Home >Documents >KULIT Induksi Nekrosis Sel Lemak Dalam Jaringan Lemak Manusia Setelah

KULIT Induksi Nekrosis Sel Lemak Dalam Jaringan Lemak Manusia Setelah

Date post:25-Jul-2015
Category:
View:142 times
Download:1 times
Share this document with a friend
Transcript:

Induksi nekrosis sel lemak dalam jaringan lemak manusia setelah pengobatan dengan fosfatidilkolin dan deoxycholateAbstrakLatar Belakang Suntikan dengan zat-fosfatidilkolin dan deoxycholate mengandung digunakan untuk mengobati lokal lemak akumulasi dan lipoma. Hal ini diyakini bahwa zat disuntikkan menginduksi kerusakan sel lemak dengan panniculitis akut selanjutnya diikuti dengan proses perbaikan jaringan lemak diobati. Tujuan Kami menyelidiki apakah nekrosis atau apoptosis sel-sel lemak diinduksi oleh zat disuntikkan. Metode Sampel dari jaringan lemak dari lipoma dikumpulkan pada berbagai waktu setelah injeksi dan dievaluasi oleh cahaya dan mikroskop elektron, dengan immunostaining untuk aktif caspase-3 dan antideoxyribonuclease I, di situ akhir pelabelan (TUNEL pewarnaan), dan caspase-3 biokimia tes. Hasil Light dan mikroskop elektron menunjukkan nekrosis sel lemak di seluruh wilayah di lipoma diobati. Rendahnya tingkat aktif caspase-3 menunjukkan tidak adanya apoptosis. Kesimpulan Injeksi dari fosfatidilkolin zat lipolitik dan deoxycholate menyebabkan nekrosis sel lemak bukan apoptosis. Namun, penelitian tambahan mengevaluasi dosis yang berbeda dan titik waktu yang lebih lanjut setelah pengobatan diperlukan.

PengenalanInjeksi lipolisis, juga disebut lipo-larut atau lemak larut, menjelaskan prosedur dalam kedokteran estetika yang bertujuan untuk pengurangan lokal lemak akumulasi dengan suntikan intralesi zat yang menginduksi kerusakan sel lemak. Yang paling sering produk yang digunakan terutama terdiri dari fosfatidilkolin (PC) dan natrium deoxycholate (DC) .1 Ia telah mengemukakan bahwa tidak ada enzimatik jalur lipolitik diinduksi oleh pengobatan ini, tetapi mengurangi volume setelah PC dan DC suntikan kemungkinan disebabkan dengan efek deterjen DC.2, 3 Studi tentang lipoma manusia telah menunjukkan bahwa injeksi PC dan DC menyebabkan kerusakan sel lemak, dengan panniculitis selanjutnya diikuti dengan reaksi fibrosis dari lemak, diperlakukan tissue.4 5 Pada awalnya, sebuah supuratif peradangan hadir, terdiri dari granulosit neutrophilic. Selama fase akut tingkat TNF-a, IL-4, IL-6, IL-8 dan IL-10 yang elevated.6 Para granulosit neutrophilic adalah kemudian digantikan oleh menyusup limfosit, yang akhirnya digantikan dengan granuloma lipophage, sel busa dan fibrosis.4 Meskipun reaksi kronologis yang terjadi di jaringan lemak manusia setelah injeksi lipolisis telah dijelaskan, kerusakan awal untuk manusia adipocytes belum substansial diselidiki. Oleh karena itu kami bertujuan untuk mengevaluasi apakah PC / DC suntikan menyebabkan sel lemak nekrosis atau apoptosis untuk lebih memahami mekanisme ini intervensi.

Bahan dan metode PasienSepuluh subyek (usia: 23a "36 tahun, 6 #, 4 $) dengan beberapa keluarga lipomatosis yang terdaftar dalam studi. Lipoma diobati dengan suntikan intralesi tunggal Lipostabil (Nattermann, Cologne, Jerman) (kisaran volume: 1A "3,5 mL). Substansi digunakan untuk injeksi mengandung campuran PC dan DC. Sebanyak 24 biopsi sampel dievaluasi, dengan 14 sampel dari diperlakukan lipoma dipotong 48 jam setelah injeksi dan 10 dari lipoma tidak diobati melayani sebagai kelompok kontrol. Empat dari 14 sampel biopsi lipoma itu diperlakukan diambil dari klinis cukup terpengaruh jaringan lemak, sisanya 10 dari jaringan sangat dipengaruhi, seperti ditunjukkan oleh warna kecoklatan. Selama lima pasien ini, kami mampu untuk melakukan studi longitudinal: kita mengumpulkan sampel di setelah titik waktu: 4 jam, 10 jam, 24 jam, 48 jam dan 10 minggu setelah injeksi. Semua pasien dan relawan memberikan persetujuan mereka. Studi 1 telah disetujui sesuai dengan Deklarasi Helsinki.

Cahaya mikroskop dan immunostaining melawan aktif caspase-3 dan DNase ISampel dari lipoma dipotong difiksasi dalam 10% (b / v) paraformaldehyde dilarutkan dalam fosfat-buffer saline (PBS) selama 24 jam dan kemudian ditanam dalam parafin, belah dan diwarnai dengan hematoksilin / eosin (HE). Deteksi imunohistokimia aktif caspase-3 adalah dicapai dengan afinitas-dimurnikan kelinci IgG (R & D Systems, Wiesbaden, Jerman, tidak ada katalog. AF835), yang mengikat subunit p17 caspase-3 manusia aktif. Demikian pula, bagian diwarnai dengan anti-DNase monoklonal I (deoxyribonuclease I) antibodi sebagai described.7 Bagian adalah deparaffinized, direhidrasi dan, setelah dicuci dalam PBS, diblokir dengan kambing 10% serum pada PBS. Setelah inkubasi dengan antibodi primer paling sedikit 12 jam pada 4? C, antibodi tidak terikat dihilangkan dengan mencuci slide lima kali dengan PBS. Selanjutnya, bagian diinkubasi dengan antibodi sekunder spesifik untuk antibodi primer (kambing antirabbit) ditandai untuk fosfatase alkali. Para chromogen Baru fuchsin (DAKO, tidak ada kode. K596) dipekerjakan untuk visualisasi, mengakibatkan reaksi fuchsia berwarna larut product.8 Counterstaining dicapai dengan hijau cepat, yang noda sitoplasma.

TUNEL PewarnaanUntuk terminal transferase deoxyribonucleotidyl dUTP nick endlabelling (TUNEL), bagian jaringan yang direhidrasi permeabilized dengan 0,5% (b "v) pepsin dilarutkan dalam HCl 0,01 M selama 10 menit pada 37 C, dan peroksidase endogen telah dipadamkan oleh 3% (v "v) H2O2 dilarutkan dalam metanol selama 5 menit pada RT. Pelabelan dari OHends 3a dengan nukleotida terbiotinilasi menggunakan terminal deoxyribonucleotidyl transferase (TDT) dilakukan dengan TDT dalam kit situ dari R & D Systems. Deteksi nukleotida dimasukkan dicapai menggunakan streptavidin "kompleks biotin konjugasi lobak peroksidase, mempekerjakan 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) sebagai chromogen substrat (Dako Cytomation, Hamburg, Jerman). Untuk memverifikasi fungsionalitas dari prosedur, kontrol positif dilakukan setelah pretreatment dari bagian dengan 10 lg "mL dimurnikan sapi pankreas DNase 1,9 bagian Stained

diperiksa menggunakan mikroskop cahaya, dan difoto dengan Axio- Cam HRC kamera digital menggunakan AxioVision 3.0 software (Zeiss, Goa ttingen, Jerman).

Mikroskop ElektronSemua sampel biopsi dari lipoma difiksasi dalam glutaraldehid 2,5% dan 2% paraformaldehyde di Na2HPO4 0,1 M / NaH2PO4 pada pH 7,0 untuk 2 hingga 4 jam. Postfixation dilakukan pada ferri osmium 1% selama 2 jam. Sampel kemudian didehidrasi dengan etanol dinilai dan tertanam dalam Epon (Serva, Heidelberg, Jerman) dengan propilen oksida sebagai media perantara. Slides dari 60 sampai 70 nm ketebalan yang terpasang pada Formvar berlapis grid tembaga (Plano, Wetzlar, Jerman). Bagian ultrathin diwarnai dengan uranil 1% asetat dan 0,66% sitrat utama (10 menit masing-masing) dan diperiksa di 80 kV dengan mikroskop elektron 420 EM Philips (Philips; Eindhoven, Belanda). Gambar dievaluasi dengan memperhatikan dengan karakteristik nekrosis atau apoptosis.

Analisis aktivasi caspase-3 oleh alat tes biokimia dan imunoblotingSampel biopsi juga dianalisis menggunakan uji biokimia caspase-3 sebagai indikator apoptosis. Biopsi sampel donor dicuci dengan PBS, kembali ditangguhkan dalam 5 mM TrisHCl, pH 8,0 dan 5 mM dan dithiothreitol terganggu oleh tiga siklus pembekuan dan pencairan. Homogenat disentrifugasi selama 20 menit pada 17 530 g, dan konsentrasi protein dari supernatan ( ~ kecepatan tinggi homogenates ) diukur seperti yang dijelaskan oleh Bradford. 10 Untuk assay enzim caspase-3 fluorogenic, 30 lg ini Glu-Val-Asp-7-amido4-methylcumarin diperoleh dari Alexis, Gru nberg, Jerman) dilarutkan dalam 600 lL 20 HEPES-OH pH mM, 7,5 gliserol, 10%, dan 5 mM DTT selama 5 jam pada 37 C. AMC rilis ditentukan dengan mengukur peningkatan fluoresensi dengan eksitasi dan emisi panjang gelombang 380 nm dan 460 nm, masing-masing, menggunakan Shimadzu RF 5001-PC spectrofluorophotometer sebagai dijelaskan oleh Stolzenberg aktivitas al.11 et caspase-3 spesifik dievaluasi dengan melakukan pengukuran tambahan di hadapan spesifik tetrapeptide DEVD caspase-3 menghambat (Ac-Asp-Glu-Val-Asp) pada 25 lM

Hasil Light-mikroskopis pengamatan HE-dan anticaspase-3 pewarnaanSemua sampel mengalami standar HE-dan immunostaining untuk aktif caspase-3 (Gambar 1), di samping itu, semua sampel menjadi sasaran untuk TUNEL, anti-DNase I dan Hoechst 33342 pewarnaan (Gbr. 3). Khas hasil untuk pewarnaan HE caspase-3 dan antiactive dari satu kontrol dan biopsi beberapa studi longitudinal ditunjukkan pada Gambar. 1. HE-pewarnaan menunjukkan adipocyte penyusutan dan kerusakan mulai dari 10 jam dan berlangsung hingga 48 jam setelah injeksi (panah kepala pada Gambar. 1c-d). Para antiactive caspase-3 pewarnaan negatif untuk bagian kontrol (Gbr. 1a ), tapi 4 jam setelah pengobatan kami mendeteksi sel endotel positif bernoda kecil pembuluh (panah pada Gambar 1b.). Sesekali kami juga mengamati positif adipocytes patri, seperti yang ditunjukkan dalam sampel diambil 48 jam setelah injeksi (panah pada Gambar. 1e). Namun, sebagian besar adipocytes masih negatif untuk aktif caspase-3 (Gambar 1).

Biokimia analisis untuk aktif caspase-3Untuk memverifikasi kurangnya aktivasi caspase-3 setelah injeksi Lipostabil, kita diuji homogenat jaringan untuk caspase-3 kegiatan dalam ketiadaan atau kehadiran caspase-3spesifik tetrapeptide hambat DEVD. Menggunakan prosedur yang rinci dalam Bahan dan metode, kita tidak mendeteksi adanya peningkatan yang signifikan dalam spesifik caspase-3 aktivitas di lipoma diperlakukan (Gambar 2a). Hasil ini lebih lanjut

Gambar 1 Hematoksilin "eosin (HE) dan pewarnaan imunohistokimia untuk aktif caspase-3 bagian dari parafin-embedded sampel lipoma sebelum dan setelah injeksi Lipostabil, dipotong pada titik waktu yang ditunjukkan dalam margin kiri. HE-pewarnaan (aa "f) dan sesuai antiactive caspase-3 pewarnaan (aa " fa ). Untuk rincian, lihat teks. Bar sesuai dengan 100 lm. didukung oleh Western blotting homogenat lipoma menggunakanantibodi terhadap caspase-3 aktif dan pro-caspase-3. Data diperoleh jelas menunjukkan tidak adanya 17 - dan 11 kDa khas aktif caspase-3 immunoreactive band (Gambar 2b) tetapi kegigihan dari band 35-kD

Click here to load reader

Embed Size (px)
Recommended