Pokok bahasan III : MEDIUM KULTUR JARINGAN Pendahuluan Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti. Isi dan komposisi dari medium kultur dirancang secara khusus untuk tujuan yang berbeda. Medium MS, singkatan dari nama penemunya, Murashige dan Skoog atau LS singkatan dari Linsmaier dan Skoog merupakan medium yang sangat banyak digunakan untuk kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium ini mengandung garam-garam mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat ; medium B5 (Gamborg) banyak digunakan untuk kultur suspensi sel tanaman leguminosae; Nitsch & Nitsch, N6 (Chu) banyak digunakan untuk serealia dan tanaman lain; medium WPM (Lloyd dan McCown) untuk kultur jaringan tanaman berkayu; Vacin dan Went (VW) dan Knudson C banyak digunakan untuk anggrek; medium Kao dan Michayluk digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae. Pada dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah satu komponen medium seringkali diperlukan untuk merespon setiap type pertumbuhan dari satu macam eksplan. Studi literature sangat diperlukan untuk mengembangkan atau memodifikasi medium kultur, modifikasi dari medium kultur yang telah ada umumnya didasarkan pada trial and error. Tujuan Instruksional Khusus Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan komponen dasar medium kultur jaringan, kebutuhan zat-zat anorganik dan organik, substansi organik lamplek, bahan tambahan lain pada medium kultur dan proses pembuatan medium .
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Pokok bahasan III : MEDIUM KULTUR JARINGAN
Pendahuluan Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan
adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada
medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada
bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang
digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti. Isi dan
komposisi dari medium kultur dirancang secara khusus untuk tujuan yang
berbeda. Medium MS, singkatan dari nama penemunya, Murashige dan Skoog
atau LS singkatan dari Linsmaier dan Skoog merupakan medium yang sangat
banyak digunakan untuk kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium
ini mengandung garam-garam mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N
dalam bentuk ammonium dan nitrat ; medium B5 (Gamborg) banyak digunakan
untuk kultur suspensi sel tanaman leguminosae; Nitsch & Nitsch, N6 (Chu)
banyak digunakan untuk serealia dan tanaman lain; medium WPM (Lloyd dan
McCown) untuk kultur jaringan tanaman berkayu; Vacin dan Went (VW) dan
Knudson C banyak digunakan untuk anggrek; medium Kao dan Michayluk
digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae. Pada
dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan
pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah satu
komponen medium seringkali diperlukan untuk merespon setiap type
pertumbuhan dari satu macam eksplan. Studi literature sangat diperlukan untuk
mengembangkan atau memodifikasi medium kultur, modifikasi dari medium
kultur yang telah ada umumnya didasarkan pada trial and error.
Tujuan Instruksional Khusus
Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan
komponen dasar medium kultur jaringan, kebutuhan zat-zat anorganik dan
organik, substansi organik lamplek, bahan tambahan lain pada medium kultur
dan proses pembuatan medium .
Subpokok Bahasan : KOMPONEN DASAR MEDIUM KULTUR JARINGAN
Pendahuluan
Pada prinsipnya medium diberikan kepada sel-sel tanaman in vitro
dengan maksud memberikan nutrisi sesuai dengan kebutuhan sel-sel tanaman
tersebut secara alami sebagai tanaman utuh yang tumbuh dialam. Tumbuhan
dialam bebas bersifat autotrof, memerlukan nutrient sederhana yang terdapat
didalam tanah berupa garam-garam mineral dan air untuk meneruskan siklus
hidupnya. Hal ini dapat dipahami karena sebagian terbesar tubuh tumbuhan
tersusun atas unsur-unsur penyusun zat anorganik tersebut. Pada kultur in vitro
tumbuhan, untuk keperluan hidupnya, sel-sel pada eksplan juga memerlukan
nutrient yang komposisinya jauh lebih komplek karena eksplan sedikit banyak
telah kehilangan sifat autotrofnya.
Materi subpokok bahasan 1
Komponen dasar dari medium kultur dapat bermacam-macam, secara
umum medium kultur jaringan harus mengandung unsur-unsur sebagai berikut:
1. Garam-garam anorganik:
a. Unsur makro : C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg
b. Unsur Mikro : Cl, B, Mo, Zn, Cu, Fe dan Co
2. Zat-zat organic
a. Gula
b. Myo-Inositol
c. Vitamin
d. Asam-asam amino
e. Zat pengatur tumbuh
3. Substansi organik komplek:
a. Air kelapa
b. Ekstrak buah-buahan
c. Ekstrak yeast
d. Pepton
e. Tripton
f. Hydrolisat kasein, dll
4. Bahan pemadat
a. Agar-agar
b. Gelrite
c. Phytagel
d. Sea Plaque Agarose, dll.
5. pH
6. Bahan tambahan lain misalnya arang aktip.
Kebutuhan zat-zat anorganik
Unsur makro.
Air merupakan zat terbanyak pada tubuh tumbuhan, oleh karena itu air
juga merupakan bagian terbesar didalam medium kultur. Air selain sebagai
bahan untuk membentuk material tubuh, juga sebagai medium untuk reaksi-
reaksi kimia dan fisika. Air juga berguna untuk transport dan distribusi zat-zat
yang terlarut didalamnya. Pada medium kultur jaringan digunakan air murni yang
sudah mengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas dua
kali.
Kebutuhan garam-garam mineral didalam jaringan kurang lebih sama
dengan tanaman utuh. Garam-garam mineral merupakan gabungan unsur-unsur
esensial makro dan mikro. Konsentrasi optimum dari tiap-tiap komponen untuk
mencapai kecepatan pertumbuhan yang maksimal sangat bervariasi. Menurut
Gamborg dan Shylluk (1981) biasanya berkisar antara 25-60mM.
Unsur makro dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya
diberikan dalam bentuk persenyawaan. George dan sherrington (1984)
menyebutkan beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan
pada medium kultur jaringan, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O;
A. Stok besi (IRON): dalam 200 ml (40 kali konsentrasi)
1. Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg Fe2SO4.7H2O, kedua bahan
tersebut dilarutkan dalam kira-kira 75 ml akuades secara terpisah.
Larutan Fe2SO4.7H2O dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian
masukan larutan Na2EDTA sedikit demi sedikit sambil diaduk (dengan
magnetik stirrer). Kedua larutan akan tercampur, bening dan berwarna
kuning emas, jika larutan keruh, tambahkan beberapa tetes HCl 1 N lalu
dipanaskan. Biarkan mendingin pada suhu kamar, tambahkan akuades
sampai volume menjadi 200 ml. Masukan dalam botol khusus berwarna
gelap, beri label:
IRON. MS 40X, 5 ml/I
2. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 5 ml
larutan stok besi.
B. Stok Mikronutrien : dalam 100 ml (100 kali konsentrasi)
Mikronutrien diperlukan dalam jumlah sangat sedikit, oleh karena itu stok
mikronutrien dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran.
1. Ditimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik,
masing-masing
MnSO4. H2O 2.230 mg
ZnSO4.4 H2O 860 mg
H3BO3 620 mg
KI 83 mg
NaMoO4. 2H2O 25 mg
CuSO4. 5H2O 2,5 mg
CoCl2. 6H2O 2,5 mg
2. Masukan satu persatu dalam gelas piala 200 ml yang berisi akuades
kurang lebih 80 ml. Setiap kali memasukan bahan kimia harus segera
dilarutkan (diaduk), baru kemudian bahan berikutnya. Jangan
memasukan semua bahan kimia kemudian dilarutkan, akan terjadi
presipitat (endapan). Untuk melarutkan bisa dibantu dengan magnetik
stirrer.
3. Larutan yang sudah jadi ditambahkan akuades sampai volume menjadi
100 ml.
4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:
MIKRO MS 100X, 1 ml/I.
5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat medium MS 1 liter, diperlukan 1 ml
stok mikro
C. Stok Vitamin, dalam 200 ml (50 kali konsentrasi) Vitamin dapat dibuat dalam
satu wadah sebagai stok campuran
1. Ditimbang bahan-bahan dibawah ini:
Glycine 100 mg
Nicotinic acid 25 mg
Pyridoxine-HCl 25 mg
Thiamine-HCl 5 mg
2. Larutkan satu persatu dalam gelas piala 600 ml yang berisi akuades
(steril) kira-kira sebanyak 150ml.
3. Tambahkan akuades steril sampai volume mencapai 200 ml
4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:
VITAMIN MS. 5OX, 4 ml/I
5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 4 ml
stok vitamin.
D. Stok zat pengatur tumbuh
Zat pengatur tumbuh diperlukan dalam jumlah yang sangat terbatas.
Kelarutan dari masing-masing zat juga berbeda-beda. Biasanya stok zat
pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 100-500 mg/l.
Siok Kinetin : 500 mg/l (500 ppm)
1. Timbang kinetin 50 mg, masukan dalam gelas piala 100 ml
2. Teteskan sedikit larutan HCl 1 N dan dipanaskan sebentar sampai larut,
sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades panaskan sebentar sampai
larutan menjadi jernih.
3. Setelah dingin, masukan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades
sampai volume menjadi 100 ml.
4. Pindahkan dalam erlenmeyer 100 ml atau wadah lain yang bersih, tutup
rapat, beri label:
KINETIN 500 ppm 5. Simpan dalam kulkas.
Stok IAA; NAA; 2,4-D; IBA : 500 mg/l (500 ppm)
1. Timbang IAA; NAA; 2,4-D dan IBA secara terpisah masing-masing
sebanyak 50 mg, masukan masing-masing bahan dalam gelas piala 100
ml.
2. Teteskan beberapa tetes larutan KOH 1 N dengan hati-hati panaskan
sampai larut benar (jernih), sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades,
untuk mempercepat proses pelarutannya dapat dibantu dengan
pemanasan
3. Pindahkan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume
menjadi 100 ml.
4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label pada masing-
masing wadah :
IAA 500 ppm 2,4-D 500 ppm NAA 500 ppm IBA500 ppm.
5. Simpan dalam lemari es.
E. Myo-Inositol dan Sukrose: karena jumlahnya cukup banyak,tidak dibuat stok,
ditimbang setiap kali membuat media.
II. Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 liter 1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml yang berisi 500 ml akuades 2. Timbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan
label), larutkan satu persatu, untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu
dengan magnetic stirrer. 3. Masukan 5 ml larutan stok IRON 4. Masukan 1 ml larutan stok MIKRONUTRIEN 5. Masukan 4 ml larutan stok VITAMIN 6. Masukan zat pengatur tumbuh (sesuai kebutuhan) 7. Timbang 100 mg Myo-Inositol, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan 8. Timbang 30 g sukrose, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan. 9. Tambahkan akuades sampai volume mencapai 1000 ml 10. Ukur pH menjadi 5,6 - 5,8 dengan penambahan HCl atau KOH. 11. Timbang 8 g agar-agar, masukan dalam erlenmeyer, panaskan (sambil
diaduk) sampai agar-agar larut. 12. Dalam keadaan masih cair, bagilah media kedalam botol kira-kira 40
ml/botol. 13. Tutup rapat dengan aluminum foil dan beri label sesuai dengan
perlakuan. 14. Masukan kedalam autoclave dan sterilisasi pada suhu 121°C selama 15
menit dengan tekanan 15 psi. 15. Setelah tekanan turun sampai 0, medium yang sudah steril segera
dikeluarkan dari autoclave, jangan menunggu sampai dingin didalam
autoclave. 16. Medium yang sudah steril disimpan dalam ruang penyimpanan.
Latihan soal-soal 1. Sebutkan dan jelaskan dengan singkat 5 komponen dasar dari medium
kultur!
2. Apa keunggulan medium Murashige dan Skoog !
3. Jelaskan apa kelemahan digunakannya medium agar!
4. Jelaskan peranan auksin dan sitokinin pada proses diferensiasi in vitro!
5. Jelas mengapa micronutrient harus dibuat larutan stok!