manggis ppt

Electrospun chitosan-based nanofiber mats loaded with Garcinia mangostana extracts

Keni idacahyati

introduction

• Chitosan merupakan kopolimer N - asetil - d - glukosamin ( GLC - NAC ) dan d - glukosamin ( GlcN ) yang dihasilkan oleh kitin .

• Chi - tosan telah digunakan sebagai bahan pembalut luka karena sifat khusus sebagai proliferasi , antioksidan , antibakteri , mengaktifkan makrofag dan hemostasis .

• Selain itu, chitosan membantu dalam membentuk kolagen dan merangsang peningkatan kadar asam hialuronat sintesis alami di temapt luka .

• Untuk penggunaan pembalut luka , nanofiber electrospun dapat digunakan dengan atau tanpa agen yang mempromosikan penyembuhan luka dan polimer harus bebiocompatible , biodegradasi dan toksisitas yang rendah

• Orang-orang di Asia Tenggara telah menggunakan pericarp (kulit, daging) dari GM sebagai obat tradisional untuk pengobatan sakit perut, diare, disentri, luka yang terinfeksi, nanah, dan maag kronis.

• Pericarp dari GM adalah sumber yang baik dari xanthone, -?, -, Dan-mangostins?, Gar-cinone E, 8-deoxygartanin, dan gartanin (Pedraza-Chaverri et al, 2008.). Beberapa penelitian telah mengungkapkan bahwa ekstrak GM dapat berguna sebagai antiproliferatif, antioksidan, anti-inflamasi (L.-G. Chen et al, 2008) dan analgesik (Cui et al, 2010).. Karena berbagai khasiat ini makan ekstrak GM , dapat digunakan untuk aplikasi penyembuhan luka.

• Tujuannya dari penelitian ini adalah untuk mempersiapkan nanofibe rmats berbasis kitosan sarat dengan GM ekstrak untuk meningkatkan keberhasilan mereka sebagai agen antibakteri dan antioksidan terial untuk meningkatkan penyembuhan luka .

• Themorphology dan struktur nanofiber berbasis kitosan matsafter ekstrak dimuat dianalisis dengan menggunakan scanning electronmicroscopy ( SEM ) . Komposit dan perilaku termal dari nanofiber mats dikarakterisasi menggunakan Fourier transforminfrared spektrofotometer ( FT - IR ) dan diferensial scanningcalorimeter ( DSC ) .

• . Tes sitotoksisitas untuk nanofiber mats dievaluasi dengan uji MTT menggunakan fibroblast manusia cells.

• antioksidan dan aktivitas antibakteri dari nanofiber mats dianalisis .

• efek penyembuhan luka secara in vivo diselidiki menggunakan model hewan .

• Stabilitas dari nanofiber mats dipelajari dengan menyimpan mats dalam kondisi normal dan membandingkannya dengan tikar disimpan dalam kondisi stres .

Materials and methods

• Material• Chitosan (derajat deasetilasi 0,85, MW 110 kDa) • asam andethylenediaminetetraacetic (EDTA) yang dibeli fromSigma-Aldrich Chemical

Company, USA. • Polivinil alkohol (PVA) (derajat polimerisasi ≈ 1600, tingkat hidrolisis sis ≈ 97,5-99,5

mol%) dibeli dari Fluka, Switzerland.G. mangostana (GM) diperoleh dari sebuah peternakan di ChantaburiProvince, Thailand.

• Normal human foreskin fibroblast (NHF) sel diperoleh dari Culture Collection American Type (ATCC) di Rockville, MD, USA.

• Dimetil sulfoksida (DMSO) wasobtained dari BDH Laboratories, Inggris. • Dulbecco yang dimodifikasi Eagle'smedium (DMEM), • serum janin sapi (FBS), • Tripsin-EDTA, • penicillin-streptomisin dibeli dari Gibco BRL Rockville, MD, USA. • Semua reagen dan pelarut lain commerciallyavailable dan kelas analitis.

Preparation of GM extract

Standardization of GM extracts

• α-Mangostin content in GM extracts• GM ekstrak dianalisis oleh besarnya?-Mangostin ditentukan oleh HPLC (Agilent

Technology, USA). Sebuah kolom VertiSep ® AQSC18 (250 mm x 4,6 mm, 5? Ukuran m partikel) dengan kolom C18guard digunakan. Analisis HPLC dilakukan menurut metode Pothitirat et al. (2009a) dengan slightmodification a. Elusi dilakukan dengan menggunakan sistem pelarut gradien yang terdiri dari asetonitril (mobile A) dan 0,1% (v / v) orto asam fosfat (mobile B) dengan laju alir 1 ml suhu / minat lingkungan.

• Program gradien adalah sebagai berikut: 70% A untuk 0-15 menit, 70-75% A dalam 3 menit, 75-80% A dalam 1 menit, konstan pada 80% A selama 6 menit, dan 80-70% A di 1 min. Wavelengthof The detektor UV-tampak yang ditetapkan sebesar 320 nm. Isi?-Mangostin dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi sehubungan dengan faktor pengenceran dan dinyatakan sebagai gram per 100 g ekstrak.

Aktivitas antioksidan dari ekstrak GM

•Aktivitas radikal bebas 2,2-difenil untuk-1-pikrilhidrazil (DPPH). Sebuah alikuot 200 μM dari DPPH dalam metanol (100 μl) ditambahkan ke 100 μl ekstrak GM.

• Ekstrak dilarutkan dengan pelarut sesuai yg disebutkan diatas dan kemudian diencerkan sampai konsentrasi yang diinginkan dengan metanol.

• Campuran disimpan pada suhu kamar selama 30 menit.• Absorbansi diukur pada 550 nm • Hasil dinyatakan sebagai IC50, yang merupakan konsentrasi ekstrak (μ g / ml) yang

diperlukan untuk menghambat 50% aktivitas radikal bebas. Kegiatan radikal bebas dinilai menggunakan

Scavenging activity for 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radicals.

ABTS dibuat dengan mereaksikan larutan ABTS (7 mM) dengan larutan kalium persulfat (4,95 mM). Solusi mix-mendatang direaksikan dalam gelap pada suhu kamar for12-16 h sebelum digunakan. Sebelum uji tersebut, larutan buffer fosfat dilutedin pada pH 7 untuk menghasilkan suatu absorbansi of 0.7 ± 0.02 pada 734 nm. Kemudian, 3,9 ml larutan kerja dicampur dengan 0,1 ml sampel. Setelah 10 menit pada temperatur kamar, absorbansi pada 734 nm diukur. Penghambatan persen kemudian dihitung menggunakan Persamaan. (1), dan nilai IC50 dihitung mengikuti prosedur yang dijelaskan untuk uji DPPH.

Ferric reducing/antioxidant potential (FRAP) assay

• Larutan FRAP baru disiapkan dengan mencampur buffer asetat pada pH 3.6 (a), 20 mM larutan klorida (b) dan 10 mM atripyridyl-s-triazina (TPTZ) solusi (c) dalam dengan rasio 10:1 : 1 (a: b: c). Larutan sample (50μL) ditambahkan ke dalam reagen FRAP (950 μ L). Campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, dan absorbansi diukur pada 593 nm.

• Pengukuran itu dibandingkan untuk kurva standar untuk FeSO4 · H2O larutan dan menyatakan asan EC1 kadar, yang menunjukkan bahwa konsentrasi antioxidantin sistem reaktif memiliki besi-TPTZ mengurangi kemampuan equivalentto bahwa dari 1 mM FeSO4 · H2O.

uji logam

• Adanya pembentukan kelat antara ion ferri dengan ekstrak GM diselidiki sesuai dengan methodof Decker dan Welch (1990).

•Kemampuan ion besi membentuk kelat dilihat oleh absorbansi dari besi-ferrozine kompleks pada 562 nm.

•campuran reaksi terdiri konsentrasi ofvarying dari ekstrak GM, FeCl2 (2 mM) dan fer-rozine (5 mM) dan disesuaikan dengan total volume 0,8 ml dengan air, dikocok dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Absorbansi kemudian diukur pada 562 nm. Persentase aktivitas chelating kemudian dihitung sebagai berikut Eq. (1), dan nilai IC50 dihitung mengikuti prosedur yang dijelaskan untuk uji DPPH.

Penentuan kadar fenolik Total

• Untuk memastikan bahwa setiap batch ekstrak memiliki keseragaman dan konsistensi untuk efek biologis yang dipamerkan, total fenolik dan kandungan asam tannic dan hasil ekstraksi adalah jumlah determined.

• Senyawa fenolik dalam ekstrak menghalangi-ditambang menggunakan metode Folin-Ciocalteu, dan asam galat digunakan sebagai senyawa fenolik standar.

• Aliquots Lima puluh mikroliter ekstrak (1 mg / ml) ditambahkan ke campuran 2,5 ml dari 10% Folin-Ciocalteu reagent dan 2 ml dari 7,5% Na2CO3.

• Setelah inkubasi pada 45 ◦ C selama 30 menit, absorbansi diukur pada 765 nm. Dosis-respon kurva linear seregression dihasilkan menggunakan absorbansi membaca asam ofgallic. Isi dari total senyawa fenolik dalam ekstrak adalah ekstrak dinyatakan sebagai gram ekuivalen asam galat per 100 gram berat ofdry (g GAE/100 g) ekstrak.

Penentuan total tanin

• total tanin konten dalam ekstrak ditentukan dengan menggunakan metode yang diadaptasi dari Silber dan Fellman (2006). Pertama, 2 mg albumin serum sapi dicampur dengan 1 ml dari ekstrak sampel pada konsentrasi 1 mg / ml dan kemudian mempertahankan suhu atroom selama 20 menit. Kemudian, campuran disentrifugasi, dan sedimen dilarutkan dengan 0,1% sodium dodesil sul-nasib (2 ml), trietanolamin (2 ml) dan 10 mM FeCl3 (1 ml). Absorbansi suspensi diukur pada 510 nm.

Persiapan ekstrak GM berbasis chitosan nanofibers mats

• nanofiber mats 2 % ( b / v ) kitosan ( CS ) dibuat dengan • melarutkan CS dan EDTA dalam air suling pada rasio berat 2:1. 10

% ( b / v )• larutan PVA dibuat dengan melarutkan PVA dalam air suling at80 ◦

C , diikuti dengan pengadukan selama 4 jam . • Solusi CS - EDTA adalah campuran dari PVA dengan rasio 30/70 .

Ekstrak GM ( mengandung 1 , 2 dan 3 % wt Mangostin polimer ) ditambahkan ke dalam larutan 30/70 CS-EDTA/PVA , dan kemudian , solusinya diaduk selama 24 jam.

• Viskositas , konduktivitas dan tegangan permukaan dari larutan diukur Para nanofibers dikumpulkan sebagai berputar pada lembaran aluminium yang waswrapped pada kolektor berputar

In vitro release study

• Karakteristik rilis nanofiber CS-EDTA/PVA dengan ekstrak GM dilihat menggunakan sel diffu-sion Franz dengan jaket air yang terhubung ke pemandian air pada 37 ◦ C, setiap sel memiliki volume 6,5 ml dan daerah difusi efektif of2.43 cm2. Kompartemen penerima dipenuhi dengan buffer asetat (pH 5,5) dan metanol (50:50) dan diaduk dengan Teflon mag-netic pengaduk pada 600 rpm.

• nanofiber mats dipotong dengan luas difusi equaldiameter efektif dan sel difusi.• Pada interval waktu tertentu, sebuah aliquot (1,0 ml) larutan penerima ditarik dan

diganti dengan volume yang sama dari media segar untuk mempertahankan jumlah volume. Ekstrak GM di solusi sampel dianalisis by HPLC.

Uji sitotosisitas

nanofiber mats disterilisasi dengan radiasi UV selama 1 jam .

kemudian direndam dalam serum - freemedium ( SFM ; mengandung dimodifikasi media Dulbecco Eagle 's ( DMEM ) , 1 % ( v / v ) l - glutamin ,

1 % ( v / v ) lactalbumin dan 1 % ( v / v ) antibiotik dan perumusan antimycotic ) dalam inkubator selama 24 jam dengan konsentrasi yang berbeda ( 1 , 2,5 , 5 , 7.5and 10 mg / ml ) . ( NHF ) sel berlapis dalam 100 L DMEM , yang dilengkapi dengan 10 % FBS , dengan kepadatan 8000 sel .

Ketika kultur mencapai confluency ( biasanya 48 jam setelah plating ) , konsentrasi berbagai media ekstraksi diuji , dan sel-sel kembali diinkubasi selama 24 jam . Setelah pengobatan , solusi ekstraksi diuji telah dihapus . Akhirnya , sel-sel incu - tertahan dengan 100 L medium MTT mengandung ( 1 mg / ml ) selama 4 jam. media telah dihapus , sel-sel dibilas dengan PBS ( pH7.4 ) , dan kristal formazan yang terbentuk dalam sel hidup dilarutkan

Aktivitas antibakteri

• Aktivitas antibakteri dari nanofiber mats diuji terhadap Staphylococcus aureus ( S. aureus ) ATCC 6538P dan Escherichia coli ( E. coli ) ATCC 10536 . Untuk konsentrasi hambat minimum ( MIC ) tes, S. aureus dan E. coli yang dibudidayakan kaldu in Tryptone soy broth ( TSB ) di inkubator pada 37 ◦ C dan 100 rpm selama 24 jam . Suspensi bakteri diencerkan sampai konsentrasi bakteri adalah sekitar 1 × 106cfu/ml ,

• Bobot yang berbeda dari nanofiber mats ( 0,25-5 mg ) ditempatkan ke dalam tempat yang berisi suspensi bakteri dan diinkubasi pada suhu 37 ◦ C selama 24 jam . MIC didefinisikan sebagai konsentrasi minimum tikar di mana ada pertumbuhan diamati setelah 24 jam inkubasi .

• Kepadatan optik ( OD ) pada 550 nm diukur menggunakan pembaca lempeng . Untuk menentukan konsentrasi minimum bakterisida ( MBC ) , campuran dari sumur tanpa pertumbuhan ( 100 ? L ) tersebar ke piring agar untuk penentuan MBC . MBC didefinisikan sebagai ofmats konsentrasi minimum di mana tidak ada pertumbuhan koloni diamati pada agar platesafter 24 jam inkubasi pada 37 ◦ C. The MIC dan MBC penentuan dilakukan pada tiga ulangan , dan 1 mg / ml penisilin digunakan sebagai kontrol apositive .

Uji penyembuhan luka

• tikus Wistar jantan (240-280 g) yang digunakan dalam penelitian ini. Setelah pembiusan, daerah leher dorsal dari setiap tikus dicukur dan dibersihkan dengan 70% etanol.

• Dibuat Dua luka pada daerah leher setiap tikus menggunakan pukulan skinbiopsy (area luka dari 0,8 cm2).

• Luka dirawat dengan menempatkan ukuran sama nanofiber tikar, kain kasa dan antibakteri kasa ganti (Sofra-tulle ®, Sanofi Aventis, UK) (n = 6) di atasnya tanpa menghapus materi tes selama periode penelitian.

• Daerah luka diukur setiap hari menggunakan metode planimetry sampai luka benar-benar sembuh. Persentase penutupan luka didefinisikan sebagai

Pemeriksaan histologi tikus

Tikus dikorbankan pada hari ke 11 setelah operasi.

Sampel trauma dipotong dan disimpan dalam 10% netral buffer formalin, tertanam dalam parafin, dan serial belah di 5M.

Inti dari bagian yang diberi dinodai dengan hematoxylin, dibilas dengan air , dibedakan dengan asam 0,3% alkohol, dibilas dengan air , diwarnai dengan eosin selama 2 menit, kemudian dehidrasi, dibersihkan dan dipasang. Bagian bernoda oleh hematoxylin-eosin diamati di bawah mikroskop cahaya.

Uji stabilitas

•Stabilitas CS-EDTA/PVA nanofiber mats dengan ekstrak GM dipantau hingga 6 bulan dalam kondisi stres.

Result and discussion

Standarisasi ekstrak

Electrospinning

Gambar SEM dan diameter distribusi ekstrak GM (wt%-Mangostin polimer) dimuat CS-EDTA/PVA nanofiber mats dengan jumlah yang berbeda dari ekstrak GM: (a dan e) 0% berat-mangostin?, (B dan f ) 1% wt-mangostin, (c dan g) 2% wt-mangostin dan (d dan h) 3% wt-mangostin.

Characterizations

a) Spektrum FT-IR dan (b) DSC termogram dari GM ekstrak dimuat CS-EDTA/PVA nanofiber tikar dengan jumlah yang berbeda dari GM ekstrak (0, 1, 2 dan 3% wt mangostin polimer) dan bubuk mangostin . Untuk interpretasi ada ferences untuk warna dalam legenda angka ini, pembaca disebut versi web ofthis artikel.)

Sifat mekanis dari ekstrak GM (0, 1, 2 dan 3% wt?-Mangostin polimer) dimuat CS-EDTA/PVA nanofiber mats. Setiap nilai merupakan rerata ± S.D. dari tiga percobaan independen.

Derajat pembengkakan (%) dari GM ekstrak nanofibermats CS-EDTA/PVA dengan jumlah yang berbeda dari GM ekstrak (0, 1, 2 dan 3% wt-Mangostin ). Data dinyatakan sebagai mean ± S.D. dari tiga percobaan independen.

In vitro release study

Indirect cytotoxicity

persentase sel NHF pada konsentrasi yang berbeda-beda dari GM extract dalam CS-EDTA/PVA nanofiber mats. Nilai merupakan rerata ± standar deviasi dari lima sumur. * Signifikan secara statistik (p <0,05).

Aktivitas antibakteri

Wound healing test

Stability studies

conclusion

• Kesimpulan Dalam penelitian ini, ekstrak GM dimasukkan intoCS-EDTA/PVA nanofiber tikar menggunakan tikar electrospinning process. Mats ini tidak beracun dan Mangostin dengan cepat dirilis, untuk mempertahankan antioksidan dan aktivitas antibakteri, dan mempercepat proses penyembuhan luka.

• Mangostin terurai, biokompatibel dan antibakteri electros pun nanofiber mats memiliki potensi yang menjanjikan untuk digunakan sebagai pembalut luka yang efektif.