, Jawa Tengah. A = kedelai, B = cabai.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 traps 6 traps 9 traps 12 trapsJumlah perangkap/ha

Jum

lah

imag

o te

rtang

kap

(eko

r) Im ...

0

20

40

60

80

100

0 traps 6 traps 9 traps 12 traps

Im ...

Jum

lah

imag

o te

rtang

kap

(eko

r)

Jumlah perangkap/ha

A B

0 100

200

300

400

500

600

700

A B C D E F G Perlakuan kuantitas Feromon

Jum

lah

imag

o te

rtang

kap

(eko

r)

Im ...

LAPORAN TAHUN 2014

115

ppm, sedangkan isolat PP1 menghasilkan IAA terkecil (11,45 ppm). Perbedaan konsentrasi IAA yang dihasilkan ini diduga karena kondisi dari lokasi peng-ambilan sampel isolat, jenis bakteri, serta kemampuan dalam memproduksi IAA (Tabel III.46). Sebanyak 31 isolat bakteri tanah asal Cianjur, memiliki potensi menghasilkan hormon IAA. Kadar IAA yang tertinggi terdapat pada isolat C3A, S1A, S2D, C3D, C3B, S2A, dan S3A dengan kosentrasi berturut-turut sebesar 100,45; 98,07; 95,69; 85,6904; 78,31; 73,55; dan 64,74 ppm. Kadar IAA yang rendah, yaitu pada isolat C5B dan C1B dengan konsentrasi berturut-turut sebesar 7,53 dan 9,60 ppm. Isolat C3A memiliki konsentrasi besar dan me-nunjukkan bahwa isolat tersebut mempunyai kemampuan yang tinggi dalam memproduksi hormon IAA. Konsentrasi IAA tertinggi sebesar 82,83 mg/ml diperoleh dari isolat bakteri asal rhizosfir asal tanaman timun daerah Bojong Gentong, Sukabumi, dan terkecil sebesar 7,83 mg/ml dari isolat bakteri asal tanah karet, Pakuwon.

Hasil karakterisasi isolat penghasil enzim kitinase menunjukkan bahwa se-mua isolat mampu mengeksresi kitinase (Gambar III.77). Hampir semua isolat berada pada kekuatan reaksi enzimatik moderat, namun ada 3 isolat yang

Tabel III.46. Penghambatan infeksi hawar pelepah daun (HPD) yang disebabkan Rhizoctonia solani oleh isolat endofit.

perlakuan Infeksi HPD Penghambatan-%

Kontrol (tanpa endofit + RS) 18,98 ab - E.31 + Rs 08,11 c 57,27 E.64 + Rs 14,38 bc 24,24 E.65 + Rs 10,25 bc 45,99 E.66 + Rs 11,41 bc 39,88 E.73 + Rs 19,37 ab - E.76 + Rs 11,43 bc 39,78 E.95 + Rs 26,00 a -

Angka selajur yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji DMRT P = 0,05.

Gambar III.75. Kandungan fenol tanaman padi yang diaplikasi isolat bakteri endofitik.

0

50

100

150

200

Kontrol Perlakuan

Kon

sent

rasi

E.31 E.64 E.65 E.66 E.73 E.76 E.95


116

reaksi enzimatiknya kuat. Isolat PG13, PP5, dan PS4 memiliki indeks kitinolitik tertinggi dibanding dengan 12 isolat lainnya, yaitu sebesar 2,25; 1,75; dan 1,63 (Tabel III.48). Hasil pengujian secara kualitatif menunjukkan bahwa dari 31 isolat asal Cianjur yang memiliki zona bening, yaitu sebanyak 24 isolat seperti yang ditunjukkan oleh isolat C6B, sedangkan 7 isolat lainnya tidak memiliki zona bening seperti yang ditunjukkan oleh isolat C4C. Hasil pengujian indeks kitinolitik menunjukkan isolat yang mempunyai indeks kitinolitik yang paling tinggi adalah C6B dan C3D dengan indeks kitinolitik sebesar 1,44 dan 1,43.

Hasil pengukuran kuantitatif aktivitas kitinase menunjukkan isolat LP2, LP1, dan PS7 memiliki aktivitas yang lebih tinggi diantara 15 isolat yang di-analisis. Aktivitas kitinolitik isolat LP2 sebesar 0,0088 U/ml merupakan aktivitas tertinggi dari keseluruhan isolat (Gambar III.78 dan III.79).

Gambar III.76. Aktivitas peroksidase tanaman padi yang diaplikasi isolat bakteri endofitik.

Gambar III.77. Uji kualitatif aktivitas kitinase isolat SG4.

Zona bening

Koloni bakteri

0

300

400

500

600

Kontrol Perlakuan

Akt

ivita

s P

erok

sida

se

E.31 E.64 E.65 E.66 E.73 E.76 E.95

200

100

LAPORAN TAHUN 2014

117

Hasil pengujian aktivitas Glukanase yang diperoleh menunjukkan bahwa sebelas isolat mampu menghasilkan glukanase (Gambar III.80), sedangkan 4 isolat sisanya, yaitu LP2, PG13, PR22, dan PP5 tidak memiliki aktivitas glukanase. Isolat PR14, PR34, dan PP2 memiliki indeks glukanolitik di atas rerata isolat, sedangkan indeks glukanolitik terbesar ditunjukan isolat PR14. Isolat yang menghasilkan indeks glukanolitik dianalisis aktivitasnya secara kuantitatif berdasarkan gula pereduksi dengan metode DNS. Aktivitas enzim glukanase tertinggi terdapat pada isolat PP2 sebesar 37,6 U/ml, kemudian di-ikuti oleh PP1 dan PR14. Aktivitas spesifik tertinggi ekstrak kasar enzim ter-dapat pada isolat PR14 memiliki glukanase sebesar 0,51 U/mg (Tabel III.49).

Tabel III.47. Hasil pengukuran IAA pada isolat asal Pangkep-Sulsel dan isolat asal Sukabumi.

Kode isolat Absorbansi [IAA] (mg/mL)

PG13 0,488 142,06 PG24 0,192 52,36 PP1 0,057 11,45 PP2 0,099 24,18 PR22 0,093 22,36 PS7 0,750 221,45 KP 1 0,147 7,83 KP 2 0,556 76 KP 3 0,272 28,67 KP 4 0,385 47,5 BL 1 0,166 11 BL 2 0,170 11,67 SC 1 0,158 9,67 SC 2 0,420 53,33 SC 3 0,191 15,17 SC 4 0,227 21,17 TB 1 0,416 52,67 TB 2 0,526 71 TB 3 0,842 53,17 SM 1 0,368 44,67 SM 2 0,165 10,83 JP 1 0,279 29,83 JP 3 0,197 16,17 JP 4 0,170 11,67 JP 5 0,492 65,33 CP 2 0,161 10,17 CP 4 0,454 59 MB 1 0,597 82,83 MB 2 0,546 74,33 PB 1 0,156 9,33 PB 2 0,316 36 KP 5 0,163 10,5


118

Gambar III.78. Aktivitas kitinolitik isolat Kalsel, Sulsel, dan Sukabumi.

Gambar III.79. Aktivitas kitinolitik isolat asal Pacet, Cianjur.

Kode Isolat

Akt

ivita

s ki

tinas

e (U

/ml)

0,007

0,006

0,005

0,004

0,003

0,002

0,001

0

Tala

s (1

)

Tala

s (2

)

Ubi

(1)

Ubi

(2)

Jagu

ng (1

)

Jagu

ng (2

)

Jagu

ng (3

)

Saw

i (1)

Saw

i (2)

Cab

ai (1

)

Gan

dum

(1)

Gan

dum

(2)

Baw

ang

(1)

Baw

ang

(2)

0,01

Kode Isolat

Akt

ivita

s en

zim

(U/m

l)

0,009

0,008

0,007

0,006

0,005

0,0040,003

0,0020,001

0

KR

1

LP1

LP2

PG

13

PG

24

PP

1

PP

2

PP

5

PR

14

PR

22

PR

34

PS

1

PS

4

PS

7

SG

4

LAPORAN TAHUN 2014

119

Tabel III.48. Pengukuran indeks kitinolitik isolat asal Kalsel, Sulsel, dan Jabar (Cianjur, Sukabumi).

Kode isolat Rataan indeks kitinolitik (cm)

KR1 1,28 LP1 1,39 LP2 1,32 PG13 2,25 PG24 1,12 PP1 1,28 PP2 1,28 PP5 1,73 PR14 1,11 PR22 1,22 PR34 1,24 PS1 1,17 PS4 1,62 PS7 1,22 SG4 1,389 C1.A 1,12 C1.B 0 C1.C 1,34 C1.D 0 C2.A 1,31 C2.B 1,29 C2.C 1,17 C2.D 1,11 C3.A 0 C3.B 0 C3.C 1,29 C3.D 1,43 C4.A 1,29 C4.B 1,30 C4.C 0 C4.D 1,29 C5.A 1,29 C5.B 1,21 C5.C 1,23 C5.D 0 C6.A 0 C6.B 1,44 C6.C 1,18 S1.A 0 S1.B 1,29 S2.A 1,09 S2.C 1,11 S2.D 1,14 S2.E 1,23 S3.A 1,17 S3.B 1,5

KR = tanah dari pohon karet, Citarik, Sukabumi, SG = tanah dari pohon singkong, Sukabumi, PS = tanah dari pohon pisang, Citepus, Sukabumi; LP = tanah dari lapukan pohon pinus, Kalsel, PP = tanah dari pohon pinus, Kalsel, PG = tanah dari wilayah Pangkep, Sulsel, PR = tanah dari wilayah Panrenreng, Sulsel.


120

Gambar III.80. Contoh hasil uji kualitatif aktivitas glukanase isolat PR14.

Tabel III.49. Indeks glukanolitik isolat asal Kalsel, Sulsel, dan Jabar.

Kode isolat Rataan indeks glukanolitik Aktivitas glukanase (ppm)

KR1 1,51 89,04 LP1 1,64 99,76 PG24 1,56 78,80 PP1 4,85 48,80 PP2 3,68 109,28 PR14 4,36 29,76 PR34 3,69 108,33 PS1 1,22 42,14 PS4 1,43 119,76 PS7 1,15 42,14 SG4 1,47 99,76

KR = tanah dari pohon karet, Citarik, Sukabumi, SG = tanah dari pohon singkong, Sukabumi, PS = tanah dari pohon pisang, Citepus, Sukabumi; LP = tanah dari lapukan pohon pinus, Kalsel; PP = tanah dari pohon pinus, Kalsel; PG = tanah dari wilayah Pangkep, Sulsel; PR = tanah dari wilayah Panrenreng, Sulsel.

Pembentukan Galur Unggul Padi Tahan Penyakit Blas ...

Documents