Home >Education >Lap Prak Bio Mol 2010 Atang09007

Lap Prak Bio Mol 2010 Atang09007

Date post:12-Jul-2015
Category:
View:1,714 times
Download:2 times
Share this document with a friend
Transcript:

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

Oleh :A T A N GNIM : P2BA09007

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONALUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANPROGRAM PASCASARJANA BIOLOGI MAGISTER BIOLOGIPURWOKERTO2010

ACARA 1. ISOLASI DNA PLASMID

LANDASAN TEORIPlasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

TUJUANMengisolasi DNA Plasmid pUC19 dari E.coli JM109 menggunakan Kit QIAprep

BAHAN DAN ALAT1. E. coli JM109 yang didalamnya terdapat plasmid pUC192. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair3. Ampisilin4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)6. Tabung mikrosentrifuga7. Sarung tangan8. Seperangkat mikropipet beserta tip nya (Bio- Rad dan Axygen Scientific)9. Lemari pendingin 10. Kamera digital

CARA KERJA1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 diinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan dinkubasi di dalam shaker incubator dengan kecepatan rotasi 15C rpm pada suhu 370 C selama 16 jam (semalam)2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5700 x g selama 5 menit3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5700 x g selama 5 menit4. Pelet sel diresuspensi dengan 250 l Buffer P1 sampai homogen5. Suspensi ditambah 250 l buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-5 kali6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 l N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17.900 x g) selama 10 menit9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara dituang ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17.900 x g) selama satu menit10. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga11. QIAPrep spin column dicuci dengan 500 l PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 l buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1, 5 ml baru dan ditambah dengan 50 l buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 1 menit (elusi pertama)15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung sentrifuga 1, 5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 l buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 selama 1 menit (elusi kedua)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Secara umum, isolasi DNA plasmid menghasilkan DNA plasmid yang diinginkan. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan cara isolasi DNA plasmid pUC19 yang terdapat di dalam E. coli JM 109. Isolasi tersebut dilakukan berdasarkan kit dari Qiagen (USA), yaitu QIAprep Spin Miniprep Kit. Hasil yang diperoleh dapat diketahui dengan cara elektroforesis gel agarosa. Adapun hasil dari elektroforesis gel agarosa adalah sebagai berikut :

Komponen penting dalam eksperimen kloning gen adalah vektor yang membawa gen masuk sel inang dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai vektor suatu molekul DNA harus mampu memasuki sel inang serta mengadakan replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah yang besar. Salah satu vektor penting yang sering digunakan dalam kloning gen adalah plasmid. Plasmid adalah molekul DNA non kromosomal sirkuler yang terdapat bebas dalam sel bakteri.Ukuran plasmid berkisar antara 1 kb untuk yang terkecil dan lebih dari 250 kb untuk yang besar. Ukuran kurang dari 10 kb adalah yang terbaik untuk vektor kloning. Jumlah kopi menunjukkan jumlah molekul plasmid masing- masing yang biasanya ditemukan dalam satu sel bakteri, biasanya berkisar antara 1 sampai 50 atau lebih. Vektor kloning perlu ada dalam sel dengan banyak kopi sehingga dapat dihasilkan molekul DNA rekombinan dalam jumlah besar. Plasmid pUC19 adalah satu dari tujuh buah plasmid yang diketahui berada dalam sel Eschericia coli. Bakteri inang pembawa pUC19 ini ditumbuhkan dalam medium kompleks: Luria Bertani (LB) sebagai sumber DNA. Dalam medium LB pada suhu 370 C dengan pengocokan pada kecepatan 150-250 r/menit, sel E. coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai densitas maksimum kira-kira 2-3 x 109 sel/ml. E. coli JM109 dipanen, diambil 3 ml dan disentrifuse pada kecepatan 5700 x g selama 5 menit. Tujuan dari sentrifugasi ini adalah untuk mengendapkan bakteri pada dasar tabung karena untuk penyiapan ekstrak sel bakteri harus diperoleh dalam volume yang sekecil mungkin. Setelah didapatkan ekstrak sel, langkah pertama dalam proses isolasi DNA adalah perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri inang dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Pada praktikum acara ini, perusakan dinding sel dilakukan dengan pemberian STE sebanyak 1 ml kedalam pelet sel hasil sentrifugasi pertama. Pemurnian atau isolasi DNA plasmid menggunakan kit QIAprep ini menggunakan metode pemurnian berdasarkan konformasi DNA (dengan denaturasi alkali). Kebanyakan DNA plasmid berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilitan (supercoiled) atau disebut covalently closed circular (CCC) DNA. DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya. Molekul supercoiled ini jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara yaitu: denaturasi dengan alkali, dan pemurnian berdasarkan kerapatan apung (bouyant density) atau dikenal dengan istilah equilibrium density gradient centrifugation atau sentrifugasi isopiknik. Langkah berikutnya dalam isolasi DNA adalah lisis sel, dimana pada acara ini digunakan buffer P1 dan P2. Buffer P1 sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse A dan deterjen Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan indikator LyseBlue. RNAse dan SDS adalah kombinasi untuk tujuan perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH 12 -12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah. Untuk mengecek apakah denaturasi ini telah berhasil dengan baik atau tidak, maka penambahan P2 akan memperjelas proses ini. Apabila denaturasi telah terjadi, maka suspensi pelet sel akan berwana biru karena adanya reaksi dengan indikator LyseBlue. Proses re-naturasi selanjutnya dilakukan dengan cara mengembalikan DNA pada kondisi asam yaitu dengan penambahan buffer N3 yang mengandung asam asetat. Pemberian asam akan menyebabkan DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi, mengelompok dalam massa DNA linier yang kusut. Sentrifugasi selanjutnya pada kecepatan 13000 selama 10 menit akan mengendapkan massa DNA ini di dasar tabung sentrifugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatan. Penambahan RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris sel lainnya). Presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk menghilangkan sisa protein, tidak perlu dilakukan jika kita menggunakan metode denaturasi alkali.Supernatan berisi plasmid murni kemudian dicuci dua kali menggunakan buffer PB isinya mengandung isopropanol dan buffer PE yang mengandung 96 100% ethanol. Dari Qiaprep spin column, supernatan plasmid kemudian dipindahkan ke tabung mikrosentrifuse baru dan di elusi dua kali dengan buffer EB (Elution Buffer) dimana masing- masing melewati sentrifugasi pada 13000 rpm selama satu menit. Hasil elusi inilah DNA plasmid pUC19 yang telah berhasil kita isolasi dari E.coli JM109. Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA plasmid dapat dilakukan menggunakan kit yang telah tersedia (pabrikan), pada praktikum digunakan QIAprep Spin Miniprep Kit. Jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil isolasi dapat diketahui dengan elektroforesis gel agarosa.

ACARA 2. RESTRIKSI DNA PLASMID

LANDASAN TEORITeknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.

TUJUANMemotong DNA plasmid pUC19BAHAN DAN ALAT1. Plasmid pUC19 2. Enzim restriski (PstI)3. Microsentrifuga 5415D (Ep

Click here to load reader

Embed Size (px)
Recommended