laporan pratikum

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER

BLOK 5

“Isolasi DNA, Polymerase Chain Reaction, Elektroforesis”

Oleh:

Fadel Fikri Suharto

04101001035

FAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS SRIWIJAYA

2011

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT karena atas ridho dan karunia-Nya, Laporan

Pratikum Blok 5 tentang biologi molekuler ini dapat terselesaikan dengan baik.

Laporan ini betujuan untuk memenuhi tugas yang merupakan bagian dari sistem

pembelajaran KBK di Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya.

Tim penyusun laporan ini tak lupa mengucapkan terima kasih kepada semua pihak

yang telah membantu dalam penyusunan laporan tugas tutorial ini.

Laporan ini masih belum sempurna. Oleh karena itu, saran dan kritik pembaca akan

sangat bermanfaat bagi revisi yang senantiasa akan tim penyusun lakukan.

Penyusun,

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Isolasi DNA

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan

terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria

dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA

genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria

(mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast

berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom

dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein

tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom

prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih

plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih

kecil dibanding kromosom.

Isolasi DNA kromosom.

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari

komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise,

atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk

membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang

berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi

RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan

sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase).

Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan

air.

Isolasi DNA plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga

DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai

ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA

plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas.

Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini

membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain.

DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA +

protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan

yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan.

Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein.

Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

Isolasi RNA

RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu

protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA

eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau

RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang

berfungsi untuk mendegradasi DNA

Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan)

dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan

protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan

pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar

tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA.

Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari

komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting

untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan

dengan baik dan bebas kontaminasi. Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan

dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic),

dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara

mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel

maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS

merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase

K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan

dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah

dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol.

Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform

digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim

RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara

utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan

DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari

larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses

sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih

(DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf.

Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung

DNA. Agar lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh

sebab itu sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan

menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan

teknik sentrifugasi. Setelah disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi

tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum, lapisan tengah berwarna

putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah

merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil dengan klinipette. [2]

1.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan

(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh

dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah

yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan

DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo

yang bersifat semi konservatif. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara

dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel

(in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai

cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk

pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat

(dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer

akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak

pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan

menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel

pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer

dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat.

DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada

karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses

penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung

dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya

akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada

rantai DNA templat.

Secara ringkas, PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami

memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian,

tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen

pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa).

Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.

Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus

temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan

yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-

96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu,

dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang

memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara

oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan

oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan

ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah

yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi

(elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim

DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase

yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul

cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan

sebagai cetakan pada siklus selanjutnya. [3] [4]

1.2.1. Tahapan PCR

1) Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi

dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi

menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen.

Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi

polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan

antara suhu 90 oC – 95 oC.

2) Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju

daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses

annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan

komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC –

60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen

tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila

dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC.

3) Reaksi polimerisasi (extension)

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi

pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami

perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen

dengan templat oleh DNA polimerase.

Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua

primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai

ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x.

Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi,

seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan

menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8

kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial.

PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus

akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA

yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan

menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. Proses

PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler. [5]

1.3. Elektroforesis

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya

molekul bermuatan pada suatu medan listrik.

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan

lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di

deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau

pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH

dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam

suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi

keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis

untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol

bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini

disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan

menuju elektrode positif

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik

dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik

ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,

misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif

dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke

kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub

negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah

muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan

ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris

bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan

Fe = qE

Ket :

F= gaya Lorentz

q= muatan yang dibawa oleh objek

E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi,

dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan

yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi

group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium

dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi

dan medium yang sesuai.

Jenis Elektroforesis

1) Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai

fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah

ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi

sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada

muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan,

konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

2) Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam

untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan

medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih

besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan

menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media [7]

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi

molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat

dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan

berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju

perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis

gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai

teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-

metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau

immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk

memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau

oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat

dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan

pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran

rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar

dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput

laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur

(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan

kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke

arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah

pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami

pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam

nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium

hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk

lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil

sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining)

agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau

pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini.

Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai"

dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel

mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak

setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur"

gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis

mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis

dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut

berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul

dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul

dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang

paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan

pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding

terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.[3] [4]

BAB II

METODE PENELITIAN

2.1. Isolasi DNA

Alat :

Tabung sentrifugasi 15 ml (steril)

Rak tabung

Micropipettor (10-100 µl dan 100-1000 µl)

Pipet tip, volume 1000 µl dan 100 µl.

Freezer -20oC

Alat vortex

Waterbath

Mesin incubator

Ice bath

Mesin sentrifugasi

Tabung eppendorf 1,5 ml

Kertas absorban atau tissue

Bahan :

Phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4

Saponin 0,5 % dalam PBS

Chalex-100 20 % dalam ddH2O

Cara kerja :

1) Ambil 200 ul darah dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml steril

2) Tambahkan PBS pH 7,4 sebanyak 1 l kedudian disentrifuge dengan kecepatan

5.000 rpm selama 5 menit

3) Buang supernatant. Ulangi pencucian ini selama 3 kali

4) Tabahkan 500 µl 0,5 % saponin dalam PBS dicampur dengan baik

menggunakan vortex kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit

5) Untuk mendapatkan hasil yang sempurna, inkubasi campuran terebut pada

suhu -20oC selama semalam

6) Keesokannya, dilakukan sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10

menit

7) Sipernatan dibuang, ditambahkan 50 ul chelex-100 20 % dalam ddH2O pH

10,5 dan ditambahkan 100 ul ddH2O

8) Diinkubasi dalam air mendidih selama 10 menit. Selanjutnya, disentrifuge

dengan kecepatan 12.000 rpm elama 10 menit

9) DNA akan berada pada bagian supernatant (DNA containing water) lalu

bagian ini dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 l steril dan disimpan pada

suhu -20oC

2.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Alat :

Micropipette (ukuran 0,1-10 µl, 10-100 µl dan 100-1000 µl)

Pipet tip

Tabung PCR volume 0,2 µl

Tabung eppendorf 1,5 ml

Rak tabung

Mesin vortex

Alat untuk spin (sentrifuge)

Mesin PCR

Bahan:

Suatu mix dari kit PCR yang terdiri dari : buffer 10X MgCl2 25mM, PCR

nucleotide mix (dNTP) 10 mM dan Taq DNA polymerase yang trgabubg

dalam PCR mix green go taq (promega)

Primer upstream dan downstream dengan konsentrasi masing-masing 40

pmol yang spesifik

Sampel DNA genomic dan ddH2O

Sekuen oligonucleotide primer upstream dan downstream (table 1)

Primer Sekuen Produk PCR

Forward 5’-CCCCTCCATCCATCCCACCCAGTCAAC-3’151 BP

Reverse 5’-AGGAAACGGTCGCTTCGACGTGCTG-3’

Table 1. sekuen primer yang digunakan untuk PCR

Cara kerja :

1) Campurkan : gotex 50 µl, ddH2O 45 µl, primer forward 2,5 µl, dan primer

reverse 2,5 µl kedalam eppendorf, pada masing-masing pencampuran diaduk

terlebih dulu

2) Setelah semua tercampur sebanyak 20 µl pada masing-masing eppendorf,

kemudian ditambahkan DNA sebanyak 5 µl pada masing-masing eppendorf.

3) Lalu dimasukkan kedalam alat PCR diset suhunya, didalam 2,5-3 jam.

Kondisi PCR untuk masing-masing analisis

Tahap Denaturasi Awal 95 oC (5 menit)

Siklus PCR 35

o Tahap Denaturasi 95 oC (45 detik)

o Tahap Annealing 65 oC (45 detik)

o Tahap Ekstensi 72 oC (45 detik)

Tahap Ekstensi Tambahan 72 oC (7 menit)

2.3. Elektroforesis

Alat :

Timbangan (Sartorius 2402)

Gelas ukur

Becker glass

Microwave untuk melarutkan gel agarose

Micropipettor (0,5-10 µl)

Pipet tip untuk volume 20 µl

Kertas parafilm

Bak elekroforesis beserta sisir

Mesin elektroforesis beserta power supply (BIO-RAD model 200/2,0 power

supply)

Cahaya ultraviolet (spectroline® longlife 1027 filter)

Kamera Polaroid (direct screen instant camera DS 34)

Film Polaroid (667 ISO 3000/DIN, 8,5 x 10,8 cm black and white instant

pack film) atau Geldoc

Bahan:

Gel agarose 2 % (mengandung 1 µl ethidium bromide 0,5 mg/ml dalam

larutan buffer TBE 1X)

Larutan buffer tris acetate EDTA (TBE) 1X

Tracking dye [0,25 % bromophenol blue (bio-rad, 161-0404); 0,25 % xylene

cyanol; dan 40 % sukrosa w/v]

Produk hasil PCR dan marker DNA (DNA molecular weight market XIV

100-1500 bp) yang terdiri dari 15 untai ganda fragmen DNA dengan panjang

pasang basa 100, 200, 300 dan seterusnya pada tiap pita-nya

Larutan TBE 1X dibuat dari larutan TAE 10X (Lonza) yang diencerkan

Cara kerja :

Kualitas DNA hasil amplifikasi dengan teknik PCR dilihat dengan

menggunakan teknik elektroforesis gel agarose (konsentrasi 2 %). Elektroforesis

dilakaukan didalam apparatus elektroporesis (horizontal MiniSubDNA Biorad)

yang berisi TBE 1X (Tris-Boric acid-EDTA, 10,8 g/l. tris pH 8.0 yang

mengandung 5.5 g/l Boric Acid dan 0,5 M EDTA pH 8.0) dan ditambahkan zat

interkalator Ethidium Bromide 0.1 %.

(0.25 % bromophenol blue, 40 % b/v sukrosa). Kemudian dimasukkan dalam

sumuran yang terdapat pada gel. Sebagai penanda ukuranpita-pita DNA hasil

elektroporesis pada gel. Gel elektroforesis pada tegangan listrik 110 volt 400 mA

dan waktu 45 menit. Selanjutnya dideteksi dengan menggunakan gel doc 1000

untuk di visualisasi denagn sinar ultra violet pada panjang gelombang 300 nm

dan direkam.

BAB III

HASIL PENGAMATAN

3.1. Hasil Pengamatan Isolasi DNA

Tabel 2. Pengamatan Urutan Poses Isolasi DNA

No Gambar Urutan Proses Isolasi DNA Keterangan

1Isolasi DNA dalam darah 200 uL

Warna larutan merah pekat (merah darah)

Belum terbentuk endapan, butiran kasar masih tersebar di sekitar larutan.

Sampel darah di masukkan

kedalam tabung yang steril

untuk diambil leukosit (sel

darah putih)

2

Setelah disentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit

Warna larutan masih merah darah

Terbentuk endapan

Setelah disentrifuge maka

pada sampel terjadi

penggendapat yang terletak

dibagian bawah tabung.

Lalu diambil supernatantnya

3

Setelah diinkubasi dalam suhu -20˚C selama semalaman

Warna larutan merah semakin pudar

.

Untuk hasil terbaik,

sebaiknya sampel diinkubasi

selama semalaman dangan

suhu -20˚C

4Setelah diinkubasi dalam air mendidih selama 10 menit dan disentrifuge dengan kecepatan 12.00 rpm selama 10 menit

DNA (berada pada bagian supernatant)

Keesokkannya, dilakukan

sentrifuge lagi, maka akan

dilihat kalau sekarang

sampel DNA.nya yang

berada di atas. Lalu, sampel

DNA itu yang diambil dan

dimasukkan ke tabung steril

yang lain.

3.2. Hasil Pengamatan Elektroforesis DNA

Tabel 3. Pengamatan Urutan Poses Elektroforesis DNA

No. Foto Hasil Pengamatan Keterangan

1

Sampel dimasukkan ke

dalam sumur yang

terdapat dalam gel.

2

Dari semua sampel,

hasil yang di dapat

adalah semuanya posif

DM (diabetes mellitus),

dengan 403 bp

BAB IV

DISKUSI / PEMBAHASAN

Percobaan ini dimulai dari penggambilan darah utuk diisolasi agar bisa mengambil

DNA yang berada dalam leukosit. Isolasi DNA itu sendiri bertujuan untuk memisahkan

campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul

besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas

tabung.

Setelah mendapatkan DNA dari isolasi DNA. Maka DNA itu akan diuji kualitas dan

kuantitasnya melalui elektroforesis. Elektroforesis akan memisahkan DNA, RNA, dan protein

berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah.

Setelah itu hasilnya dapat di visualisikan menggunakan computer. Pada percobaan

kali ini hasil yang didapat adalah positf (+) diabetes mellitus pada keenam sampel karena

ditemukan fregmen DNA pada 403 bp.

DAFTAR PUSTAKA

1. http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/

2. http://id.shvoong.com/medicine-and-health/genetics/2040101-isolasi-dna/

3. http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular

4. Sambrook J., Russel D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Edisi ke-

3. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY

5. http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-and-biotechnology/2040144-

polymerase-chain-reaction-pcr/

6. http://parts.mit.edu/igem07/index.php/McGill/PCR

7. http://id.shvoong.com/medicine-and-health/medicine-history/2066425-pengertian-

elektroforesis/

8. http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis

9. http://science-project.com/images/Electrophoresis.gif