Mega Trinova Durika

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Rabu, 11 Maret 2015

Kelompok I

Rabu , Pukul 13.30 16.30 WIB

Nama NPM

MEGA TRINOVA DURIKA 260110130098

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Shintya) (Benedictus)

PEWARNAAN TAHAN ASAM

I. Tujuan

1. Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak

tahan asam dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (Ziehl-

Neelsen)

2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam

prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Penetrasi zat warna

Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme lainnya

adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal) yang

menyebabkan penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan tetapi, apabila

zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak mudah

dibuang meskipun dengan penggunaan asam alcohol yang kuat sebagai zat

pelarutnya.

2. Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih dari satu

pewarna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan

dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid kompleks

yang tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam.

3. Pemanasan

Pemanasan biasanya diperlukan untuk memperkuat penetrasi pewarna

dasar ke dalam sel bakteri.

4. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam

Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan

kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan,

bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri

tersebut disebut bakteri tahan asam.

III. Teori Dasar

Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri

yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel

yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang

ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA

antara lain Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis,

Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae.

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan

penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai

bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculosis terjadi

melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai

dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan

pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung

sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai

dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan

impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan

encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi

dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).

Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan

kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok

bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna

pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol

asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang

tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan

reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna

(Lay, 1994).

Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang

panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat

lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal

manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah,

egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel

adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 3 m. Pada media

buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke

spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak

dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan

iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-

Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan

media selektif. Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan

kontaminan bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang

dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar

semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi

(Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001).

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari

oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan

pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan

pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk

menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung

tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C, untuk

menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk cepat asam

daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap

agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan

pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan

hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat

terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang

optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).

IV. Alat dan Bahan

5.1. Alat

1. Botol semprot

2. Bak pewarna

3. Kaca preparat

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Korek

7. Mikroskop

8. Ose

9. Spirtus

5.2. Bahan

1. Air suling

2. Alkohol 70%

3. Asam alcohol (3% HCl dalam alcohol 95%)

4. Emerge oil

5. Suspensi bakteri (Tuberculosis)

6. Zat warna karbol fuksin

7. Zat warna biru metilen

V. Prosedur

Pertama-tama, menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Kaca

preparat direndam didalam larutan alcohol 70% dan kaca preparat dikeringkan

dengan menggunakan kapas. Kemudian pada salah satu sisi kaca preparat

dibuat lingkaran menggunakan spidol. Lalu nyalakan spirtus dengan korek api

dan ose di fiksasi diatas api hingga kawat ose berubah menjadi merah.

Kemudian ose didinginkan di dekat api. Setelah itu, tabung reaksi yang berisi

campuran suspensi bakteri (Tuberculosis) dibuka didekat api dan suspensi

bakteri diambil dengan menggunakan ose. Kemudian penutup tabung dan

mulut tabung difiksasi dan tabung ditutup kembali. Lalu olesan bakteri di

oleskan secara merata diatas kaca preparat, ose dan kaca preparat difiksasi.

Setelah itu, kaca preparat diletakkan diatas bak warna. Olesan bakteri

digenangi dengan pewarna karbol fuksin selama 5 menit, sambil dipanaskan di

atas penangas air. Jaga jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering..

Lalu zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas degan air suling. Kemudian

bilas dengan zat pewarna alcohol-asam selama 15 detik atau sampai belakang

olesan berwarna merah muda pucat. Setelah itu, olesan bakteri digenangi

dengan pewarna tanding biru metilen selama 2 menit. Lalu zat warna berlebih

dibuang dan olesan dicuci dengan air suling ,kemudian dikeringkan

menggunakan kertas saring. Lalu ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada

kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri diamati dibawah mikroskop.

VI. Data Pengamatan

Pewarna : karbol fuksin, metilen blue

Preparat : Suspensi bakteri Mycobacterium tuberculosis

Perbesaran : 10 x 100 kali

Identifikasi bakteri :

SAMPEL LITERATUR

Bentuk dan warna bakteri tidak

terlihat jelas

(http://textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html)

Bentuk Bakteri teramati,yaitu batang

Warna bakter teramati yaitu merah

VII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini praktikan melakukan praktikum pewarnaan

tahan asam. Tujuan dari praktikum ini adalah dapat mengamati dua kelompok

bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam dengan

menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (Ziehl-Neelsen) dan dapat

memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur

tersebut. Adapun prinsip yang mendasari praktikum ini yaitu penetrasi zat

warna, pewarnaan tahan asam, pemanasan, dan impermeabilitas dinding sel

bakteri.

Pada praktikum ini, hal pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan alat

dan bahan yang akan digunakan. Selanjutnya kaca preparat direndam didalam

larutan alkohol 70%, perendaman kaca preparat ini bertujuan agar kaca

preparat bebas dari mikroorganisme dan lemak yang menempel pada kaca

preparat. Setelah itu kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kapas

sampai berbunyi yang menandakan bahwa kaca preparat sudah bisa digunakan.

Lalu pada salah satu sisi kaca preparat dibuat lingkaran menggunakan spidol,

lingkaran ini dibuat untuk media pengamatan materi supaya pada saat

mengamati dibawah mikroskop akan lebih mudah.

Selanjutnya, spirtus dinyalakan menggunakan korek api, spirtus

berguna untuk fiksasi. Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau

penempelan suatu struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Hal yang

harus diperhatikan dalam proses fiksasi adalah kita hanya melewatkan objek

diatas api bukan membiarkan dia terbakar karena akan mengakibatkan

bakterinya mati dan tujuan fiksasi untuk pelekatan bakteri supaya pada saat

pencucian bakteri tidak hilang tercuci dan bakteri tidak berubah bentuk pada

saat diamati pada mikroskop. Kemudian ose difiksasi dengan melewatkannya

diatas api sampai berubah menjadi merah yang menandakan bahwa ose sudah

bebas dari kontaminasi. Ose adalah alat yang digunakan untuk memindahkan

atau mengambil koloni suatu mikroba ke media yang akan digunakan kembali.

Lalu ose didinginkan didekat api, ose yang digunakan harus dingin karena

apabila ose masih panas maka akan mengakibatkan sel bakteri yang akan diuji

mati.

Selanjutnya tabung reaksi yang berisi campuran suspensi bakteri (

Tuberculosis) dikocok dan dibuka dekat api untuk mengurangi kontaminasi.

Pengocokan ini bertujuan agar suspensi bakteri tercampur secara merata tidak

ada endapan bakteri di bagian bawah tabung. Lalu sampel diambil

menggunakan ose, ose dan tabung difiksasi. Kemudian oleskan bakteri diatas

kaca preparat secara merata. Setelah rata, kaca preparat diletakkan diatas bak

pewarna. Olesan bakteri digenangi dengan pewarna karbol fuksin dan

dibiarkan selama 5 menit, sambil dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan

sampai terlalu panas, mandidih atau kering. Tujuan pemberian carbol fuchsin

0,3% adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Biar sulit menembus dinding

dari bakteri tahan asam dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel

bakteri tersebut sehingga warna carbol fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel

bakteri. Namun perlu diperhatikan, pemanasan dilalukan jangan sampai

mendidih cukup samapai menguap agar sel-sel bakteri tersebut tidak rusak.

Lalu,zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling. Kemudian

dibilas dengan zat pemucat alcohol-asam selama 15 detik atau sampai latar

belakang olesan berwarna merah muda pucat. Penambahan alkohol berfungsi

untuk membilas atau melunturkan zat warna (decolorization) pada sel bakteri

(mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah mampu menyerap warna carbol

fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali tertutup dalam pada suhu

semula. Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu

samapai 5 menit. Saat penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang bukan

BTA akan dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak

mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA.

Setelah itu, olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandingan biru

metilen selama 2 menit. Methylene Blue merupakan pewarna tandingan atau

pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah

kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam alkohol. Zat warna

methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang permeabilitas

dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA

terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA

tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah

terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes

dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak

dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Lalu zat warna

berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling.

Setelah itu kaca preparat ditetesi dengan minyak imersi. Minyak emersi

adalah minyak yang dipakai untuk olesan pada mikroskop yang fungsinya

untuk memperjelas objek dan melindungi mikroskop itu sendiri atau

Imersi minyak merupakan teknik yang digunakan pada saat kita akan

mengamati preparat mikroskopik dengan perbesaran yang besar (10x100

misalnya). Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan

dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas

menggunakan minyak imersi dibandingkan menggunakan air.

Selanjutnya kaca preparat diamati di bawah mikroskop dan hasilnya

digambar. Pada pengamatan yang dilakukan dari dari suspense bakteri

(Tuberculosis) didapatkan bentuk bakteri yaitu bentuk bakteri basil tahan asam.

Hasil Pengamatan pada praktikum kali ini sel bakterinya sulit untuk

diamati dan berbeda dengan hasil literature. Pada praktikum kali ini,,bentuk sel

bakteri Mycobacterium tubercolosis tidak terlihat batang dan warnanya juga

tidak merah sebagaimana literature.

Hal ini mungkin dapat disebabkan oleh :

1. Olesan bakteri tidak rata dan terlalu tipis sehingga sulit untuk diamati pada

mikroskop/ hasil pengamatan tidak jelas .

2. Proses penotolan dengan kertas saring yang tidak benar dan terlalu keras

sehingga bakteri sampel malah menempel pada kertas saring.

3. Fiksasi yang terlalu lama dapat menyebabkan dinding bakteri pecah

sehingga sulit untuk diamati.

4. Zat warna tidak merata masuk ke dalam dinding bakteri / proses

pewarnaan yang kurang lama.

5. Pada saat pengolesan bakteri dengan ose,ose yang digunakan masih panas

sehingga dinding bakteri pecah dan bentuknya tidak dapat diamati.

6. Pembilasan dengan air suling yang terlalu keras menyebabkan olesan

bakteri terbawa oleh air.

VIII. Simpulan

1. Dapat mengamati dua jenis bakteri yaitu bakteri tahan asam dan bakteri

tidak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam

pada bakteri tahan asam akan mempertahankan warna merah sedangkan

bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.

2. Praktikan dapat memahami cara pewarnaan bakteri tahan asam

DAFTAR PUSTAKA

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons, New

Fardiaz, S., 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Jawetz, E., Joseph Melnick&Edward Aldeberg.1996. Mikrobiologi Kedokteran,

diterjemahkan oleh Edi Nugroho dan R. F Maulany.Jakarta: Penerbit Buku

kedokteran EGC.

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo

Persada.

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi.

Jakarta: UI Press.

.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SPORA

Rabu, 11 Maret 2015

Kelompok I

Rabu , Pukul 13.30 16.30 WIB

Nama NPM

MEGA TRINOVA DURIKA 260110130098

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Shintya) (Benedictus)

PEWARNAAN SPORA

I. Tujuan

1. Mengamati endospore bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan

spora (pewarnaan Klein).

2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam

prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Pewarnaan spora

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit

green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna

hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada

Bacillus subtilis.

2. Teknik aseptis

Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi

bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptis digunakan sepanjang

percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan maupun praktikan.

3. Impermeabilitas spora

Baktreri dalam bentuk spora lebih tahan terhadap disinfektan, sinar,

kekeringan, panas, dan kedinginan. Hal ini karena dinding spora lebih

bersifat impermeable dan spora mengandung sangat sedikit air, sehingga

menyebabkabspora tidak mudah mengalami perubahan temperatur.

4. Penetrasi zat warna

Tebal tipisnya sediaan. Bila sediaan terlalu tebal atau tidak rata, maka

penetrasi zat warna akan berbeda-beda.

III. Teori Dasar

Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri

mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk

spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua

mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar

yang tidak menguntungkan.(Dwidjoseputro, 2005)

Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genus bacillus dan

costridium. Pada umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan

ukuran yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada kondisi secara

kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi,

sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat

spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner.

Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak

spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel),

terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal ( letak spora diantara

ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) ( Dwidjoseputro, 2005).

Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-

tahun bahkan berabad-abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal.

Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora tetap

hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1

jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap

menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora

akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara

normal (Volk & Wheeler, 1988).

Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat

apusan preparat.Kemudian preparat diberikan malakit hujau yang berfungsi

sebagai pewarna primer yangdigunakan untuk melumuri fiksasi panas. Preparat

diuapkan diatas air mendidih dengan tujuanuntuk memperbesar pori-pori

bakteri agar pada saat pewarnaan dapat menembus dindingendospora dan

dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air dialirkan

dariatas, yang bertujuanuntuk menghilangkan malacite green dari seluruh

bagian sel endospora.Pewarnaan safranin bertujuan untuk counterstein yang

digunakan untuk melumuri bagian warnadari sel yang lain dari pada endospora.

Hasil uji bakteri Bacillus subtilis menghasilkan bakteri gram positif. Prinsip

pewarnaan spora didasarkan pada penggunaan zat wa rna malachite green dan

safranin dimana pada hasil pewarnaan akan menghasilkan warna hijau pada

spora dan warna merah pada sel vegatitifnya (Lay 1994).

Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding

tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies

Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk

endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel

vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi

sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan

untuk menjadi spora. (Pelczar,1986).

IV. Alat dan Bahan

5.3.Alat

10. Botol semprot

11. Bak pewarna

12. Kaca preparat

13. Kapas

14. Kertas saring

15. Korek

16. Mikroskop

17. Ose

18. Spirtus

5.4. Bahan

8. Air suling

9. Alkohol 70%

10. Biakan padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam

11. 24 1%

12. NaCl fisiologis

13. Zat warna karbol fuksin

14. Zat warna biru metilen

V. Prosedur

Pertama-tama, menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Buat

suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung

reaksi dan tambahkan karbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi tersebut.

Lalu panaskan campuran tersebut dalam pemanas air bersuhu 800 selama 10

menit, jaga jangan sampai mendidih atau kering. Kemudian sediaankan kaca

preparat dan direndam didalam larutan alkohol 70% dan kaca preparat

dikeringkan dengan menggunakan kapas. Kemudian pada salah satu sisi kaca

preparat dibuat lingkaran menggunakan spidol. Lalu nyalakan spirtus dengan

korek api dan ose di fiksasi diatas api hingga kawat ose berubah menjadi merah.

Kemudian ose didinginkan di dekat api. Setelah itu, tabung reaksi yang berisi

biakan padat bakteri Bacillus subtilis dibuka didekat api dan suspensi bakteri

diambil dengan menggunakan ose. Kemudian penutup tabung dan mulut

tabung difiksasi dan tabung ditutup kembali. Lalu olesan bakteri di oleskan

secara merata diatas kaca preparat, ose dan kaca preparat difiksasi. Setelah itu,

kaca preparat diletakkan diatas bak warna. Olesan bakteri digenangi dengan

24 1% Lalu zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas degan air suling.

Setelah itu, olesan bakteri digenangi dengan pewarna tanding biru metilen

selama 5 menit. Lalu zat warna berlebih dibuang dan olesan dicuci dengan air

suling ,kemudian dikeringkan menggunakan kertas saring. Lalu ditetesi dengan

sedikit minyak imersi pada kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri

diamati dibawah mikroskop.

VI. Data Pengamatan

Pewarna : karbol fuksin, metilen blue

Preparat : Suspensi bakteri Bacillus subtilis

Perbesaran : 10 x 100 kali

Identifikasi bakteri :

Bentuk bakteri : Batang

Warna Bakteri : Biru

Warna Spora : Merah

VII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini praktikan melakukan praktikum pewarnaan

spora. Tujuan dari praktikum ini adalah dapat mengamati endospora bakteri

dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora (pewarnaan Klein) dan dapat

memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur

tersebut. Adapun prinsip yang mendasari praktikum ini yaitu pewarnaan spora,

teknik aseptis, impermesbilitas spora dan penetrasi zat warna.

Pada praktikum ini, hal pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan alat

dan bahan yang akan digunakan. Selanjutnya buat suspensi bakteri yang terdiri

dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung reaksi. Fungi NaCl fisiologis

berfungsi sebagai pengencer agar suspensi sampel yang akan digunakan steril

dan menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl fisiologis

juga mempertahankan kondisi pH dari sampel suspensi. Larutan pengencer

NaCl Fisiologis steril merupakan larutan netral sehingga tidak mempengaruhi

kondisi pH.

Setelah itu tambahkan karbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi

tersebut. Lalu panaskan campuran tersebut dalam pemanas air bersuhu 800

selama 10 menit, jaga jangan sampai mendidih atau kering. Penambahan karbol

fuksin adalah sebagai pewarna untuk mewarnai bakteri dengan warna merah.

Hal ini bertujuan untuk memperbesar pori-pori bakteri agar zat warna dapat

menembus dinding endospora dan jaga jangan sampai mendidih atau kering

karena dinding bakteri akan hancur jika terlalu panas. Pemanasan pada suhu

800 bermaksud untuk membunuh sel vegetatif bakteri, sedangkan sel spora

tidak akan mati pada suhu 800, bahkan spora masih dapat hidup selama 1 jam

dalam air mendidih.

Selanjutnya membuat olesan bakteri yaitu dengan cara kaca preparat

direndam terlebih dahulu didalam larutan alcohol 70%, perendaman kaca

preparat ini bertujuan agar kaca preparat bebas dari mikroorganisme dan lemak

yang menempel pada kaca preparat. Setelah itu kaca preparat dikeringkan

dengan menggunakan kapas sampai berbunyi yang menandakan bahwa kaca

preparat sudah bisa digunakan. Lalu pada salah satu sisi kaca preparat dibuat

lingkaran menggunakan spidol, lingkaran ini dibuat untuk media pengamatan

materi supaya pada saat mengamati dibawah mikroskop akan lebih mudah.

Selanjutnya, spirtus dinyalakan menggunakan korek api, spirtus

berguna untuk fiksasi. Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau

penempelan suatu struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Hal yang

harus diperhatikan dalam proses fiksasi adalah kita hanya melewatkan objek

diatas api bukan membiarkan dia terbakar karena akan mengakibatkan

bakterinya mati dan tujuan fiksasi untuk pelekatan bakteri supaya pada saat

pencucian bakteri tidak hilang tercuci dan bakteri tidak berubah bentuk pada

saat diamati pada mikroskop. Kemudian ose difiksasi dengan melewatkannya

diatas api sampai berubah menjadi merah yang menandakan bahwa ose sudah

bebas dari kontaminasi. Lalu ose didinginkan didekat api, ose yang digunakan

harus dingin karena apabila ose masih panas maka akan mengakibatkan sel

bakteri yang akan diuji mati.

Selanjutnya tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri (Bacillus

subtilis) dikocok dan dibuka dekat api untuk mengurangi kontaminasi. Lalu

sampel diambil menggunakan ose, ose dan tabung difiksasi. Kemudian oleskan

bakteri diatas kaca preparat secara merata. Setelah rata, kaca preparat

diletakkan diatas bak pewarna. Olesan bakteri digenangi dengan 24 1%

selama 2 detik. Lalu,zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air

suling. Proses pencucian ini menyebabkan por-pori dinding spora yang semula

melebar,kembali mengecil. Tahapan ini lah yang mengakibatkan dekolorisasi

dengan asam-alkohol tidak akan melarutkan zat warna karbol fuksin pada

spora.

Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandingan biru

metilen selama 5 menit. Tujuan pemberian biru metilen adalah memberi warna

background (pewarna sekunder). Hal ini berfungsi untuk mewarnai kembali

sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam

alkohol. Lalu dibilas dengan air suling dan dikeringkan dengan kertas saring.

Penotolan dengan kertas saring harus hati-hati agar olesan bakteri tidak

terbawa / menempel pada kertas saring.

Setelah itu kaca preparat ditetesi dengan minyak imersi. Minyak emersi

adalah minyak yang dipakai untuk olesan pada mikroskop yang fungsinya

untuk memperjelas objek dan melindungi mikroskop itu sendiri atau

Imersi minyak merupakan teknik yang digunakan pada saat kita akan

mengamati preparat mikroskopik dengan perbesaran yang besar (10x100

misalnya). Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan

dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas

menggunakan minyak imersi dibandingkan menggunakan air.

Selanjutnya kaca preparat diamati di bawah mikroskop dan hasilnya

digambar. Pada pengamatan yang dilakukan dari sampel air liur didapatkan

bentuk bakteri yaitu bentuk bakteri basil tahan asam.

Pada saat praktikum, terjadi kesalahan yang mengakibatkan olesan

bakteri pada kaca preparat hilang dan menyebabkan praktikan susah

menemukan bentuk bakteri yang terdapat pada suspensi. Faktor-faktor yang

menyebabkan hal tersebut yaitu :

Olesan bakteri tidak merata

Biakan spora suspensi bakteri belum matang, seharusnya umur biakan

bakteri yang digunakan 72 jam. Tapi pada praktikum kali ini umur biakan

hanya 24 jam. Menyebabkan spora belum matang,sehingga karbol fuksin

tidak masuk secara sempurna dan sulit diamati

Fiksasi yang terlalu lama juga dapat menyebabkan dinding bakteri pecah

sehingga sulit untuk diamati

Pembilasan dengan air suling yang terlalu keras yang menyebabkan olesan

bakteri terbawa oleh air.

Proses penotolan dengan kertas saring yang tidak benar dan terlalu keras

yang mengakibatkan olesan bakteri menempel pada kertas saring.

VIII. Simpulan

1. Endospora bakteri dapat diamati dengan mengggunakan prosedur

pewarnaan spora .

2. Praktikan dapat memahami pewarnaan spora dengan baik.

3. Hasil pengamatan :

Badan vegetative : warna biru

Spora : warna merah muda

Sel vegetatif : bentuk batang

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : PT Gramedia.

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo

Persada.

Pelczar, chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Volk, W.A dan Margaret Fwheeler. 1988. Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh:

Markham, M.sc.Jakarta: Erlangga.