-
PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI DASAR
Disusun oleh :
Dra. Hj. Dewi Rusmiati
Dra. Hj. Sulistianingsih, M. Kes
Dr. Tiana Milanda, M.Si.
Sri Agung Fitri Kusuma, M.Si.
Tina Rostinawati, M.Si.
Dr. Med. Melisa Intan Barliana
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS FARMASI
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JATINANGOR
2015
-
KATA PENGANTAR
Penuntun Praktikum Mikrobologi Dasar ini disusun sebagai
penuntun
bagi para mahasiswa dalam melakukan praktikum Mikrobiologi Dasar
di
FakuItas Farmasi Universitas Padjadjaran. Tujuan utamanya adalah
membantu
para mahasiswa Farmasi dalam mempelajari teknik dan prosedur
dasar
laboratorium mikrobiologi.
Materi praktikum Mikrobiologi Dasar meliputi pengenalan
mikroskop,
tcknikpewarnaan, penyiapan alat dan media, pengenalan berbagai
sifat fisiologis
bakteri sertacara identifikasi bakteri. Materi-materi tersebut
disusun dari
berbagai buku Mikrobiologi Dasar, baik teori maupun penuntun
praktikum.
Penyusun menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna,
namun
demikian diharapkan tetap dapat membantu mahasiswa atan siapa
saja yang
berminat pada bidang mikrohiologi. Akhir kata, tegur sapa dan
koreksi untuk
perbaikan buku kami sangat harapkan.
Jatinangor, 2015
Penyusun
-
TATA TERTIB DAN BENTUK LAPORAN
TATA TERTIB LABORATORIUM
Untuk mencegah kontaminasi alat dan bahan serta melindungi diri
dari
kecelakaan di laboratorium, para mahasiswa diwajibkan mematuhi
tata tertib
laboratorium sebagai berikut :
1. Baca dan pelajari praktikum yang akan dikerjakan, sebelum
memasuki
laboratorium.
2. Letakkan tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan di
tempat yang
tersedia. Gunakan jas laboratorium selama bekerja di
laboratorium.
3. Bersihkan meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan
sesudah
praktikum.
4. Cuci tangan dengan air dan sabun sebelum dan sesudah
praktikum.
5. Jangan makan, minum atau merokok di laboratorium. Jauhkan
tangan dan
mulut, hidung dan telinga selama praktikum.
6. Perlakukan semua mikroorganisme sebagai patogen (mampu
menimbulkan
penyakit) Tidak diperkenankan membawa keluar biakan
mikroorganisrne dari
laboratorium.
7. Usahakan biakan mikroorganisme tidak tercecer dan tidak
tercampur dengan
mikroorganisme lain. Jika tercecer, tuangkan desinfektan di
atasnya, biarkan
beberapa menit, lalu bersihkan dengan kertas isap. Jika tabung
berisi
mikroorganisme pecah, tuangkan desinfektan ke atasnya, biarkan
beberapa
menit, buang ke tempat sampah.
8. Jika mahasiswa terkontaminasi atau terluka, hubungi segera
asisten
laboratorium.
9. Ose harus disterilkan dengan memijarkan seluruh kawatnya
sebelum dan
sesudah digunakan.
10. Jika pipet yang sama digunakan lebih dan satu kali, letakkan
pada penyangga
rak tabung reaksi.
11. Api pada pembakar spirtus harus dimatikan, jika tidak
digunakan.
12. Biakan yang sudah tidak diperlukan harus diserahkan kepada
asisten.
13. Kaca obyek, kaca penutup dan pipet direndam dalam larutan
yang berisi
desinfektan, lalu dicuci dengan air dan sabun. Labu ukur,
erlenmeyer dan beker
glass dbasuh dengan desinfektan, lalu dicuci dengan air dan
sabun. Tabung
reaksi dan cawan petri diletakkan dalam panci berisi air, rebus
sampai mendidih.
lalu cuci dengan air dan sabun.
1 4. Bersihkan lensa-lensa mikroskop menggunakan kapas dan
xylene.
15. Rapihkan kembali laboratorium tempat anda bekerja.
-
BENTUK LAPORAN
A. PENGAMATAN MIKROSKOPIS
Semua pengamatan mikroskopis harus digambarkan dan diwarnai
sesuai
dengan pengamatan di bawah mikroskop, pada buku gambar khusus.
Setiap halaman
diberi garis pinggir lalu dibagi menjadi 2 bagian. Setiap bagian
diperuntukkan untuk 1
pengamatan. Pada bagian atas, dituliskan :
- Nomer dan nama kegiatan
- Tanggal pengamatan
- Zat kimia (yang dipakai)
- Sampel (mikroorganisme)
Hasil pengamatan digambarkan dalam sutui zona lingkaran dan
diberi
keterangan yang diperlukan. Buku gambar dikumpulkan dan
diperiksa pada tengah
semester.
B. LAPORAN
Kegiatan selain pengamatan mikroskopis, diwajibkan untuk
diserahkan dalam
bentuk laporan praktikum. Laporan dibuat oleh masing-masing
kelompok praktikan
dengan format sebagai berikut:
1. Cover laporan, terdiri dari nomor dan nama kegiatan, fnama
dan nomor induk
mahasiswa serta nama laboratorium tempat prakikum
berlangsung.
2. Format dalam, terdiri dari :
- tujuan
- teori singkat
- alat dan bahan
- prosedur kerja
- data pengamatan dan hasil perhitunan
- pembahasan
- kesimpulan dan saran
- daftar pustaka
- Laporan dapat ditik maupun ditulis tangan (rapih).
- Laporan harus diserahkan 1 minggu setelah praktikum tersebut
berlangsung.
- Perpindahan jam/hari praktikum hanya boleh dilakukan atas
seizin Kepala
Laboratorium Mikrobiologi Dasar.
- Mahasiswa yang mengikuti praktikum kurang dari 80% atau tidak
menyerahkan
hasil pengamatan mikroskopis dan laporan, tidak diperkenankan
mengikuti
ujian praktikum.
-
Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan
teknik
Gambar 1
-
Saran saran Kerja Aseptis :
1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam
tabung/cawan/Erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang
memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih
dahulu.
2. Pinset, batang pengaduk dll dapat disemprot dengan alcohol
70% terlebih
dahulu lalu dibakar.
3. Ujung jarum inoculum yang sudah dipijarkan harus ditunggu
dingin dahulu atau
dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat
transper
panas yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapka dalam kondisi steril
didekatkan ke
bagian api.
5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar
Bunsen tetapi jika
kerja di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka
semakin
terjamin kondisi aseptisnya.
-
KEGIATAN I
MIKROSKOP MEDAN TERANG
TUJUAN
Memperkenalkan prinsip-prinsip penting Mikroskopi cahaya,
bagian-bagian
mikroskop majemuk, penanganan dan pemeliharaan serta penggunaan
mikroskop yang
baik.
TEORI SINGKAT
Mikroskop Medan Terang
Mikroskop Medan Terang (bright field microscope) adalah
mikroskop dengan medan
rnikroskopis atau medan yang mengelilingi spesimen terlihat
terang, sedangkan obyek
yang diamati tampak lebih gelap dari latar belakangnya. Hal ini
disebabkan cahaya dari
suatu sumber masuk melalui sistem-sistem lensa tanpa mengalami
perubahan, sehingga
terbentuk medan yang terang. Mikroskop yang dipakai saat ini
umumnya menggunakan
dua sistem lensa terpish, yaitu lensa obyektif dan lensa okular,
maka mikroskop ini
disebut pula sebagai mikroskop majemuk.
Pada umumnya, mikroskop ini menghasilkan perbesaran maksimum
sekitar 1000X.
Ketajaman bayangan pada perbesaran maksimum tergantung pada
pengaturan
diafragma, kondensor, minyak emersi dan faktor-faktor lain
Gambar l. Mikroskop Majemuk
1
-
Lensa dan Perbesaran
Lensa mikroskop terdapat pada kondensor, obyektif dan okular.
Kondensor
merupakan lensa pengumpul cahaya di bawah pentas yang memusatkan
cahaya pada
spesimen. Lensa obyektif merupakan lensa yang terletak dekat
dengan spesirnen dan
lensa okular merupakan lensa pada ujung atas mikroskop, dekat
dengan mata.
Lensa pada kondensor memusatkan kerucut cahaya pada medan
specimen.
Sebagian berkas cahaya daam kerucut cahaya akan langsung
menembus lensa obyektif,
untuk mcmbentuk cahaya latar belakang atau medan terang. Berkas
cahaya yang
mengenai obyek akan difokuskan lensa obyektif sehingga membentuk
bayangan nyata.
Bayangan tersebut diperbesar oleh lensa okular untuk
menghasilkan bayangan maya.
Kebanyakan mikroskop laboratorium dilengkapi tiga lensa
obyektif, yaitu lensa
16 mm (berkekuatan rendah 10 X), lensa 4 mm (berkekuatan tinggi
40-45 X) dan lensa
celup minyak 1,8 mm (97-100 X). Lensa-lensa tersebut terletak
pada suatu bidang yang
dapat diputar. Angka 16, 4 dan 1,8 menyatakan jarak fokus (focal
length), sedang angka
10 X, 45 X dan 100 X nenyatakan daya perbesaran. Perbesaran
total diperoleh dengan
mengalikan perbesaran obyeklif dengan perbesaran okular.
Ujung lensa obyektif celup minyak sangat kecil sehingga hanya
sedikit cahaya
yang masuk, maka diafragma iris kondensor harus dibuka penuh dan
penghematan
cahaya dilakukan dengan bantuan minyak emersi.
Resolusi dan Daya Pisah
Bila lensa difokuskan pada suatu obyek, maka dua titik terpisah
pada benda
tersebut akan membentuk dua bayangan. Tetapi kedua bayangan
tersebut dapat terlihat
sebagai satu titik akibat adanya difraksi. Resolusi adalah
kemampuan lensa untuk
memisahkan kedua bayangan sebagai bagian-bagian yang terpisah.
Difraksi
menyebabkan resolusi tidak mungkin sempurna.
Jarak terpendek yang masih mungkin untuk melihat dua bayangan
sebagai
bagian-bagian terpisah disebut daya pisah lensa. Daya pisah
ditentukan oleh panjang
gelombang cahaya dan tingkap numeris (numerical aperlure atau
NA) sistem lensa
obyektif dan kondensor. Hubungan tersebut dinyatakan daam
persamaan berikut :
Dari persamaan tersebut terlihat, bahwa makin pendek panjang
gelombang atau makin
besar tingkap numeris, maka makin kecil nilai r (dayapisah) atau
makin tinggi resolusi
mikroskop.
Tingkap numeris (NA) adalah pernyataan matematis kerucut cahaya
yang
dihantarkan kondensor pada spesimen dan dikumpulkan oleh lensa
obyektif.
NA = n sin , dimana n adalah indeks bias medium diantara lensa
obyektif dan
spesimen, sedang sin O adalah sinus setengah sudut yang dibentuk
kerucut cahaya dari
kondensor yang melewati spesimen menuju lensa obyektif. Bila
digunakan lensa
obyektif kering, maka n adalah indeks bias udara (n = 1). Sedang
untuk Obyektif celup
minyak n adalah indeks bias minyak emersi celup (n=1,56).
2
Daya pisah = panjang gelombng
Tingkap numeris
r =
NA obyektif + NA kondensor
-
Iluminasi
Bola pijar lebih disukai sebagai cahaya, sebab warna, dan
intensitasnya lebih
mudah dikendalikan. Bila mikroskop dilengkapi dengan cermin,
maka selalu
menggunakan sisi cermin yang datar. Sisi cermin yang datar dapat
memantulkan
berkas-berkas cahaya paralel yang diperlukan mikroskopyang
menggunakan
kondensor.
Manipulasi kondensor dan diafragma iris diperlukan untuk
mendapatkan
kontras kedalaman medan dan daya pisah yang optimum. Agar
kondensor dapat
memusatkan semua berkas cahaya pada spesimen, maka harus
terletak pada posisi
tertinggi.
Jumlah berkas cahaya yang memasuki lensa obyektif tergantung
pada jenis
obyektifnya. Semakin besar daya pembesaran obyektif, semakin
banyak cahaya yang
diperlukan. Jumlah cahaya yang masuk dapat diatur dengan membuka
dan menutup
diafragma iris, yang terletak antara kondensor dan sumber
cahaya. Sebaliknya, bila
menggunakan obyektif celup celup, diafraglna harus dibiarkan
terbuka penuh.
ALAT DAN BAHAN
1. Mikroskop majemuk medan terang.
2. Spesimen jadi bakteri.
3. Kapas dan kertas saring.
4. Minyak emersi dan xylene.
5. Air suling
PROSEDUR KERJA
A. PENANGANAN DAN PEMELIHARAAN MIKROSKOP
1. Mikroskop dibawa dalam posisi tegak dengan dua tangan, satu
tangan
memegang tangkai dan tangan yang lain menyangga dasar
mikroskop
2. Hindarkan mikroskop dari benturan tiba-tiba.
3. Jangan menyentuh lensa dengan tangan atau melepaskan lensa
dari tempatnya.
4. Jangan memiringkan mikroskop, bila bekerja dengan lensa
obyektif celup
minyak.
5. Jangan melakukan penyetelan mikroskop dengan paksa.
6. Jangan menukarkan lensa obyektif atau okular mikroskop.
7. Lensa okular harus dibersihkan setiap selesai penggunaan,
dengan kertas saring
yang dibasahi air suling, lalu dikeringkan dengan kertas
lain.
8. Bersihkan minyak emersi dari pentas dan penjepit kaca obyek
dengan kapas.
9. Bersihkan lensa obyektif celup minyak dengan kertas saring
atau kapas yang
dibasahi sedikit xylene (xylol), setiap selesai menggunakan
mikroskop. Xylene
yang terlalu banyak akan menyebabkan perekat lensa menjadi
larut.
10. Pasang lensa obyektif berkekuatan rendah pada posisi kerja,
bila mikroskop
tidak digunakan
3
-
11. Simpan mikroskop di dalam kotak setelah diselubungi dengan
plastik. Simpan
kotak tersebut di tempat yang kering atau mempunyai kelembaban
yang
rendah.
B. PENGGUNAAN MIKROSKOP
1. Letakkan mikroskop pada jarak tertentu dari tepi meja
sehingga mudah untuk
melakukan pengamatan.
2. Atur iluminasi dengan menjauhkan atau mendekatkan sumber
cahaya.
3. Letakkan spesimen di atas pentas mikroskop.
4. Buka diafragma iris dengan penuh dan naikkan kondensor sampai
sama tinggi
dengan pentas.
5. Bila diperlukan sumber cahaya dari luar; maka atur sisi datar
cenninmikroskop
sehingga cahaya terlihat pada lensa kondensor.
6. Mulailah pengamatan dengan lensa obyektif berkekuatan rendah
(10X). Dengan
bantuan tombol pengatur kasar, rendahkan lensa atau naikkan
pentas sampai
lensa obyektif terletak 54 mm dari specimen.
7. Perbaiki letak cermin dan setel diafragma iris sampai area
obyektif terletak di
tengah-tengah dan penuh cahaya. Jauhkan lensa obyektif secara
perlahan-lahan
dengan tombol pengatur kasar sampai terlihat bayangan. Perjelas
bayangan
dengan memutar tombol pengatur halus secara perlahan.
8. Untuk-mikroskop majemuk dengan sumber cahaya terpasang, putar
pengatur
filter kerapatan netral (neutral density filter), sehingga lensa
es (frosted lense)
terpasang pada tempatnya.
9. Jika ingin menggunakan lensa obyektifkering tinggi (40-45 X),
putar lensa ke
posisi kerja, rendahkan lensa obyektif atau naikkan pentas
dengan tombol
pengatur kasar, sampai hampir menyentuh kaca obyek.
Jauhkanljensa obyektif
dari spesimen dengan menggunakan tombol pengatur kasar. Stel
cahaya dan
fokus seperti pada lensa obyektif berkekuatan rendah.
10. Unfuk obyektif celup minyak, putar lensa obyektif kering
tinggi menjauhi posisi
kerja, Taruhlah setetes minyak celup di atas spesimen. Putarlah
obyektif celup
minyak pada posisi kerja, Lakukan penyetelan sepeti pada lensa
obyektif
berkekuatan rendah.
11. Usahakan memulai pengamatan spesimen dengan lensa
berkekuatan rendah,
lalu dilanjutkan dengan lensa berkekuatan tinggi.
12 Gambarkan sel-sel yang diamati dengan skala yang sesuai.
4
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 2
PENYIAPAN PREPARAT MIKROORGANISME
TUJUAN
Mempelajari teknik lekapan basah dan tetes gantung untuk
mengamati morfologi, pola
penataan dan motilitas mikroorganisme hidup di bawah
mikroskop.
TEORI SINGKAT
Untuk mengamati mikroba dengan mikroskop cahaya dapat disiapkan
dua
macam preparat, yaitu preparat basah (wel mount preparation) dan
olesan yang
diwarnai. Cara kedua lebih sering digunakan, tetapi memiliki
beberapa kelemahan.
Pada olesan yang diwamai, hanya dapat diamati mikroba yang mali,
dengan ukuran dan
pola penataan yang sering berubah serta tidak dapat diamati
pergerakannya (motilitas).
Untuk pengamatan mikroba hidup, maka mikroba tersebut harus
tersuspensi
dalam lingkungan cair yang memadai. Ada dua teknik penyiapan
preparat, yaitu
lekapan basah (wel mount) dan tetes gantung. Kedua teknik ini
menggunakan setetes
cairan yang mengandung mikroba hidup. Pada preparat basah dapat
diamati morfologi,
pola penataan khas dan gerak bakteri (motil) dalam keadaan alami
yang tidak
terganggu.
Pada pengamatan motilitas, seringkali pergerakan mikroba
dikelirukan dengan
gerak Brown. Beberapa macam alga dan protozoa dapat bergerak
bebas karena
memiliki flagela. Sedangkan beberapa jenis protozoa dapat
bergerak karena memiliki
silia atau pseudopodia (pergerakan amuboid). Pergerakan sejati
umumnya lebih
progresif dan terarah. Sedang gerak Brown merupakan gerakan
menggetar partikel-
partikel secara acak dan tidak terarah. Gerakan it tidak
mengubah posisi mikroba
nonmotil terhadap benda-benda lain di sekelilingnya.
Pergerakan sejati juga sering dikelirukan dengan pergerakan oleh
arus Cairan. Bila
preparat tersebut mengandung gelembung udara atau tidak tersegel
baik, maka arus
udara dapat menyebabkan arus cairan.
Apabila preparat basah diperiksa dengan mikroskop medan terang,
maka
diperlukan penyesuaian sumber cahaya. Intensitas cahaya dapat
dikurangi dengan
menggunakan filter khusus.
Selain pengamatan mikroskopis yang menggunakan lekapan basah,
motilitas
mikroba juga dapat diamati secara makroskopis. Bakteri ditanam
dalam medium
setengah padat (mediun semi solid) dalam tabung reaksi.
Penanaman dilakukan dengan
jarum penusuk yang ditusukkan secara tegak ke dalam medium
tersebut. Biakan
diinkubasikan pada suhu yang sesuai selama 18-24 jam. Jika
terdapat motilitas, maka
seluruh medium menjadi keruh, Tetapi jika bakteri hanya hidup
pada daerah tusukan
saja, maka motilitas negatif
5
-
ALAT DAN BA HAN
l. Mikroskop majemuk
2. Suspensi bakteri Bacillus subtilis
3. Kaca obyek dan kaca obyek cekung
4. Kaca tutup
5. Vaselin
6. Air suling
7. Kapas dan kertas saring
PROSEDUR KERJA
A. PENYIAPAN LEKAPAN BASAH
1. Letakkan setetes suspensi bakteri di tengah-tengah kaca
obyek.
2. Usapkan sedikit vaselin pada tepi telapak tangan kiri, lalu
sentuhkan secara
bergantian pada ke empat sisi kaca tutup sehingga terlapisi
vaselin.
3. Letakkan kaca tutup dengan bagian bervaselin ke arah kaca
obyek, sehingga
mengelilingi suspensi bakteri, lalu tekan perlahan-lahan.
4. Amati di bawah mikroskop dengan lensa obyektif kering tinggi
(40-45 X).
Gambarkan pengamatan morfologi, pola penataan sel dan motilitas
dengan
skala yang sesuai.
B. PENYIAPAN PREPARAT TETES GANTUNG
1. Ambil sebuah kaca tutup yang bersih, lalu lapisi ke empat
sisinya dengan
Vaselin.
2. Taruhlah setetes suspensi bakteri di tengah-tengah kaca tutup
tersebut.
3. Pegang kaca obyek cekung dengan bagian cekung menghadap ke
bawah.
Dekatkan kaca obyek pada kaca tutup, sehingga bagian cekung
akan
mengelilingi suspensi bakteri. Tekan perlahan-lahan sampai
vaselin menyebar
dan membentuk segel.
4. Balikkan kaca obyek tersebut dengan cepat, sehingga suspensi
bakteri akan
menggantung di kaca tutup tanpa menyentuh kaca obyek.
5. Amati di bawah mikroskop dengan lensa obyektif kering tinggi
(40-45 X).
Gambarkan pengamatan morfologi, pola penataan sel dan motilitas
dengan
skala yang sesuai.
6
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 3
PENYIAPAN OLESAN BAKTERI
TUJUAN
Mempelajari cara menyiapkan olesan bakteri yang baik, sebagai
prasyarat untuk
berbagai pewarnaan.
TEORI SINGKAT
Olesan bakteri yang baik merupakan prasyarat bagi berhasilnya
berbagai teknik
pewarnaan. Olesan yang baik adalah olesan tidak terlalu tebal
alau terlalu tipis dan
tahan pencucian satu kali atau lebih, setelah difiksasi dengan
panas. Bakteri tidak hilang
tercuci, dengan bentuk tetap dan tidak menyusut.
Kaca obyek yang digunakan harus bersih dari debu dan lemak serta
tidak boleh
tergores. Partikel-partikel debu dan goresan pada kaca obyek
dapat dikelirukan dengan
mikroorganisme. Di samping itu, olesan pada kaca obyek yang
berlemak atau berdebu
akan cenderung mengumpul dan tidak menyebar dengan baik.
Hal penting lainnya ialah kemampuan menaruh sejumlah
mikroorganisme yang
tepat pada kaca obyek, sehingga olesan tidak terlalu tebal atau
terlalu tipis. Pada olesan
yang terlalu tebal, sel-sel bakteri akan bertumpuk sehingga
sukar diamati secara
individu. Jumlah cahaya yang lewat melalui spesimen juga
berkurang sehingga
menyulitkan pengamatan. Keadaan ini sering tejadi pada
olesan-olesan dari biakan
yang diambil dari medium padat. Sedang pada olesan yang terlalu
tipis, akan sulit
menemukan sel-sel tersebut. Keadaan tersebut cenderung terjadi
pada olesan-olesan
yang dibuat dari biakan dalam medium cair.
Penyiapan olesan berbeda menurut jenis medium tempat tumbuh
mikoorganisme. yang bersangkutan. Bila medium berupa cairan
(kaldu, susu, air liur,
air seni dan sebagainya), maka penyiapan olesan dimulai dengan
menaruh satu atau dua
lup penuh biakan di atas kaca obyek.
Bila biakan berasal dari medium padat (agar miring, agar cawan
atau bagian-
bagian tubuh), maka taruh satu atau dua lup penuh NaCl
fisiologis steril di atas kaca
obyek, lalu campurkan sejumlah kecil biakan organisme. Sel-sel
bakteri pada medium
padat cenderung saling melekat, sehingga harus disebarkan dengan
baik. Untuk
mengambil biakan, gunakan jarum inokulasi yang lurus sehingga
tidak terlalu banyak
biakan yang terambil.
Olesan bakteri harus betul-betul kering di udara terbuka sebelum
difiksasi
dengan panas. Fiksasi pada olesan yang belunn kering akan
menyebabkan sel-sel
bakteri seakan-akan terebus dan bentuknya menjadi tidak karuan.
Fiksasi panas juga
dilakukan secukupnva untuk menghindarkan salah bentuk atau
penyusutan sel.
Meskipun kaca obyek untuk penyiapan olesan tersebut tidak
steril, namun tetap
digunakan teknik antiseptik. Hal tersebut untuk menghindari
tercemarinya biakan yang
digunakan, juga untuk melindungi diri dari kontaminasi
mikroorganisme.
7
-
ALAT DAN BAHAN
1. Suspensi bakteri pada medium cair.
2. Biakan bakteri pada medium padat.
3. Kaca obyek dan kapas
4. Alkohol 70 % dan NaCl fisiologis steril.
5. Pembakar spirtus dan spidol
6. Lup inokulasi (ose) dan jarum inokulasi.
PROSEDUR KERJA
1. Bersihkan kaca obyek dengan kapas yang dibasahi alkohol 70 %,
lakukan pada
kedua permukaannya.
2. Setelah bersih, peganglah kaca obyek pada pinggir-pinggirnya
dan buat
lingkaran di tengah-tengah permukaan bawah kaca obyek dengan
spidol
3. Bila biakan dalam medium cair, kocok biakan tersebut dengan
baik, tanpa
membasahi sumbat tabung. Taruhlah 1-2 lup penuh suspensi
mikroorganisme
pada kaca obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawahnya.
Sebarkan
organisme hingga rata seluas area lingkaran.
4. Bila biakan dalam medium padat, taruhlah 1-2 lup penuh air
suling pada kac
obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawalmya. Dengan
jarum inokulasi,
pindahkalah sedikit biakan ke tetesan air, campurkan dan
sebarkan hingga rata
seluas area lingkaran.
5. Biarkan olesan tersebut kering di dekat hawa hangat api.
Olesan yang
mengering akan tampak lapisan tipis berwarna putih.
6. Setelah olesan benar-benar kering, lalukan kaca obyek
tersebut.tiga kali di atas
api. Proses ini disebut fiksasi panas untuk mematikan
mikroorganisme yang
bersangkutan dan membuatnya menempel pada kaca obyek.
7. Gunakan olesan-olesan tersebut untuk pewarnaan pada
kegiatan-kegiatan
berikutnya.
8
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 4
PEWARNAAN SEDERHANA
Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari
bakteri, dengan
menggunakan satu macam zat pewarna.
TEORI SINGKAT
Sel-sel mikroorganisme umumnya tampak hampir tembus pandang
(transparan)
bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa. Hal tersebut
diakibatkan indeks bias
sitoplasma sel hampir sama dengan indeks bias lingkungan, yang
berupa zat cair.
Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan
cara mewamai sel-
sel tersebut dengan zat warna.
Ada dua golongan zat warna yang umum dipakai untuk pewarnaan
mikroorganisme, yaitu :
l. Zat warna yang bersifat asam, dimana komponen warnanya adalah
anion,
biasanya dalam bentuk garam natrium.
2. Zat warn yang bersifat alkalis dengan komponen warna kation,
biasanya dalam
bentuk klorida.
Pada pewarnaan bakteri, terjadi proses pertukaran ion-ion zat
warna dengan ion-
ion protoplasma bakteri. Pada umumnya digunakan larutan-larutan
zat warna yang
encer, jarang lebih dari 1 0%. Suatu larutan zat warna encer
yang didiamkan agak lama
pada preparat, umumnya bekerja lebih baik daripada larutan zat
warna pekat yang
didiamkan dalam waktu singkat.
Zat pemantek (mordant) sering ditambahkan pada waktu pewarnaan.
Zat
tersebut berfungsi untuk menambah gaya gabung, dimana hasil
reaksi antara sel dan zat
warna diendapkan oleh pemantek menjadi presipitat berbulir-bulir
besar, sehingga tidak
mungkin keluar melalui pori-pori dinding sel.. Contoh zat
pemantek adlah amonium
oksalat, fenol, iodium, asam tanat, garam-garam alumunium, besi,
timah, sego,
tembaga, krom dan lain-lain. umumnya zat ini diberikan
- Sebelum penambahan zat warna
- Ke dalam larutan zat warna
- Antara pemakaian dua larutan zat warna
Teknik pewarnaan mikroorganisme dapat dibagi menjadi dua, yaitu
.
1. Pewarnaan sederhana (tunggal)
2. Pewarnaan diferensial
Pewarnaan yang paling banyak digunakan ialah pewarnaan tungal,
yang
mengunakan satu jenis zat warna. Zat-zat warna tersebut umumnya
bersifat alkalin,
karena sitoplasma sel bakteri bersifat basofilik (suka akan
basa).
Pewarnaan tunggal memungkinkan teramatinya ukuran dan
bentuk/tipe
morfologi (kokus, basilus vibrio, spirilium, dsb.) dari bakteri.
Selain itu, dapat pula
diamati struktur-struktur tertentu bakteri, seperti endospora.
Berbeda dengan spesimen
hidup, sel-sel yang diwamai dan terfiksasi pada kaca obyek dapat
dismpan sebagai
dokumentas untuk jangka waktu lama.
9
-
ALAT DAN BAIIAN
1. Sampel air liur
2. Suspensi campuran bakteri S. aureus dan B. subtilis.
3. Suspensi campuran bakteri E. coli dan B. sublilis.
4. Zat warna karbol fuksin, biru metilen dan karbol gentian
violet.
5. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.
6. Alkohol 70 % dan air suling dalam botol semprot.
7. Ose dan pembakar spirtus.
8. Bak pewarna.
9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Buat masing-masing olesan bakteri dari air liur dan suspensi
campuran bakteri
di atas kaca obyek yang bersih serta bebas lemak.
2. Setelah dingin, letakkan preparat tersebut di atas bak
wratna, Genangi olesan
tersebut dengan salah satu dari zat warna. Bila digunakan karbol
fuksin, biarkan
olesan terwarnai selama 5 menit. Bila digunakan biru metilen,
biarkan olesan
terwarnai selama 1-2 tnenit, Sedang bila digunakan karbol
gentian violet,
biarkan olesan terwarnai selama 15-30 detik.
3. Tuangkan zat warna yang berlebih dari preparat lalu bilas
dengan air sampai
air bilasan berwarna pucat.
4. Keringkan preparat dengan kertas saring.
5. Teteskn sedikit minyak emersi pada preparat, lalu periksa di
bawah
mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X.
lalu ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan
hasilnya.
Pewarnaan dengan karbol fuksin, sel bakteri akan berwarn merah.
Bila
diwarnai dengan karbol gentian violet, sel bakteri akan berwarna
ungu, Sedang
pewarnaan dengan biru metilen, sel bakteri akan berwarna
biru.
10
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 5
PEWARNAAN GRAM
TUJUAN
Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram
negatif, dengan
menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami setiap langkah dan
reaksi-reaksi
kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Pewarnaan tunggal memungkinkan untuk mengamati ukuran dan bentuk
bakteri
secara jelas. Tetapi bentuk bakteri-bakteri dengan morfologi
yang sama dari jenis yang
berbeda, pewarnaan tersebut tidak dapat membedakannya. Untuk
maksud tersebut,
maka dikembangkan teknik pewarnaan diferensial.
Pewarnaan diferensial bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat
bakteri terhadap
dua jenis pewarnaan dan untuk mengidentifikasi bakter. Zat-zat
warna yang dipakai
lebih dari satu warna, baik dipakai satu-persatu maupun dalam
suatu campuran.
Pada tahun 1884, seorang ahli bakteriologi Denmark menemukan
pewarnaan
Gram. Melalui metode ini bakteri-bakteri dipisahkan menjadi dua
kelompok besar,
yaitu :
1) Bakteri Gram positif, yang dapat menahan kompleks pewarna
primer karbol
gentian violet-iodium sampai akhir prosedur (sel benvarna biru
gelap atau
ungu).
2) Bakteri Gram negatif, yang kehilangan kompleks warna karbol
gentian violet-
iodium dengan pembilasan alkohol dan tenwarnai oleh pewarna
tandingan air
fuksin (sel berwarna merah muda).
Sekalipun mekanisme pewarnaan Gram belum diketahui dengan tepat,
tetapi
perbedaan komposisi dinding sel bakteri Gram positif dengan Gran
negatif, diduga
berperan terhadap reaksi Gram. Dinding sel yang tebal pada
bakteri Gram positif akan
menyusut oleh pembi-lasan alkohol (terdehidrasi), sehingga
pori-pori dinding sel
menutup dan mencegah larutnya kmpleks pewarna primer pada saat
pemucatan.
Sedangkan dinding sel Granm negatif mengandung banyak lipid,
yang pada umumnya
larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid diduga
memperbesar pori-pori dinding
sel dan menyebabkan proses penmucatan berlangsung lebih cepat.
Dugaan tersebut
didukung percobaan dimana berubah menjadi Gram negatif.
Walaupun demikian, prrbedaan reaksi tetap didasarkan atas
perbedaan laju
lepas kompleks karbol gentian violet-iodium pada langkah
pemucatan. jika pemucatan
berlebih bakteri C positif dapat memperlihatkan reaksi Gram
negative. Faktor-faktor
lain yang dapat, menimbulkan keragaman pada reaksi Gram ialah
:
1) Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan
Olesan bakteri Yang dipanaskan secara berlebihan akan
menyebabkan
pecahnya dinding sel. Akibatnya sel Granm positif akan
melepaskan pewarna
primer dan menerima pewarna landingan.
11
-
2) Kerapatan sel pada olesan.
Olesan yangterlalu tebal akan memucat lebih lama dari olesan
dengan
kerapatan sel normal.
3) Konsentrasi dan umur reagen yang digunakan.
4) Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai.
Sebagai pemucat, alkohol 95% bekrja paling lambat dan aseton
paling cepat.
Umumnya digunakan campuran alkohol 95% dan aseton (l : 1).
5) Sejarah biakan.
Sejarah biakan meliputi umur biakan serta pH medium tempat
bakteri tumbuh.
Umumnya reaksi Gram menggunakan biakan berumur 18-24 jam. Biakan
Gram
positif yang lebih tua (terutama bila sudah autolisis) dalam
medium asam,
seringkali memberikan reaksi Gram positif atau Gram variabel
(campuran Gram
positif dan Gram negatif). Hal tersebut diakibatkan perubahan
permeabilitas
dinding sel pada biakan tua. Tetapi bakteri Gram negatif tidak
terpengaruh oleh
umur atau medium yang digunakan. Jangan dipersoalkan teramatinya
beberapa
sel Gram negatif dalam suatu preparat sel Gram positif.
ALAT DAN BAHAN
1. Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus.
2. Suspensi campuran bakteri E. coli dan B. subfilis.
3. Zat warna karbol gentian violet, lugol (iodium : kalium
iodium : air suling 1 :
2: 100) dan air fuksin.
4. Akohol 95 %
5. Kaca obyek; kapas dan kertas saring.
6. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.
7. Ose dan pembakar spirtus.
8. Bak pewarna.
9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari
masing-masing campuran
bakteri.
2. Letakkan kaca-kaca obyek di atas rak kawat di atas bak
pewarna. Genangi olsan
bakteri dengan pewarna karbol gentian violet selama 1 menit,
buangt zat warna
yang berlebih, lalu bilas dengan air suling.
3. Genangi olesan dengan lugol selama 2 menit, buang lugol yang
berlebih lalu
bilas dengan air suling.
4. Cuci olesan dengan pemucat alkohol 95% tetes demi tetes
selama 30 detik atau
sampai zat warna larut, lalu bilas dengan air suling.
5. Genangi olesan dengan pewarna tandlingan air fuksin selama 30
detik, buang
warna yang berlebih bilas dengan air suling lalu keringkan
dengan kertas saring.
6. Teleskan sedikit minyak emersi pada preparat, lal periksa di
bawah mikroskop.
Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, Jalu ganti
dengan lensa
12
-
obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.
Bakteri Gram positif akan benwarna ungu dan bakteri Gram negatif
akan berwarna
merah.
13
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 6
PEWARNAAN TAHAN ASAM
TUJUAN
Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan
bakteri tak tahan asam,
dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan
(Ziehl-Neelsen).
Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi
dalam prosedur
tersebut.
TEORI SINGKAT
Bakteri-bakteri dari genus dan spesies-spesies tertentu dari
genus Nocardia
mengandung sejumlah besar lipid dan asam lemak pada dinding-
dinding selnya. Hal
tersebut menyebabkan dinding sel relatif tidak permiabel
terhadap zat-zat warna,
sehingga sel-sel bakteri tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa.
Beberapa spesies dari
kedua genus tersebut patogenik terhadap manusia, seperti M.
tuberculosis (penyakit
TBC) dan M. leprae (penyakit lepra). Untuk menunjang diagnosis
penyakit-penyakit
tersebut, bakteri-bakteri penyebabnya harus dapat diisolasi,
mudah diamati dan
dibedakan dari jenis bakteri lainnya. Untuk tujuan tersebut,
maka digunakan pewarnaan
khusus yang dapat menembus dinding sel.
Teknik pewarnaan khusus tersebut diberi nama pewarnaan lahan
asam, yang
mula-mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882.
Prosedur pewarnaan
yang digunakan sekarang merupakan perbaikan dari teknik Ehrlich
ini dikenal dengan
pewarnaan Ziehl Nielsen. Nama tersebut diambil dari nama dua
peneliti yang
mengembangkan prosedur tersebut pada akhir 1800-an. Prosedur ini
menggunakan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan biru metilen
sebagai pewarna
tandingan. Pada modifikasi lain teknik ini perlakuan panas
diganti dengan penggunaan
pembasah (suatu deterjen ntuk mengurangi tegangan permukaan
lemak) untuk
menjamin penetrasi pewarna. Pewarna yang mengandung bahan
pembasah disebut
pewarna Kinyoun.
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel bakteri, seperti
mikrobakteria
menahan zat warna tersebut dan tidak terpucatkan sekalipun oleh
zat bersifat keras,
seperti asam alkohol. Asam alkohol merupakan pcmucat yang sangat
intensif. Pada
pewarnaan ini, mikroorganisme yang dapat menahan zat warna utama
dikatakan tahan
asam dan berwarna merah. Sedang pada bakteri biasa senyawa
karbol fuksin mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan menyerapan biru metilen
sehingga sel berwarna
biru. Hal yang harus diperhatlkan dalam pewarnaan ini adalah
jangan sampai preparat
mongering, bila dilakukan pemanasan. Dindng sel harus utuh untuk
mencegah lipid
yana telah terwarnai meninggalkan sel untuk melarut ke dalam
pemucat. Bila dinding
ini pecah maka lipid meninggalkan sel dan sifal tahan asamnya
akan hilang.
14
-
ALAT DAN BAHAN
1. Suspensi bakteri saprofit.
2. Zat warna karbol fuksin dan biru metilen.
3. Asam alkohol (3% HCL dalam alkohol 95%).
4. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.
5. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.
6. Ose dan pembakar spirtus.
7. Bak pewarna.
8. Mikroskop majemuk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari suspensi
bakteri, Genangi
olesan bakteri dengan pewama karbol fuksin selama 5 menit,
sambil dipanaskan
di atas penangas air. Jaga jangan sampai terlalu panas, mendidih
atau kering.
2. Buang zat wama yang berlebih, lalu bilas dengan air
suling.
3. Bilas dengan zat pemucat alkohol-asam selama 15 detik atau
sampai latar
belakang olesan berwarna merah muda pucat.
4. Genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2
menit, buang
zat warna yang berlebih, bilas dengan air suling, lalu keringkan
dengan kertas
saring.
5. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di
bawah
mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X,
lalu ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan
hasilnya.
Bakteri tahan asam (ZN + ) akan berwarna merah dan bakteri tidak
tahan asam (ZN -)
akan berwarna biru.
15
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 7
PEWARNAAN SPORA
TUJUAN
Mengamiati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur
pewarnaan spora
(pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi
kimia yang terjadi
daam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Jenis-jenis bakteri tertentu, khususnya famili Bacillaceae,
membentuk suatu
struktur di daam sel pada tempat-tempat khas, disebut endospora.
Famili ini terdiri dari
3 genus, yaitu Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Endospora
tersebut dibentuk
daam lingkungan yang tidak menguntungkan. Hal ini
disebabkan endospora dapat bertahan hidup daam kekurangan
nutrien, tahan terhadap
panas dan unsur-unsur fisik lain seperti pembekuan, kekeringan,
radiasi utraviolet serta
tahan bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri. Bilamana
keadaan lingkungan
cukup baik, dinding endospora akan pecah dan membentuk sel
vegetative kembali.
Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten
sehingga
mikroorganisme yang bersangkutan dapat bertahan hidup dalam debu
dan tanah selama
bertahun-tahun. Adanya endospora dalam debu menjelaskan mengapa
Bacillus
merupakan kontaminan umum di laboratorium.
Ketahanan endospora disebabkan adanya selubung spora yng keras
dan tebal.
Sifat tersebut menyebabkan diperlukan perlakuan yang keras untuk
mewarnainya.
Hanya dengan perakuan panas yang cukup, pewarna yag sesuai dapat
menembus
endospore. Tetapi sekali pewarna tersebut memasuki maka sukar
dihilangkan.
Ukuran dan letak endospora di dalann sel merupakan ciri-ciri
untuk
membedakan spesies-spesies bakteri pembentuk spora. Letak spora
ada tiga macam,
yaitu sentral (di tengah sel), terminal (di pinggir sel) dan
subterminal (antara sentral
dan terminal). Bentuk endospora umumnya bulat atau lonjong.
Adanya spora dapat
mengubah bentuk sel bakteri, dimana endospora menonjol keluar
seperti pemukul
tambul, misalnya pada Clostridium tetani. Bila endospora
terletak sentral atau sub terminal, dengan diameter yang lebih
besar dari diameter
bakteri, maka bentuknya seperti kumparan.
ALAT DAN BAHAN
1. Biakan padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam.
2. NaCl fisiologis.
3. Zat warna karbol fiuksin dan biru metilen.
4. H2S04 1%
5. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.
6. Alkohol 70 % dan air suling dalam botol semprot.
16
-
7. Ose dan penbakar spirtus.
8. Bak pewarna.
9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Buat suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan
NaCl fisiologis di
tabung reaksi. tambahkan korbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam
suspensi
tersebut.
2. Panaskan campuran tersebu dalam pemanas air bersuhu 800C
selama 10 menit.
Jaga jangan sampai mendidih atau kering.
3. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari campuran
tersebut.
4. Genangi olesan dengan H2S04 1% selama 2 detik, lalu cuci
dengan air suling.
5. Genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 5
menit, buang
zat warna yang berlebih, bilas dengan air suling, lalu keringkan
dengan kertas
saring.
6. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di
bawah mikroskop.
Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti
dengan lensa
obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.
Endospora akan
berwarna merah dan badan vegetative akan berwarna biru.
17
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 8
PEWARNAAN NEGATIF
TUJUAN
Mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh
pewarna-pewarna sederhana,
dengan menggunakan prosedur pewarnaan negatif. Memahami setiap
langkah dan
reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar
belakang
menjadi hitam gelap). Melode pewarnaan negatif meliputi
pencampuran
mikroorganisme dengan setetes tinta Cina, lalu disebarkan pada
kaca obyek yang
bersih. Mikroorganisme akan terlihat transparan (tembus pandang)
di medan tidak
dapat menembus yang gelap, karena pewarna-pewarna tersebut
menembus
mikroorganisme. Metode ini berguna untuk bakteri-bakeeri
tertentu, seperti spiroketa,
yang sukar diwarnai.
Pewarnaan negatif berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran
sel suatu
mikroorganisme. Pada pewarnaan ini, olesan dipanaskan maupun
mendapatkan
perlakuan keras bahan-bahan kimia sehingga dapat menghindarkan
terjadinya
penyusutan atau salah bentuk sel. Tetapi jika pewarna sudah
mengering, sel-sel tersebut
dapat saja mengalami penyusutan atau salah bentuk.
Keberhasilan metode ini bergantung pada hal-hal berikut :
1. Kaca obyek harus betul-betul bersih (bila terdapat sisa-sisa
lemak dan debu,
maka olesan mikroorganisme tidak akan rata).
2. Jumlah tinta Cina yang digunakan menentukan keberhasilan
pewarnaan (tidak
boleh berlebih).
3. Campuran mikroorganismc dan pewarna harus diseret di atas
kaca obyek bukan
sekedar didorong.
ALAT DAN BAHAN
1. Suspensi bakteri Klebsiela sp.
2. Tinta Cina.
3. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.
4. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.
5. Ose dan pembakar spiritus.
6. Bak pewarna.
7. Mikroskop majemk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Sediakan 2 kaca obyek yang bersih. Lelakkan satu ose suspensi
bakteri dan
18
-
satu tetes cina (1:1) di deka ujung kanan kaca obyek
pertama.Campurkan
keduanya dengan menggunakan kaca (obvek kedua, sanpai
homogen.
2. Letakkan kaca obyek kedua pada kaca obyek pertama dengan
membentuk sudut
450, Tarik kaca obyek kedua sepanjano kaca obyek pertama
dengan
menyeretnya ke arah kiri.
3. Biarkan preparat tersebut mengering dengan sendirinya.
4. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat lalu periksa di
bawah mikroskop
Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti
dengan lensa
obyek tifbeckekuatan 100X. Amati dan gambarkan-hasilnya.
Sel bakteri akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar
belakang
yang gelap.
19
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 9
PEWARNAAN KAPSUL
TUJUAN
Mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan
kapsul
(pewarnaan Burri-Gins). Memahami setiap langkah dan
reaksi-reaksi kimia yang
terjadi dalam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Beberapa jenis bakteri dan algae hijau-biru mengeluarkan
bahan-bahan yang
amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya dan
menyelubungi dinding sel. Bila
bahan berlendir tersebut kompak dan menampakkan bentuk yang
pasti (bundar atau
lonjong) maka disebut kapsul. Tetapi bila bentuknya tidak
teratur dan menempel
kuranng erat pada sel, maka disebut lapisan lendir.
Kapsul dan lendir tidak esensial bagi kehidupan sel, tetapi
dapat berfungsi
sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis
(baik dalam tubuh inang
maupun di alam bebas) atau perlindungan terhadap dehidrasi.
Kemampuan
menghasilkan kapsul merupakan sifal genetis, tetapi ukuran dan
jumlahnya sangaat
dipengaruhi oleh komposisi medium tempat tumbuh sel-sel
tersebut. Ukuran kapsul
berbeda-beda dalam setiap jenis bakteri maupun dalam galur-galur
yang berbeda dalam
satu spesies. Pada bebeiapa jenis bakteri, keberadaan kapsul
merupakan petunjuk
bahwa mikroorganisme tersebut bersifat virulen (misalnya
Streptococcus pneumoniae
atau pneumokokus patogenik). Maka diagnosis pneumonia dan
beberapa penyakit lain
dapat dipermudah oleh pewarnaan kapsul. Kapsul bakteri umumnya
larut dalam air.
Komposisi kimiawi kapsul berbeda-beda menurut jenis
mikroorganismenya.
Ada yang berupa polimer glukosa (misalnya, dekstran pada
leuconostoc
mesenleroides), polimer gula-annino (misalnva, asan hialuronat
pada
stafilokokuspiogenik), polipeptida (misalnya, polimer asam
D-glutamat pada Bacillus
anthracis) atau kompleks polisakarida-protein (misalnva,
basillus
disentri).
Bakteri berlendr dapat mengganggu perindustrian, misalnya pada
pembuatan
gula tebu. Belacoccus dextranicus dapat membentuk lendir yang
sangat banyak
sehingga memampatkan mesin pembuat gula. Bacillus subtillis
kadang-kadang
mengganggu pembuatan roti. dengan membentuk lendir yang liat
yang kenyal.
Kapsul bakteri sangat sukar diamati deng0\an nikroskop cahaya
biasa karena tidak
berwarna dan mempunyai indeks bias yang rendah. Kapsul bakteri
bersifat non-ionik,
maka tidak dapat diwarnai dengan prosedur pewarnaan sederhana.
Masalah utama
dalam pewarnaan kapsul adalah bila olesan bakteri tersebut
difiksasi dengan panas
dengan mtlode biasa maka kapsul tersebut akan meluncur pada
waktu pencucian. Tetapi
kebuluhan bakteriologis biasanya hanya memerlukan deteksi ada
atau tidaknya kapsul.
Tuuuan ini dapat dicapai dengan
menggabungkan prosedur pewarnaan negattf dengan pewarnaan
sederhana.
20
-
ALAT DAN BAHAN
1. Suspensi bakteri Klebsiela sp.
2. Tinta Cina dan zat warna air fuksin
3. Kaca obyek, kapas dan kertas saring
4. Alkohol 70% dan air suling dalam botol seprot
5. Ose dan pembakar spirtus
6. Bak pewarna.
7. Mikroskop majemuk dan minyal celup/emersi
PROSEDUR KERJA
1. Sediakan 2 kaca obyek yang bersih. Letakkan satu ose suspensi
bakteri dan stu
tetes Tinta Cina (1:1) pada dekat ujung kanan kaca obyek
pertama. Campurkan
keduanya dengan menggunakan sudut kaca obyek kedua, sampai
hornogen.
2. Letakkan kaca obyek kedua pada kaca obyek pertama dcngan
membentuk
sudut450. Tarik kaca obyek kedua sepanjang kaca Obyek pertama
dongan
menyeretnya ke arah kiri.
3. Fikssi preparat tersebut dengan melalukannya sebanyak 3 kali
di atas api.
4. Genangi dengan pewarna air fuksin selama 5 menit, buang zat
warna yang
berlebih, lalu keringkan dengan kertas saring.
5. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di
bawah
mikroskop.Mulailah dengan obyektif berkekuatan rendah 10X, lalu
ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan. 100X. Amati dan gambarkan
hasilnya.
Sel bakteri akan berwarna merah dan kapsul tampak sebagai bagian
yang
kosong di Sekitar tubuh bakteri.
21
-
HASIL PENGAMATAN
-
KEGIATAN 10
PEMBIAKAN BAKTERI
10.1. Pcnyimpanan Media
Tujuan
Mempelajari prosedur umum untuk merekonstitusi medium berbentuk
bubuk dan
menaruhnya dalam jumlah yang dikehendaki ke dalam wadah-wadah
yang sesuai.
Teori Singkat
Medium adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkah
mikroorganisme
di atas atau di dalamnya. Persyaratan unluk membuat medium itu
amat beragam,
diantaranya yang utama adalah air, karbon, energi, mineral dan
faktor tumbuh. Air
merupakan komponen utama protoplasma (70-85% protoplasma terdiri
dari air) serta
wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya sekresi
ataupun ekskresi
dari dalam sel. Selain itu air juga diperlukan untuk
berlangsungnya reaksi-reaksi
enzimatik di dalam sel. Air yang digunakan adalah air suling.
Air sadah tidak dapat
digunakan karena pada medium yang mengandung pepton dan ekstrak
daging dapat
menyebabkan terbentuknya endapan fostal dan magnesium
fosfat.
Berdasarkan pada sumber karbon yang digunakan, organisme dibagi
menjadi
dua kelompok yaitu organisme autotrof (organisme yang dapat
mensintesis semua
komponen selnya dari karbon diokside) dan organisme heterotrof
(organisme yang
memerlukan satu atau lebih senyawa organik sebagai sumber
karbonnya termasuk
karbondiokside).
Lebih jauh lagi, organisme dikelompokkan berdasarkan pada sumber
energinya
yaitu adalah fotoautotrof (autotroph fotosintetik) adalah
aututrof yang dapat
memancarkan energi cahaya matahari dengan bantuan pigmen
fotosintetiknya,
sedangkan yang memperoleh energi dari oksidas senyawa-senyawa
anorganik
sederhana (seperti nitrit, nitrat atau sulfide) disebut
kemoaufotrof (autotrof
kemosintetik). Kemoheterotrof (heterotrof kemosintetik) adalah
heterotrof yang
memerlukan sumber energi organik seperti glukose atau asam-asam
amino. Sebagian
besar bakteri termasuk kelompok ini. Fotogeterotrof (heterotroph
fotosintetik)adalah
organisme yang dapat memanfaatkan energi cahaya matahari
(mempunyai pigmen
fotosintetik) dan memerlukan sumber karbon organik seperti
alkohol.
Sumber nitrogen bagi organisme autotrofk adalah senyawa
anorganik,
sedangkan bagi heterotrof dapat berupa asam amno atau
senyawa-senyawa protein
intermediat seperti peptde, protease, dan pepton. Misalnya, pada
kaldu nutrien (nutrient
broth), nitrogen diperoleh dari ekstrak daging dan pepton.
Faktor tumbuh ialah
komponen selular esensial (yaitu asam-asam amino atau vitamin)
yang tidak dapat
disintesis sendiri oleh organisme dari sumber dasar karbon dan
nitrogennya. Bagi
banyak heterotrop, factor tumbuh dipenuhi dari ekstrak daging
ataukaldu nutrient.
Namun bagi pathogen-patogen yang lebih rewel (fastidious),untuk
penyediaan faktor
22
-
tumbuhnya memerlukan medium yang lebih rumit seperti agar
darah.
Berdasarkan komposisi kimianya, dikenal medium sintetik yaitu
medium yang
komposisi kimiawinya diketahui dengan pasti dan biasanya dibuat
dari bahan-bahan
kimia yang kemurniannya tinggi dan ditentukan dengan tepat,
sehingga medium ini
dapat diulangi pembuatannya, Medium nonspesifik atau kompleks
adalah medium yang
komposisi kimiawinya tidak diketahui dengan pasti, misalnya
ekstrak daging dan
pepton.
Kaldu nutrien disebut medium serbaguna karena merupakan medium
yang
paling umum digunakan dalam bakteriologi. Sedangkan medium yang
mengandung
zat-zat kimia tertentu yang dapat menghambat petumbuhan. satu
kelompk bakteri atau
lebih tanpa menghambat pertumbuhan organisme yang diinginkan
disebut medium
selektif. Selain itu dikenl pula medium diferensial yaitu medium
yang mengandung
kimia tertentu yang memungkinkan si pengamat membedakan berbagai
tipe bakteri.
Berdasarkan konsistensinya, medium dibagi menjadi medium cair
seperti kaldu
Nutrient atau kaldu glukosa. Medium ini dapat digunakan untuk
pembiakan organisme
dalam jumlah besar, penelaahan fermentasi, dan berbagai macam
uji. Medium padat,
biasanya digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi
koloni dan
mengisolasi biakan murni. Untuk membuat medium pdat, dapat
ditambahkan agar-
agar, gelatin atau gel silica ke dalam medium kaldu. Agar-agar
menjadi larut atau cair
bila dipanaskan pada suhu hampir 1000C dan tetap berbentuk cair
bila didinginkan
sampai kurang lebih 430C. Hal ini berbeda dengan gelatin, sekali
menjadi padat tidk
dapt dicairkan lgi. Oleh karena itu yang paling umum digunakan
ialah agar-agar
namun tidak dianjurkan untuk mencairkan kembali medium padat
agat lebih dari dua
kali karena dapat memberikan hasil yang kurang baik, Sedangkan
medium dengan
konsistensi pertengahan disebut medium setengah padat, medium
ini dapat digunakan
untuk menguji ada tidaknya motilitas dan kemampuan
fernentasi.
Alat dan Bahan
Gelas ukur 200-250 ml
gelas piala 250 ml
neraca berlengan tiga
kertas timbang
spatula atau sendok
batang pengaduk kaca atau pemusing magnetik
pembakar Bunsen kaki tiga dan kasa
kertas pH atau pH meter
thermometer
pipet10 ml atau gelas ukur 25 ml
tabung reaksi (9 buah)
cawan petri (8 buah)
kapas untuk sumbat
papan miring
keranjang/rak tabung
23
-
nutrient agar (NA; agar nutrien) Difco
larutan penyangga baku (standard buffer) pH 7,0 dan pH 4,0
Prosedur Kerja
1. Penyiapan dan penempatan Medium untuk Disterilkan
Bacalah dengan teliti petunjuknya pada wadah berisi medium
nutrient agar
(NA). Hitunglah jumlah yang sesuai untuk volume yang dibutuhkan
yaitu dalam
percobaan ini akan disiapkan 110 ml medium.
Ukurlah 110 ml air suling menggunakan gelas ukur kemudian
tuangkan dalam
gelas piala.
Siapkan neraca berlengan tiga. Letakkan wadah yang akan dipakai
untuk
menimbang pada pinggan neraca. Ambilah medium agar nutrien
dengan spatula
atau sendok dan timbanglah seberat 25 gr.
Taruhlah medium tersebut ke atas air suling dalam gelas
Piala.
Didihkan medium agar selama beberapa menit untuk melarutkannya.
Medium
harus terus tenerus diaduk dengan batang pengaduk kaca atau
dengan alat
pemusing magnetik untuk mencegah hangusnya atau meluapnya medium
Ingat,
medium seperti medium kaldu tidak memerlukan pemanasan untuk
melarutkannya.
Pada penyiapan medium seperti agar nutrien biasanva tidak perlu
dilakukan
penyesuaian pH. Tetapi bila memerlukan penyesuaian pH, dapat
dilakukan
langkah-langkah berikut :
a. Ambillah 10 ml medium tersebut dan ukur pH nya dengan kerlas
pH atau pH
meter.
b. Sesuaikan pH 10 ml medium dengan cara menambahkan 0,1N HCL
atau NaOH
sesuai dengan keperluan.
c. Berdasarkan hasil yang diperoleh di atas, hitunglah jumlah
asam atau basa yang
perlu ditambahkan pada sisa medium untuk mencapai pH yang
diinginkan.bila
ternyata diperlukan 10 ml atau lebih 0,1N HCL asam atau basa,
gunakanlah
asam atau basa dengan konsentrasi lebih tinggi.
d. Satukan kembali Imediunn tersebut ke dalam wadah semula.
Ambilah lagi 10
ml medium untuk memeriksa kembali pH nya. Berdasarkan dari pH
yang
dikehendaki.
Dengan menggunakan pipet, tempatkanlah medium tersebut ke dalam
9 bua
tabung reaksi, 8 tabung diisi masing-masing 12 ml (untuk agar
cawan)
sedangkan 1 tabung diisi 4 ml (untuk agar miring). Medium untuk
penyiapan
agar cawan dapat juga disterilkan dalam labu erlenmeyer.
sedangkan
penempatan medium ke dalam tabung dapat menggunakan salah satu
dari alat
berikut : buretpembagi, pipet otomatis, gelas ukur, pipet
serologis atau corong.
Tabung tidak boleh diisi lebih dari setengahnya sedangkan labu
tidak boleh diisi
lebih dari sepertiganya agar tidak meluap ketika
disterilkan.
Sumbatlah tabung-tabung tersebut dengan kapas.
Sterilkan media tersebut dalam sterilisator uap pada 1210C
selama 15 menit.
24
-
2. Penuangan Agar Cawan dan Pembuatan Agar Miring.
Setelah dikeluarkan dari steriisator, letakkan kedelapan tabung
tersebut ke
dalam penangas air bersuhu 500C dan biarkan selama 5 menit.
Sambil menunggu, ambilah tabung yang berisi 4 ml medium,
letakkan pada
papan miring, biarkan menjadi dingin dan padat.
Sementara itu ambilah tabung medium yang berisi 12 ml medium
yang suhunya
telah terekuilibrasi, dan tuangkanlah satu per satu ke dalam
cawan petri steril
secara aseptik. Usahakan agar seluruh permukaan cawan petri
tertutup oleh
medium.
Biarkan medium tersebut menjadi dingin dan padat. Setelah itu
pada permukaan
luar dasar cawan tuliskan dengan pinsil lilin atau spidol nama,
tanggal dan
singkatan nama medium (dalan hal ini NA). Setiap 10 cawan lalu
ditumpuk dan
dimasukkan dalam kantung plastik kertas dan disimpan dalam
lemari es sampai
diperlukan.
Lakukan hal yang sama seperti no.4 untuk agar miring, tempatkan
pada
keranjang tabung.
10.2. Sterilisasi Bahan dan Peralatan
Tujuan
Untuk memahami berbagai macam prosedur sterilisasi.
Teori Singkat
Yang dimaksud sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu proses
untuk
mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu
benda. Ada tiga
cara sterilisas yang umum dipakai yaitu :
1. Sterilisas menggunakan panas (yang umum digunakan di
Laboratorium
Mikrobiologi) Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air
disebut
sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa
kelembaban disebut
sterilisasi panas kering (sterilisasi kering).
2. Sterilisasi menggunakan bahan kimia dapat dilakukan dengan
menggunakan
gas atau radiasi.
3. Sterilisasi dengan cara penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf (presure
cooker) atau
sterilisasi uap yang mudah diangkat (portable) dengan
menggunakan uap air jenuh
bertekanan pada suhu 1210C selama 15 menit. Dapat pula dipakai
kombinasi suhu dan
waktu lain yang memberikan hasil sama.
Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa
saja yang dapat
ditembus uap air karena uap air berkondensasi pada bahan-bahan
yang disterilkan,
dilepaskan panas sebanyak 686 kalori per gram uap air pada suhu
1210C dan panas ini
mendenatutasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme
hidup maka dengan
demikian mematikannya, 25
-
Contoh: mensterilkan media biakan yang umum, air suling,
peralatan laboratorium,
biakan yang akan dibuang, media tercemar, bahan-bahan dari karet
dan mensterilkan
barang-barang di rumah sakit seperti ramuan susu, sprei, dan
berbagai macam
peralatan. Namun beberapa macam media seperti kaldu-kaldu
fermentasi tertentu,
gelatin nutrienr dan susu litmus harus menggunakan suhu yang
lebih rendah dan
tekanan yang lebih rendah pula karena bahan-bahan semacam ini
akan rusak bila
dipanaskan sampai 1210C,
Syarat-syarat melakukan sterilisasi uap:
1. Udara harus dikosongkan betul-betul dari ruang
sterilisaior.
2. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkenai uap.
3. Bahan-bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus
permiabel terhadap
uap.
4. Suhu sebagaimana yang teruku oleh termometer harus mencapai
1210C dan
dipertahankan setingi itu selama 15 menit.
Sterilisasi panas kering adalah sterilisasi yang dilakukan pada
apa saja yang
tidak rusak, menyala, hangus, atau menguap pada suhu selama
sekurang-kurangnya 10
menit. Contohnya mensterilkan alat-alat pecah belah (pipet,
tabung reaksi, jarum suntik
dan bahan-bahan yang tidak tembus uap seperti gliserin, minyak,
vaselin dan bahan-
bahan berupa bubuk. Bahan-bahan yang disterilkan harus
dilindungi dengan cara
dibungkus, menyumbat dan menaruhnya dalam suatu wadah tertutup
untuk mencegah
kontaminasi setelah dikeluakan dari oven. Pipet misalnya
disterilkan dalam bumbung
pipet.
Bahan-bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu
tinggi, dapat
disterilkan pada suhu kamar secara kimiawi (menggunakan gas atau
radiasi) misalnya
mensterilkanbahan-bahan dari plastic dan dengan menyaring
misalnya larutan atau
suspensi (serum, larutan bikarbonat, enzim, toksin bakteri media
sintetik terdentu dan
antibiotika). Sterilisasi kimiawi dilakukan pada suhu kamar
selama 2 sampai 18 jam.
Beberapa baban kimia yang dapat digunaka untuk sterilisasi gas
ialah etilen okside,
asam parasetat, formaldehide, dan glutaraldehide alkalin.
Sterilisasi dengan radiasi dapat diakukan dengan sinar
gamma.
Alat dan Bahan
bahan dan peralatan yang akan disterilkan
sterilisator uap portable
Prosedur Kerja
1. Tuangkan air suling secukupnya ke dalam tubuh sterilisator
(jumlah tertera pada
buku alat yang bersangkutan).
2. Tatalah labu atau tabung-tabung berisi media di dalam wadah
aluminium bagian
dalam sedemikian sehingga tersedia ruangan untuk bergeraknya uap
air secara
bebas diantara labu-labu atau tabung-tabung selama sterilisas,
kemudian
letakkan dalam sterilisator. 26
-
3. Letkkn tutup sterilisator pada tubuh sterilisator dengan cara
mempertemukan
tanda-tanda panah penunjuk dan memasukkan tabung pengeluaran gas
ke dalam
saluran pengarah pada dinding bagian dalam wadah aluminium dan
kencangkan
murnya.
4. Buklah pengatur klep pengaman, kemudian pasanglah
pemanasnya.
5. Bila uap air mulai keluar dengan keras (mendidih) tutuplah
klep pengaman.
Maka tekanan di dalam sterilisator pun akan naik dan dapat
dibaca pada alat
pengukur tekarnan.
6. Sterilkan media yang akan digunakaa dengan cara tekanan 1 atm
selama 15-20
menit. Untuk media seperti susu litmus, kaldu fermentasi dan
gelatin nutrien
diperlukan suhu lebih rendah 1000C-1150C pada tekanan 0,5-0.7
atm selama 15-
20 menit.
7. Pada akhir proses matikanlah pemanasan, dan tungguah sampai
tekanan
kembali nol.
8. Bila alat tolok tekanan telah menunjuk pada angka nol dan
suhu telah turun
sampai jauh di bawah 1000C, bukalah pengatur klep pengaman
dengan cara
meluruskanmra untuk mengeluarkan sisa uap yang tertinggal di
dalam.
Kendurkan mur lepaskan baut-bautnya, pytar tutupnya dan
angkatlah.
9. Bila anda selesai menggunakan alat sterilisator, buanglah
sisa air didalamnya
dan keringkan semua bagiannya.
Perhatian : Pada waktu mencuci tutupnya, jagalah agar alat
tekanan tidak
tercelup air. Jangan sekali-kali menuangkan air yang dingin
sekali koe dalam
sterilisator yang masih panas.
10.3. Teknik Pemindahan Biakan Mikroba Secara Aseptik
Tujuan
Menguasai teknik pemindahan bakteri dari satu wadah ke wadah
yang lain secara
aseptik.
Teori Singkat
Mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki dapat masuk ke dalam
biakan
murni melalui kontak langsung dengan permukaan atau tangan anda
yang tercemar,
tersentuhnya media atau permukaan tabung bagian dalam oleh benda
yang belum
disterilkan ataupun melalui aliran udara. Dengan teknik aseptik
dapat mencegah
tercemarnya biakan murni sekaligus akan dapat pula melindungi
anda dari infeksi diri
dan melindungi orang-orang di sekeliling anda dari pencemaran di
laboratorium.
Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies
tunggal. Maka
dengan. melakukan teknik aseptik secara baik maka yang akan
tumbuh dalam biakan
hasil pemindahan hanyalah organisme yang diinginkan (yang
dipindahkan). dengan
perkataan lain tidak tercemar.
27
-
Alat dan Bahan
rak tabung
2 tabung reaksi kosong bersumbat
1 agar miring nutrient agar (NA)
3 tabung nutrient broth (NB)
biakan agar miring Serratia marcescens
lup inokulasi
Presedur Kerja
1. Siapkan lup inokulasi.
2. Peganglah kedua tabung nutrien broth (NB steril di tangan
kiri anda) Tandaiah
tabung-tabung ini NB1 dan NB2.
3. Pijarkan lup Inokulasi di atas bunsen sampai seluruh kawatnya
pijar.
Gerakkanah dengan ceaat lup tersebut ke arah bawah di atas api
sehingga
sebagian dari tangkainya tersebut yang berbatasan dengan jarum
ikut terpanasi.
Biasakanlah untuk mumulai memanaskan ujung lup di dalam kerucut
api
sebelah dalam yang berwarna lebih biru (lebih dingin daripada
kerucut api
sebelah luar yang berwarna lebih muda) selama 1-2 detik pertama
untuk
mencegah terjadinya "percikan". Biarkan lup mendingin selama
lebih kurang
30 detik sebelum dipakai, untuk mencegah matinya bakteri yang
akan
dipindahkan ataupun terjadinya percikan.
4. Angkatlah sumbat kedua tabung satu demi satu. Mulailah dengan
Sumbat
tabung yang terdekat dengan tangan kanan Anda (dalam hal ini
tabung 2)
dengan melingkarkan jari kelingking tanpa membasahi sumbat
tabung.
5. Angkatlah sumbat tabung yang lain (tabung l) dengan cara
serupa namun
Dengan jari manis.
6. Panaskan mulut kedua tabung yang tidak tersumbat tersebut
dengan cara
melalukannya bolak balik dua kali di atas api. Jagalah agar
sudut kemiringan
tabung tidak melebihi 450 bila tidak tersumbat.
7. Inokulasikan sejumlah kecil bakteri dari tabung 2 ke dalam
tabung 1.
8. Panaskan kembali mulut kedua tabung tersebut seperti cara
ke-6.
9. Kembalikan sumbat tabung satu persatu dimulai dengan tabung
yang terdekat
dengan tangan kanan Anda (yaitu tabung 2).
10. Pijarkan kembali lup untuk mematikan sisa bakteri yang masih
melekat
padanya.
11. Ulangi pemindahan aseptik ini untuk memindahkan sejumlah
kecil bakteri S.
Marcescens (dari biakan agar miring yang disediakan) ke dalam
tabung
berisikan kaldu nutrien steril. Tandailah tabung ini NB3.
12. Ulangi pemindahan aseptik untuk memindahkan sejumlah kecil
bakteri S.
Marcescens ke dalam tabung berisikan agar miring NA steril.
Cara
menglsolasikan agar miring, dimulai dengan meletakkan lup yang
mengandung
biakan pada dasar kemiringan agar lalu ditarik ke atas dengran
gerakan zig-zag.
28
-
13. Kembalikanlah semua tabung dan lup inokulasi ke rak
tabung.
14. Berilah etiket pada semua tabung Anda yang batru saja
diinokulasikan (lihat
contoh) dan letakkanlah tabung-tabuag tersebut di tempat-tempat
yang telah
disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48 jam.
Contoh penulisan etiket :
15. Bila Anda melakukan teknik pemindahan tersebut dengan baik
maka tabung
tabung akan tampak keruh sedangkan NBI dan NB2 harus tetap
jernih, pada
agar miring NA akan tampak koloni berwarna merah dan seragam
tidak
tercemar oleh koloni lain. Tunjukkanlah hasi anda pada asisten
yang bertugas
untuk dinilai.
10.4. Isolasi Bakteri Dari Suatu Campran
Tujuan
Mempelajari cara-cara nengisolasi bakteri dari suatu campuran
dengan teknik cawan
gores dan cawan tuang.
Teori Singkat
Di alam amat jarang dijumpai mikroba sebagai satu spesies
tunggal umumnya terdapat
dalam populasi campuran. Sedangkan semua metode mikrobioogis
yang digunakan
unuk nenelaah atau mengidentifikasi mikroorganisme, temasuk
penelaahan ciri-ciri
kultural, morfologis, fisiologs, maupun serologis, memerlukan
suatu populasi yang
terdiri dari satu macam mikroorganisme saja atau disebut biakan
murni (yaitu biakan
yang sel-selnya berasal dari pembelahan salu sel tunggal).
Ada beberapa metode unluk memperoleh biakan murni dari suatu
biakan
campuran. Metode yang paling umum digunakan adalah teknik cawan
gores dan cawan
tuang. Kedua metode ini menggunakan prinsip yang sama yaitu
mengencerkan
mikrooganisme sedemikian sehinga individu spesies dapat
dipisahkan dari lainnya,
dengan anggapan bahwa setiap koloni terpisah yang tampak pada
cawan petri setelah
inkubasi berasal dari satu sel tunggal.
Dalam kegiatan ini, Anda akan memisahkan tiga spesies bakteri
yang berlainan
dari suatu tabung berisi biakan campuran. Perbedaan utama antara
ketiga spesies
tersebut ialah wama koloninya: Serratia marcescens, berwarna
merah, Micrococcus
luteus berwarna kuning, dan Escherichia coli berwarna putih.
29
300c IVAN 6/5/96
Serratia marcescens
Aseptis Kegiatan3 NA
-
Metode Cawan Gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu: menghemat bahan dan
waktu.
Dua macam kesalahan yang umum dilakukan oleh mahasiswa yang
baru
mempelajari mikrobiologi ialah: (1) tidak memanfaatkan permukaan
medium dengan
sebaik-baiknya untuk digores sehingg pengenceran mikroorganisme
menjadi kurang
lanjut, (2) cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak
sehingga
menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan. Bila anda
menggunakan teknik
menggores yang baik maka pada suatu arena tertentu pada
permukaan medium yang
digores, sel-sel bakkeri akan terpisahkan satu dari yang
lainnya. Se-sel tunggal yang
terpisahkan seperti ini disebut sel induk. Pada waktu inkubasi
setiap sel induk berbagi
diri dengan membelah biner (reproduksi aseksual) dalam waktu
20-30 menit menjadi
dua sel anak, pada 20-30 menit berikutnya setiap sel anak
membagi diri lagi sehingga
kini terdapat 4 sel anak. Sel-sel baru itu terus berbagi diri
dalam eksponensial menjadi
bermilyar-milyar sel anak yang saling bertumpukan di atas dan
disampingnya
membentuk satu koloni. Bila setelah masa inkubnsi koloni-koloni
tersebut saling
terpisahkan cukup jauh sehingga tidak bersentuhan,maka diperoleh
koloni murni. Satu
koloni murni terdiri dari bermilyar-milyar koloni anak, karena
kebanyakan bakteri
setelah masa inkubasi selama 24 jam, satu koloni dapat terdiri
dari 50-72 generasi sel
yang timbul dari satu se iduk tunggal. Dengan demikian dikatakan
bahwa pertumbuhan
bakteri sesungguhnya merupakan pertumbuhan jumlah sel dan bukan
ukuran sel. Pada
metode cawan gores ini, ada beberapa cara menggoreskan inokulum
pada permukaan
medium agar, dalam kegiatan ini akan menggunakan
metode penggoresan kuadran.
Alat dan Bahan
1 suspensi Serratia marcescens, Escherichia coli, dan
Micrococcus luteus.
2 cawan nutrienn agar (NA, agar nutrien)
lup inokulasi
jarum pindah
3 agar miring NA
Prosedur Kerja
1. Tuliskan nama anda, nomor kegiatan, dan tanggal pada tutup
cawan petri Anda.
2. Baliklah cawan petri Anda dan dengan menggunakan pinsil lilin
atau spido,
bagilah seluruh area cawan menjadi empat yaitu sektor 0 (lebih
kecil daripada
sector-sektor lainnya)adalah tempat anda mula-mula meletakkan
inokulum
dengan lup inokulasi, sector I adalah tempat meletakan inokulum
pengenceran
pertama, sektor II merupakan usaha pengenceren kedua. dan sektor
III
merupakan usaha pengencean terakhir.
3. Goreskanlah biakan campuran yang disediakan pada cawan petri
Anda sebagai
berikut :
Letakkan cawan petri Anda di meja dengan tutupnya terletak di
sebelah atas
30
-
dan sektor 0 di sebelah kiri anda (ubah posisi ini 1800 bila
Anda kidal)
Kocoklah tabung berisi biakan campuran dengan gerakan ke samping
(bakteri
cenderung mengendap di dasar tabung bila dibiarkan agak lama)
sehingga
suspensi tampak rata). Jagalah agar sumbatnya tidak
terbasahi.
Dengan menggunakan lup inokulasi, pindahkan secara aseptic satu
lup penuh
biakan campuran bakteri pada sector 0 dan goreskanlah lup anda
tanpa
ditekan bolak balik beberapakali di area permukaan agar.
Lingkungan
pada ujung lup anda harus terletak datar dan horizontal mungkin
terhadap
permukaan agar. Bila biakan campuran tersedia dalam media agar
padat,
jagalah agar jumlah inoculum yang anda pindahkan tidak terlalu
banyak
cukup menyentuh lup anda saja pada biakan yang akan digores.
Pijarkan lup anda dan biarkan mendingin. Suhu lup dapat
diperiksa dengan
cara menyentuhkan pada bagian permukaan agar bagian tepi yang
belum
diinokulasi. Bila mendesis artinya lup tersebut masih panas.
Pemijaran
lup mematiakn sel-sel yang tersisa padanya dan dengan
demikian
membantu pengenceran jumlah sel.
Goreskan lup Anda ke sektor 0 disusul gerakan ke tpi luar sektor
I, lalu
kembali ke sektor 0 dan seterusnya, bolak-balik sebanyak 2-3
kali. Kemudian
selesaikan penggoresan tersebut di sektor I tanpa menyentuh lagi
sektor 0
sampai sektor I penuh terisi goresan yang tidak bertumpang
tindih.
Putarlah cawan petri sehingga sektor I terletak di sebelah kiri
Anda.
Ulangi langkah 3e untuk mengencerkan biakan dari sektor I ke
sektor II.
Putarlah cawan petri Anda sehingga sektor II terletak di sebelah
kiri Anda.
Ulangi langkah 3e untuk mengencerkan biakan dari sektor II ke
sektor III.
Perhatian : jangan lupa memijarkan kembali lup Anda setiap kali
Anda berpindah
sektor.
Lakukan penggoresan yang sama (langkah 3a-3i) dengan menggunakan
biakan
campuran yang sama pada cawan petri kedua.
Letakkan cawan-cawan petri Anda dalam posisi terbalik daam
keranjang yang
telah disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48
jam.
Metode Cawan Tuang
Adalah cara untuk memperoleh koloni murni dari populasi koloni
campuran
mikroorganisme dengan pengenceran specimen dalam medium agar
yang telah
dicairkan dan didinginkan (500) yang kemudian dicawankan. Karena
konsentrasi sel-
sel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak diketahui
sebelumnya, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehinggra
sekurag-kurangnya satu di
antara cawan-cawan tersebut mengandung koloni-koloni terpisah di
atas permukaan
ataupun di dalam agar.
Metode ini memboroskan bahan dan waktu tetapi tidak memerlukan
ketrampilan
yang terlampau tinggi.
31
-
Alat dan Bahan
Suspense campuran Serratia mercescens, Escherichia coli, dan
Micrococcus
luteus.
3 cawan petri steril
3 tabung nutrien agar yang suhunya telah diinkubasikan dalam
penangas air
bersuhu 500C
Lup inokulasi
Prosedur Kerja
1. Tuliskan nama anda, kelompok praktikum, nomor kegiatan dan
tanggsl pada
permukaan luar dasar cawan petri Anda.
2. Beri cawan-cawan petri tersebut nomor 1, 2 dan 3
3. Ambillah 3 tabung agar nutria dari penangas air, keringkan
bagian luar dengan
kain penyeka, berilah nomor 1, 2 dan 3, lalu letakan dalam rak
tabung.
4. Kocoklah tabung berisi suspensi biakan campuran dengan
gerakan kesamping
sehingga kekeruhannya tampak rata. Hati-hati jangan sampai
sumbatnya
terbasahi.
5. Pijarkan lup inokulasi dan dengan menggunakan teknik aseptik
pindahkan dua
lup penuh suspensi biakan campuran ke dalam tabung NA no. l.
Campurkan
inokulum tersebut sampai dengan cara metmutarkan tabung tersebut
di antara
ke dua telapak tangan (jangan dikocok untuk menghindari
timbulnya
gelembnng-gelembung udara).
6. Dengan cara yang sama pindahkan dua lup penuh biakan dari
tabung no. I ke
dalam tabung no 2. Campurkan pula hingga rata seperti pada
langkah 5.
7. Dengan cara yang sama pindahkan dua lup penuh biakan dari
tabung no. 2 ke
dalam no. 3. Campurkan pula hingga rata seperti langkah 5.
8. Secata aseptik luangkan agar dari tabung yang bernomor I, 2,
dan 3 masing-
masing ke dalam cawan-cawan petri yang bernomo l, 2, dan 3.
Biarkan agar
tersebut menjadi padat.
9. Letakkan cawan-cawan petri tersebut dalam posisi terbalik di
dalam kerenjang
yang telah disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama
48 jam.
10.5. Teknik Biakan Penyuburan
Tujuan
Mempelajari beberapa cara untuk menyediakan kondisi pembiakan
yang
memungkinkan diisolasinya suatu spesies tertentu yang
dikehendaki dari suatu
populasi campuran.
32
-
Teori Singkat
Untuk memperoleh spesies tertentu yang diminati dan jumlahnya
amat sedikit, sangat
sulit jika hanya menggunakan teknik-teknik rutin seperti metode
cawan gores atau
cawan tusng. Maka untuk itu dapat digunakan teknik penyuburan
untuk memperbesar
kemungkinan terisolasinya organisme tersebut. Teknik ini pada
hakekatnya suatu
lingkungan, yaitu komposisi medium atau kondisi fisik yang
bersifat seleklif terhadap
spesies yang dikehendaki. Dalam kegiatan ini Anda akan
mengisolasi dua jenis bakteri
yaitu bakteri koliform tinja dari air limbah dan khamir
fermentatif dari sari buah.
1. Koliform Tinja
Organisme ini sesungguhnya penghuni usus manusia dan hewan.
Bakteri Escherechia
Coli biasanya digunakan sebaaia indikator pencemaran persediaan
air oleh Tinja. Ada
dua macam medium yang sangat selektif untuk mengisolasi koliform
tinja yaitu :
(1) lauryl tryptose broth (LTB), betsifat selektif karena
menghambat pertumbuhan
bakteri Gram positif dan mendorong pertumbuhan bakteri Gram
negatif yang dapat
menggunakkan lactose. (2) mediun agar eosin methylene blue
(EMB), bersifat selektif
dan diferensial. Selektif terhadap orgenisme Gram negatif karena
zat warna yang
terkandung di dalamnya melancarkan efek bakteriostatik terhadap
bakteri Gram positif.
Dan diferensial karena dapat membedakan antara bakteri peragi
laktose (yaitu bakteri
Gram negatif akan mengambil sebagian dari zat warna yang
terkandung di dalam
sehingga koloninya akan tampak ungu atau gelap di bagian
tengahnya dan tidak
berwarna dibagian tepinya) dan bakteri yang bukan peragi
lactose.
Koloni bakteri dari genus Escherichia dan Enterobakter
seringkali menampilkan warna
hijau logam sedangkan koloni organisme yang tidak dapat
menfermentasi laktose
tampak tidak berwarna.
Alat dan Bahan
contoh air selokan
pipet 1 ml
tabung Durham berisi lauryl tryptose broth (LTB)
cawan agar eosin methylene blue (EMB)
lup inokulasi
kaca obyek dan kaca tutup
vaselin
seperangkat pewarna Gram
kertas serap
mikroskop majemuk, minyak celup dan kertas lensa
Prosedur Kerja
1. Inokulasikan 0,5 ml air selokan ke dalam tabung Durham berisi
LTB.
Inkubasikan pada suhu 440C selama 24-48 jam.
2. Bila terlihat adanya pembentukan gas, kocoklah balak-balik
biakan tersebut dan
secara aseptic goreskanlah satu lup penuh biakan pada cawan agar
EMB
33
-
dengan menggunakan metode kuadran. Inkubasikan cawan tersebut
dalam
posisi terbalik pada suhu 370C selama 48 jam.
3. Amatilah cawan Anda dan pilihlah sebuah koloni yang terpisah
baik vang
menampakkan kilauan logam pada permukaannya, Lakukanlah
pewarnaan
Gram terhadap olesan yang dibuat dari koloni tersebut.
Perhatian: lakukan langkah ini secara aseptik sehingga koloni
tersebut tidak
tercemar.
4. Bila preparat Gram Anda menunjukkan organisme Gram negatif
berbetuk
batang secara aseptik inokulasikan koloni yang sama pada cawan
tadi ke dalam
tabung Durham berisi medium LTB. Inkubasikan pada suhu 440C
selama 24-48
jam.
5. Bila pada tabung tersebut terlihat adanva pembentukan gas,
secara aseptic
goreskanlah satu lup penuh biakan tersebut pada cawan EMB.
Inkubasikan pada
posisi terbalik pada suhu 440C selama 48 jam.
6. Serahkanlah pada asisten Anda. biakan murni dalaim cawan EMB
dan preparat
Gram. Disamping itu tunjukkanlah pula preparat basah Anda di
bawah
mikroskop agar dapat diperiksa dan dinilai oleh asisten
Anda.
II. Khamir Fermentatif
Cendawan jenis ini paling banyak ditemukan pada buah-buahan dan
hasil
fermentasinya yang bersifat asam.
Alat dan Bahan
nenas untuk diambil sarinya
tabung reaksi
paraffin
lup inokulasi
kaca obyek beserta kaca tutup
vaselin
Cawan agar dekstrose yang telah diasamkan dengan 0,15% asam
tartarat
tabung Durham berisi nutrien broth (NB;kaldu nutrien) + 2%
dekstrose
seperangkat pewarna gram
kertas serap
mikroskop majemuk minyak celup dan kertas lensa.
Prosedur kerja
1. Hancurkan nenas, ambil sarinya sebanyak 10 ml, masukkan ke
dalam tabung
reaksi dan segel dengan parafin, lalu inkubasikan pada suhu
kamar selama
beberapa hari.
2. Bila terlihat adanya pembentukan gas dalam tabung tersebut,
ambillah sedikit
sampel dari dasar tbung untuk membuat lekapan basah dan amatilah
ada
tidaknya sel-sel khamir di bawah mikroskop.
34
-
3. Bila teramati adanya sel-sel khamir pada siapan basah Anda,
maka goreskanlah
satu lup penuh cairan sari buah tersebut (juga diambil dari
dasar tabung) dengan
metode kuadran pada cawan agar dekstrose yang telah diasamkan
dengan asam
tartarat. Inkubasikan cawan Anda dengatl posisi terbalik pada
suhu kamar
selama 48 jam.
4. Amatilah cawan Anda. Koloni khamir akan tampak bundar dengan
tepian licin
dan permukaan seperti berlendir. Pilihlah dua koloni semacam itu
yang terpisah
baik dan masing-masing inokulasikan pada tabung Durham berisi
kaldu nutrien
+ 2% Dekstrose. Inkubasikan pada suhu kamar selama 48 jam.
5. Amati tabung Durham Anda. Bila Anda melihat pembentukan gas,
buatlah lagi
siapan basah dan amati apakah Anda memiliki sel-sel yang tampak
seragam.
Bila demikian maka goreslah lagi satu cawan berisi medium baru
yang
menunjukkan bahwa koloni-koloni khamir Anda memang hanya terdiri
dari
satu macam (gunakan inokulum dari salah satu tabung Durham,
pilih yang
terbaik).
6. Serahkan pada asisten Anda. biakan murni dalam agar cawan,
biakan dalam
tabung Durham dan preparat Gram. Disamping itu tunjukkanlah pula
preparat
basah Anda di bawah mikroskop agar dapat diperiksa dan dinilai
oleh asisten
Anda.
35
-
HASIL PENGAMATAN
-
Kegiatan 11
Kuantitasi Mikroba : Hitungan Cawan
Tujuan
Melatih Anda melakukan pengenceran serial dan menentukan
konsentrasi suspensi
bakteri dengan metode hitungan cawan.
Teori Singkat
Dasar metode hitungan cawan dengan anggapan bahwa setiap sel
yang dapat
hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jadi jumlah koloni
yang muncul pada
cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat
hidup yang
terkandung daam sampel. Cawan yang dipilih untuk penghitungan
koloni adalah yang
mengandung antara 30-300 koloni. Untuk memperoleh
sekurng-kurangnya satu cawan
yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat maka
harus dilakukan
sederetan pengenceran dan pencawanan. Organisme yang terdapat
daam sampel asal
ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan
faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Dalam kegiatan ini Anda akan mencoba dua macam prosedur hitungan
cawan
yaitu :
1. metode penyebaran
2. metode penuangan
Alat dan Bahan
biakan Escherichia coli dalam nutrien broth (NB,kaldu
nutrien)
botol blanko pengencer @ 99 ml
botol blanko pengencer @ 90 ml
pipet 1ml yang steril
pipet 0,1 ml yang steril
batang kaca penyebar
alkohol 95% daam gelas piala
cawan nutrient agar (NA, agar nutrient)
tabung masing-masing berisi 12 ml NA cair bersuhu 500C
cawan petri kosong steril
alat penghitung koloni Quebec
penghitung mekanis
Prosedur Kerja
Metode Penyebaran
1. Siapkanlah pengenceran serial :
Siapkan keempat botol berisis blanko pengencer dan susunlah
berderet (botol
36
-
pertama,kedua, dan keempat masing-masing berisi 99 ml larutan
pengencer,
sedangkan botol ketiga berisi 90 ml larutan pengencer). Tuliskan
pada dinding-
dinding botol tersebut sesuai dengan urutannya, 1:100, 1:10.000,
1:100.000,
1:1.000.000
Catatan : blanko pengencer ialah tabung atau botol berisi
sejumlah tertentu
cairan pengencer steril (biasanya larutan garam fisiologis)
dengan
sumbat ulir atau sumbat karet yang rapat. Tabung biasanya berisi
9 atau 9,9 ml
sedangkan botol berisi 90 atau 99 ml.
Kocoklah suspensi bakteri E. coli baik-baik sampai kekeruhannya
rata. Lalu
secara aseptik pipetlah 1 ml sampel dan masukkan ke dalam blanko
pengencer
1:100. Letakkan pipet dalam wadah berisi disinfektan. Dengan
siku tangan anda
di atas meja, kocoklah tabung tersebut 25 kali, setiap kalinya
melintasi jarak
kurang lebih 30 cm, sehingga bakteri tersebar rata di dalam
larutan pengencer.
Setiap kali sebelum pengocokan periksalah terlebih dahulu apakah
sumbat telah
terpasang rapat.
Secara aseptik pipetlah 1ml sampel dari botol pengencer 1:100
dan masukkan
ke dalam blanko pengencer 1:10.000. Letakkan pipet dalam wadah
yang
disediakan dan kocoklah tabung pengenceran ini seperti di
atas.
Secara aseptik pipetlah 10 ml sampel dari tabung pengencer
1:10.000 dan ke
dalam blanko pengencer 1:100.000. Letakkan pipet dalam wadah
yang
disediakan dan kocoklah tabung pengencer ini seperti di
atas.
Secara ascptik pipetlah 1 ml sampel dari tabung pengencer
1:10.000 dan
masukkan ke dalam blanko pengencer 1:1.000.000. Letakkn pipet
dalam
wadah yang disediakan dan kocoklah tabung pcngencer ini seperti
diatas.
2. Pada masing-masing permukaan luar dasar keempat cawan petri
berisikan agar
itu tuliskanlah l:200.000, 1:1.000.000, 1:2.000.000 dan
1:10.000.000.
3. Secara aseptik, lakukanlah pemindahan sampel dari botol
pengencer l:1.
000.000 ke dalam cawan-cawan agar nutrien sebagai berikut :
Dengan pipet 1 ml yang steril pindahkanlah 0,5 ml sampel ke
dalam cawan
berfuliskan 1:2.000.000.
Dengan pipet 1 ml yang steril, pindahkanlah 0,1 ml sampel ke
dalam cawan
Letakkan pipet dalam wadah yang disediakan.
4. Sterilkan batang kaca penyebar dengran cara mencelupkannya ke
dalam gelas
piala berisi alkohol 95%, lalu bakarlah di atas api. Setelah
alko