LAPORAN PRAKTIKUMPEMBUATAN PREPARAT AWETAN DARAH MANUSIA
Disusun untuk memenuhi Tugas Terstruktur Mata Kuliah Praktikum
Mikroteknik
Dosen Pengampu: Ir. Nur Rahayu Utami, M. Si.
Disusun Oleh :Futikhatul Fitriana4401412043
Kelompok 3 Rombel 2 Pendidikan Biologi
JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS METEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAMUNIVERSITAS NEGERI SEMARANG2015
PEMBUATAN PREPARAT AWETAN DARAH MANUSIASenin, 30 Maret 2015
A. Tujuan1. Mengetahui cara pembuatan preparat awetan darah
manusia dengan metode apus dan metode pewarnaan Romanowski. 2.
Mengamati morfologi sel penyusun darah dengan pengamatan
mikroskopis preparat awetan darah manusia.3. Menganalisis hasil
pembuatan preparat apus darah manusia
B. Alat dan BahanAlat :1. Mikroskop2. Gelas benda3. Gelas
penutup4. Jarum franke5. Tisu 6. Rak pewarnaan7. Bak pewarnaan8.
Stainnning jar9. Pipet 10. Botol flaconBahan :1. Darah manusia2.
Larutan pewarna Giemsa 3 %3. Methanol4. Aquades dingin5. Alkohol
70%C. Dasar TeoriDarah merupakan suatu suspensi sel dan fragmen
sitoplasma di dalam cairan yang disebut plasma. Secara keseluruhan
darah dianggap sebagai jaringan pengikat, karena terdiri atas
unsur-unsur sel dan substansi interseluler yang berbentuk plasma.
Apabila darah dikeluarkan dari tubuh maka segera terjadi bekuan
yang terdiri dariatas unsur berbentuk cairan kuning yang disebut
serum. Serum sebenarnya adalah plasma tanpa fibrinogen (protein).
Apabila pembekuan di cegah maka perbandingan antara unsur berbentuk
yang sebagian besar merupakan sel-sel darah merah dan plasma,
adalah sekitar 40-50% pada leleki dewasa (Subowo, 2009:123).Volume
darah manusia adalah sekitar 8% dari berat tubuhnya. Darah tersusun
atas dua komponen. Komponen pertama berupa cairan yang disebut
plasma darah. Komponen kedua adalah sel-sel darah dan keping-keping
darah yang berupa padatan. Plasma darah jumlahnya sekitar 55% dari
volume darah, sedangkan sel-sel darah dan keping-keping darah
sekitar 45% dari volume darah (Pujiyanto, 2008:93).Pembuatan
Sediaan DarahUntuk melihat struktur sel-sel darah dengan
menggunakan mikroskop cahaya pada umumnya dibuat sediaan apus
darah. Sediaan apus darah ini tidak hanya untuk mempelajari bentuk
masing-masing sel darah, tetapi juga dapat digunakan untuk
menghitung perbandingan antara masing masing jenis sel darah
(Subowo, 2009:124).Untuk membuat sediaan apus darah diperlukan dua
buah kaca sediaan yang sangat bersih terutama harus bebas lemak.
Satu keping kaca sediaan bertindak sebagai alat untuk meratakan
tetes darah agar didapatkan lapisan tipis darah (kaca perata), satu
keping lain untuk sediaan (Subowo, 2009:124).Darah dapat diperoleh
dari tusukan jarum pada ujung jari. Sebaiknya tetesan darah pertama
dibersihkan agar diperoleh hasil yang memuaskan. Tetesan yang kedua
diletakkan pada daerah ujung kaca sediaan yang bersih. Salah satu
ujung sisi pendek kaca perata diletakkan miring dengan sudut
kira-kira 450 tepat di depan tetes darah sehingga menyentuhnya.
Sudut antara kedua kaca tersebut sangat menentukan hasil apusan
darah. Setelah tetesan darah menyebar sepanjang sisi pendek kaca
perata, dengan mempertahankan sudutnya, kaca perata digerakkan
secara cepat sehingga terbentuklah selapis tipis darah di atas kaca
sediaan (Subowo, 2009:124).Setelah sediaan darah dikeringkan pada
suhu kamar barulah dilakukan pewarnaan sesudah difiksasi menurut
metode yang dipilih. Pada masa kini sering digunakan pewarnaan
metode Giemsa dan Wright yang merupakan modifikasi metode
Romanowsky. Pada dasarnya bahan pewarna selalu terdiri atas zat
warna basa dan zat warna asam (Subowo, 2009:124).
Jenis Sel Darah Sel-sel darah dikelompokkan dalam tiga kategori,
yaitu :1. eritrosit2. leukosit, yang dibedakan dalam granulosit dan
agranulosit3. trombositEritrositDalam setiap 1 mm3 darah terdapat
sekitar 5 juta eritrosit, oleh karena itu pada sediaan darah yang
tampak paling menonjol adalah sel-sel tersebut. Dalam keadaan
normal, eritrosit manusia berbentuk sebagai cakram bikonkaf dengan
diameter sekitar 7,2 m tanpa memiliki inti. Apabila diamati pada
sediaan apus, ternyata sel-sel eritrosit berukuran hampir sama,
kecuali pada penyakit darah tertentu akan dialami penyimpangan
dalam bentuk, ukuran, dan tampilan warna. Eritrosit yang berukuran
kurang dari 6 m dinamakan mikrosit dan yang berukuran lebih dari
normal (9 m-12 m) dinamakan makrosit (Subowo, 2009:126).Bentuk
bikonkaf dari eritrosit ternyata lebih menguntungkan dari bentuk
sebagai bola bagi pelaksanaan fungsinya karena pertambahan luas
permukaannya menjadi 20-30% akan mempercepat proses absorbsi dan
pelepasan O2. Bentuk yang lebih pipih akan memperpendek jarak
antara pusat sel dengan lingkungannya sehingga dapat mempercepat
pertukaran oksigen. Tidak adanya intinya inti sel juga lebih
menguntungkan karena eritrosit akan memberikan tempat lebih banyak
bagi kandungan Hb sehingga oksigen lebih banyak diikat (Subowo,
2009:127).LeukositLeukosit atau sel darah putih memiliki fungsi
utama di dalam sistem pertahanan. Untuk mengungkapkan keadaan
kesehatan tubuh melalui sel-sel leukosit perlu diperhatikan
mengenai jumlah dan morfologinya. Untuk mempelajari morfologinya
cukup mengamati sediaan apus darah . Sediaan apus darah yang baik,
memperagakan penyebaran sel yang rata pada bagian tengah dari
apusan darah. Bagian pinggir yang tebal dari sediaan biasanya
berkumpul sel-sel leukosit, namun bagian ini tidak dianjurkan untuk
dipakai mempelajari morfologinya (Subowo, 2009:128).Berdasarkan ada
tidaknya butir-butir dalam sitoplasmanya dibedakan leukosit
granuler atau granulosit dan agranuler atau agranuosit. Berdasarkan
atas reaksi butir-butir terhadap zat warna dan ukurannya, maka
granulosit dibedakan menjadi : sel netrofil, sel eosinofil, dan sel
basofil (Subowo, 2009:129). Leukosit granulosit memiliki ciri
sitoplasmanya bergranula dan intinya berlobus. Ada tiga jenis
leukosit granulosit, yaitu neutrofil, eosinofil, dan basofil.
Sedangkan leukosit agranulosit memiliki ciri tidak adanya granula
pada sitoplasmanya. Inti selnya berbentuk bulat atau seperti
ginjal. Leukosit agranulosit terdiri dari limfosit dan monosit
(Pujiyanto, 2009:129).Sel NetrofilSel netrofil matang berbentuk
bulat dengan diameter 10-12 m. Intinya berbentuk tidak bulat
melainkan berlobus berjumlah 2-5 lobi bahkan dapat lebih. Semakin
muda jumlah lobi akan berkurang. Yang dimaksudkan dengan lobus
yaitu bahan inti yang terpisah-pisah tetapi masih dihubungkan oleh
bahan inti yang berbentuk benang. Inti terisi penuh oleh butir
khromatin padat sehingga sangat mengikat zat warnabasa menjadi biru
atau ungu (Subowo, 2009:129).Dalam sitoplasma terdapat dua jenis
butir-butir (butir azurofil dan butir spesifik). Butir azurofil
memiliki ukuran yang lebih besar dan kebanyakan telah kehilangan
kemampuan mengikat warna. Dengan pewarnaan metode Romanowsky
butir-butir azurofil tampak berwarna ungu kemerahan. Jenis butir
kedua disebut butir spesifik karena hanya terdapat dalam sel
netrofil dan berukuran lebih halus. Butir spesifik berwarna ungu
merah muda (Subowo, 2009:130). Sel EosinofilDiamter sel ini adalah
1-15 m, sedikit lebih besar dari sel netrofil. Intinya biasanya
hanya dua lobi yang dipisahkan oleh bahan inti yang berbentuk
sebagai benang. Sitoplasma berisi penuh dengan butir-butir seperti
dalam netrofil, tetapi warnanya merah atau oranye (Subowo,
2008:131-132).Sel BasofilJenis sel ini terdapat paling sedikit
diantara sel granulosit yaitu sekitar 0,5 %, sehingga sangat sulit
ditemukan ada sediaan apus darah. Kurang lebih separuh dari sel
dipenuhi oleh inti yang bersegmen atau terkadang tidak teratur.
Kemampuan inti mengikat warna kurang lebih sama dengan inti sel
neutrofil. Butir-butir spesifik yang berwarna biru tua dan kasar
tampak memenuhi sitoplasma (Subowo, 2008:133).
Limfosit Limfosit dalam darah berukuran sangat bervariasi
sehingga pada pengamatan preparat apus darah dibedakan menjadi :
limfosit kecil (7-8 m), limfosit sedang, dan limfosit besar (12 m).
Limfosit kecil yang terdapat paling banyak mempunyai inti bulat
yang terkadang bertakik sedikit. Intinya tampak gelap karena
khromatinnya berkelompok dan tidak tampak nukleolus. Sitoplasmanya
yang sedikit tampak mengelilingi inti sebagai cincin yang berwarna
biru muda. Kadang-kadang sitoplasmnaya tidak jelas karena
butir-butir azurofil yang berwarna ungu. Limfosit kecil kira-kira
berjumlah 92 % dari seluruh limfosit dalam darah (Subowo,
2008:133-134).MonositSel ini merupakan sel terbesar diantara sel
leukosit karena diameternya sekitar 12-15 m. Bentuk inti dapat
berbentuk oval, sebagai tapal kuda atau tampak seakan-akan
terlipat-lipat. Sitoplasma monosit terdapat relatif lebih banyak
tampak berwarna biru abu-abu (Subowo,
2008:133-134).TrombositTrombosit tidak memenuhi syarat sebagai sel
yang utuh karena tidak memiliki inti. Berbentuk sebagai
keping-keping sitoplasma yang berukuran 2-5 m lengkap dengan
membran plasma yang mengelilinginya. Oleh karena itu dinamakan
sebagai keping darah. Pada sediaan apus darah, trombosit sering
terdapat bergumpal. Setiap keping tampak adanya bagian tepi yang
berwarna biru muda yang dinamakan hialomer dan bagian tengah yang
berbutir berwarna ungu dinamakan khromomer. Hialomer berbentuk
tonjolan-tonjolan sehingga berbentuk tidak teratur (Subowo,
2008:135).Preparat ApusPreparat apus adalah preparat yang proses
pembuatannya dengan metode apus/oles/smear, yaitu dengan cara
mengapuskan/ membuat lapisan tipis atau filem suatu bahan yang
berupa cairan/bukan cairan di atas gelas benda yang bersih dan
bebas lemak, selanjutnya difiksasi, diwarnai, dan ditutup dengan
gelas penutup untuk diamati di bawah mikroskop (Rudyatmi, 2015:
6)Tujuan pembuatan preparat ini selain untuk melihat struktur sel
penyusun cairan juga untuk mengetahui berbagai parasit yang
biasanya berhubungan dengan diagnosis suatu penyakit. Misalnya
preparat smear darah manusia untuk mempelajari struktur eritrosit,
leukosit, trombosit, dan parasit-parasit pada darah. Smear faeces
untuk mengetahui berbagai telur-telur parasit dalam diagnosis
parasit saluran pencernaan (Rudyatmi, 2015: 6)FiksasiFiksasi adalah
suatu tindakan mematikan elemen-elemen sel atau jaringan
tumbuhan/hewan dengan mempertahankan bentuk, struktur, maupun
ukurannya menggunakan zat kimia. Fungsi utama fiksasi adalah
mempertahankan struktur sel yang dijadikan obyek dalam pembuatan
preparat. Apabila tetap terjadi perubahan struktur dapat ditekan
sekecil mungkin. Fungsi kedua yaitu untuk mengubah indeks bias
bagian sel sehingga mudah diamati di bawah mikroskop. Fungsi
ketiga, yaitu untuk mengubah jaringan yang mempunyai kemampuan
mudah menyerap zat warna. Dengan demikian fungsi fiksasi kedua dan
ketiga tidak akan terlihat apabila tidak dilakukan proses
pewarnaan. Zat kimia yang digunakan dalam proses fiksasi disebut
dengan fiksatif (Rudyatmi, 2015: 20).Metode fiksatif tergantung
tujuan utama pembuatam preparat. Untuk jaringan yang halus
digunakan fiksatif tunggal yang lembut seperti metyl alkohol. Untuk
jaringan yang lebih kuat digunkan fiksatif tunggaletyl alkohol atau
fiksatif majemuk seperti FAA. Hal yang perlu diperhatikan sebelum
proses pengambilan jaringan dan fiksasi, yaitu : jaringan tidak
rusak, ukuran jaringan atau organ harus tepat dan diambil dari
obyek yang tepat pula, harus bersih dari kotoran, harus segera
difiksasi dengan posisi yang tepat, volume fiksatif minimal 10 x
volume bahan, fiksasi harus dilakukan pada temperatur yang sesuai
dengan jenis fiksatif yang digunakan. Lama fiksasi bervariasi
tergantung dari macam bahan, ukuran bahan, dan macam fiksatif yang
digunakan. Kecepatan penetrasi dalam jaringan masing-masing
fiksatif tidak sama (Rudyatmi, 2015:20).Pewarnaan Tunggal dan
DifusPewarnaan tunggal, yaitu pewarnaan yang hanya menggunakan satu
macam zat warna saja. Sedangkan pewarnaan difus yaitu pewarnaan di
mana zat warna yang diberikan akan mewarnai seluruh jaringan.
Hampir semua macam zat warna mempunyai pengaruh difus. Misalnya
safranin dan eosin. Apabila digunakan untuk mewarnai jaringan, akan
mewarnai seluruh sel atau jaringan, sehingga baik nukleus maupun
sitoplasma sama-sama terwarnai,hanya saja karena daya serap setiap
bagian tidak sama, maka terlihat ada perbedaan warna yang
ditunjukkan (Rudyatmi, 2015: 27-28).
D. Langkah Kerja
Mengering anginkan film darah pada rak pewarnaan datar yang
bersih.
Fiksasi permukaan film darah dengan cara mencelupkan ke dalam
metyl alcohol.
Metyl alkohol
Fiksasi II dengan cara mencelupkan film darah ke dalam staining
jar berisi larutan Giemsa
Mengering anginkan selama 5 menit
Metyl alkohol
Larutan Giemsa
Mengering anginkan selama 30-40 menit
Membersihkan film darah dengan aquades yang sudah dididihkan
kemudian di dinginkan .
Pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat dan
menganalisis hasilnya.
E. Hasil Pengamatan
Gambar Preparat Apus Darah Manusia (Perbesaran 40X10)
cbca
Keterangan gambar :a. Eritrosit b. Plasma darah c. Leukosit
Jenis leukosit kurang tampak jelas pada preparat.
Gambar Pembanding Preparat Apus Darah Pada Manusia
Keterangan gambar :EritrositNeutrofilEosinofilLimfosit K
abc
F. Pembahasan
Preparat apus darah merupakan preparat semi permanen. Secara
garis besar pembuatan preparat apus darah terbagi dalam dua tahap.
Pertama, pembuatan film darah tipis. Kedua, pewarnaan dengan metode
Romanowski.Pengamatan preparat apus darah manusia dengan metode
pewarnaan Romanowski dengan perbesaran 40x10, tampak eritrosit
paling banyak teramati dengan ukuran sel hampir sama. Morfologi sel
berbentuk cakram bikonkaf tanpa memiliki inti, sehingga tidak mampu
menyerap pewarna Giemsa yang bersifat basa. Kita ketahui bahwa inti
sel bersifat asam karena mengandung asam nukleat dan akan cenderung
terwarnai oleh zat warna yang bersifat basa.Eritrosit paling banyak
teramati pada preparat apus darah karena dalam setiap 1 mm3 darah
terdapat sekitar 5 juta eritrosit. Bentuk bikonkaf dari eritrosit
lebih menguntungkan bagi pelaksanaan fungsinya karena pertambahan
luas permukaannya menjadi 20-30% akan mempercepat proses absorbsi
dan pelepasan O2. Bentuk yang lebih pipih akan memperpendek jarak
antara pusat sel dengan lingkungannya sehingga dapat mempercepat
pertukaran oksigen. Tidak adanya intinya inti sel juga lebih
menguntungkan karena eritrosit akan memberikan tempat lebih banyak
bagi kandungan Hb sehingga oksigen lebih banyak diikat (Subowo,
2009:127). Sehingga bentuk eritrosit cakram bikonkaf dan tidak
berinti berkaitan dengan salah satu fungsinya yaitu untuk menunjang
pengikatan oksigen. Karena oksigen dibutuhkan tubuh dalam jumlah
besar untuk proses respirasi sel yang menghasilkan energi, maka
kandungan eritrosit dalam darah paling banyak.Ciri yang membedakan
antara eritrosit dan leukosit dalam pengamatan yaitu ada tidaknya
inti. Jika eritrosit tidak memiliki inti sel, sebaliknya dengan
leukosit memiliki inti sel yang akan terwarnai oleh zat warna basa
karena bersifat asam. Hasil pembuatan preparat apus darah yang
dibuat belum sempurna karena jenis sel leukosit seperti basofil,
eosinofil, netrofil, limfosit, dan monosit belum tampak pada
pengamatan di bawah mikroskop. Pada gambar pembanding, eosinofil
dicirikan dengan intinya hanya dua lobi yang dipisahkan oleh bahan
inti yang berbentuk sebagai benang. Sitoplasma berwarna warnanya
merah atau oranye (Subowo, 2008:95-97). Netrofil dicirikan intinya
berbentuk tidak bulat melainkan berlobus berjumlah 2-5 lobi bahkan
dapat lebih. Yang dimaksudkan dengan lobus yaitu bahan inti yang
terpisah-pisah tetapi masih dihubungkan oleh bahan inti yang
berbentuk benang. Inti terisi penuh oleh butir khromatin padat
sehingga sangat mengikat zat warna basa menjadi biru atau ungu
(Subowo, 2009:129). Terakhir limfosit dicirikan dengan mempunyai
inti bulat yang terkadang bertakik sedikit. Intinya tampak gelap
karena khromatinnya berkelompok dan tidak tampak nukleolus.
Sitoplasmanya yang sedikit tampak mengelilingi inti sebagai cincin
yang berwarna biru muda (Subowo, 2008:133-134). Pada gambar
pembanding tidak tampak adanya basofil dan monosit. Pada sediaan
apus darah basofil sulit ditemukan karena jumlahnya paling sedikit
diantara sel granulosit yaitu sekitar 0,5 %.Pewarnaan dengan metode
Romanowski merupakan metode pewarnaan difus dan tunggal. Artinya
metode ini menggunakan satu macam zat warna yaitu Giemsa fluka
(pewarna khusus darah) yang akan mewarnai seluruh jaringan. Karena
seluruh jaringan terwarnai, maka bentuk eritrosit dan leukosit
dapat dibedakan. Leukosit akan terwarnai ungu kebiruan pada bagian
inti karena pewarna giemsa bersifat basa, sehingga dapat terserap
oleh nukleus dengan baik. Sedangkan sitoplasma akan terwarnai ungu
muda.
G. Kesimpulan
1. Ada dua tahap dalam pembuatan preparat awetan darah manusia
yaitu pembuatan film darah tipis dan pewarnaan dengan metode
Romanoski.2. Pewarnaan apus dengan zat pewarna giemsa mewarnai sel
darah putih dengan kontras dan dapat membedakan bagian nukleus
dengan sitoplasmanya.3. Salah satu perbedaan antara eritrosit dan
leukosit adalah ada tidaknya inti.4. Jumlah eritrosit paling banyak
pada preparat apus karena keberadaanya di dalam tubuh penting dalam
penyediaan oksigen.H. Saran
1. Sebaiknya tetesan darah pertama dibersihkan karena biasanya
masih banyak mengandung plasma, sehingga tujuan praktikum untuk
mengamati sel sel penyusun darah mendapatkan hasil yang
memuaskan.2. Sebaiknya zat pewarna giemsa dibuat sesaat sebelum
praktikum, karena termasuk zat warna sementara yang tidak dapat
disimpan cukup lama jika sudah dibuat. Batas maksimal penyimpanan
zat warna giemsa adalah 3 hari setelah pembuatan.
Daftar Pustaka
Pujiyanto, Sri. 2008. Menjelajah Dunia Biologi 2. Solo : PT Tiga
Serangkai Pustaka MandiriRudyatmi E. 2015. Bahan Ajar Mikroteknik.
Semarang: Jurusan Biologi FMIPA UNNES.Subowo. 2009. Histologi umum.
Jakarta: PT. Bumi Aksara