Konstruksi dan ekspresi gen -amilase B. aquimaris MKSC 6.2 rekombinan

Konstruksi dan ekspresi gen -amilase B. aquimaris MKSC 6.2 rekombinan

ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAGGTGCAGTTGAAAAAGAAGAACGAAAG M K R R V L S L I L V P F L L F Y A L P V G A V E K E E R KTGGCAGGATGAAACAATTTATTTCCTAATGGTAGATCGCTTTAACAATGGTGATCCAACAAATGATAAAGAAGTGAACACAAAGGATCCC W Q D E T I Y F L M V D R F N N G D P T N D K E V N T K D PAAGGCTTACCATGGCGGTGATTTCCAAGGGGTTATCGATCGATTGGATTACATCAAAGATATGGGATTCACTTCCATATGGCTGACTCCC K A Y H G G D F Q G V I D R L D Y I K D M G F T S I W L T PGTATTTGACAACCAGCCAAAAGGATACCATGGATATTGGATTACGGACTTTTATAAGACCGACGAGCATTTCGGTACGATGGAAACGTTC V F D N Q P K G Y H G Y W I T D F Y K T D E H F G T M E T FAAAAAGCTTGTAGAAGAAGCACATAAGCGGGATATGAAAGTCGTCCTTGATTTTGTGGTTAACCATGTGGGGCCGGAGCATCCCTGGGTG K K L V E E A H K R D M K V V L D F V V N H V G P E H P W VGATGACCCTGCAAAAGAAGACTGGTTCCACGAAAAACAGCCAATGAACTTCTCCGACAAAGAAAGTCTTCAGAACGCATGGCTGTATGAC D D P A K E D W F H E K Q P M N F S D K E S L Q N A W L Y DCTTCCTGATTTAAACACAGAGAATCCCGAAGTAAGGGAATATCTCTTTGATGCTGCCAAATGGTGGATCAAAGAAACGGATGTCGACGGT L P D L N T E N P E V R E Y L F D A A K W W I K E T D V D GTATCGTCTGGACACGGTGCGCCATGTTCCACAAGATTTTTGGAGTGATTTCAGTAAAGAAGTTAAATCAGTGAAAGACGATTTTTATCTT Y R L D T V R H V P Q D F W S D F S K E V K S V K D D F Y LCTTGGTGAAGTGTTTGATCGTGACCCACAGAAGATAGCAGAATATAACGATGTGGGTATCGATGGATTCGTTAATTTCCCCCAAGCTGAA L G E V F D R D P Q K I A E Y N D V G I D G F V N F P Q A EGAATTACGTTCAGTGTTTAACAAACCTGATACTTCAATGGACAGGTTGTTCAATTTCTGGAAGTACAATGAAACATTTTATGAAGATCCT E L R S V F N K P D T S M D R L F N F W K Y N E T F Y E D PTATTTGATGGGGACTTTTATAGACAACCATGATATGGAACGTTTTACACGTTTATTGGTACAGGAAAATGTTTTCCCTGGTACCCGTTGG Y L M G T F I D N H D M E R F T R L L V Q E N V F P G T R WAAACTCGCCTTGACATATATGTACACGACTCCGGGAATACCGATTGTGTATTATGGGTCTGAAATTGCCATGGATGGCGGGGAAGACCCG K L A L T Y M Y T T P G I P I V Y Y G S E I A M D G G E D PGATAACCGGCGGTTGATGAATTTCAGGGCCGACAAAGAACTGATTGATTACATTTCAAAACTGGGCAAGGTTCGAAAGGACTATCCTGCT D N R R L M N F R A D K E L I D Y I S K L G K V R K D Y P ATTGACAAGAGGAACGATAGAGCCGTTGTATGAACAAGACGGATTGGGAATATATAAACGCGCATACAAAGATCAAACGGTGGTTGTAGCC L T R G T I E P L Y E Q D G L G I Y K R A Y K D Q T V V V AATCAATAATTCCAGTGAGACCCAAACTGTCGAACTTGATGAAGGGGAGCTTGCTGATAACAATGAACTAAAAGGGTTACTTTCAGATGAC I N N S S E T Q T V E L D E G E L A D N N E L K G L L S D DCTGGTGAGAAGCGATGAAAACGGGACGTATAAAGTCGCTTTGGATCGTGAAGAAGCAGAGATTTATCTGCTTAAAGCCAAAAGTGGACTG L V R S D E N G T Y K V A L D R E E A E I Y L L K A K S G LAACATCCCATATTTATCAGCACTTGCTGCGGTGTATGTATTATTTTTATTATTTATTTATCTAGTATGGAAACGCGGAAGAAAAAACCGC N I P Y L S A L A A V Y V L F L L F I Y L V W K R G R K N RAAATCATAA 1539 bp K S . 512 aa

Urutan Gen -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2

Memperoleh protein yang diinginkan dalam jumlah yang cukup

DNA genomVektor ekspresi ligasi

Transformasi cloning host

PCR

Enzim restriksi

... .

. ....

....

. . .

. ...

... .

. ....

....

. . .

. ...

•Isolasi plasmid rekombinan•Analisis•Transformasi expression host

Enzim restriksi

ekspresi

Protein rekombinan

1. Promoter2. Rbs3. Start codon (ATG)4. Signal sequence ekspor ke periplasmik5. His-tag pemurnian

1 2

3

4

5

Merancang Primer

• Ujung 5’ primer diberi sisi restriksi

• Sisi restriksi harus ada pada mcs vektor tapi tidak ada pada gen.

• Sisi restriksi vektor dan gen harus kompatibel.

• Hasil rekombinasi harus in frame

Gen disisipkan pada multiple cloning site (mcs)

Compatibility

•blunt-blunt: selalu kompatibel

•blunt-sticky: tidak pernah kompatibel

•Pemotongan dengan enzim restriksi yang sama selalu kompatibel

Alu I AGCT AG CT TCGA TC GA

Cla I ATCGAT AT CGAT TAGCTA TAGC TA

Alu I AGCT AG CT AGAAA TCGA TC GA TCTTT

Dra I TTTAAA TTT AAA TTTCT AAATTT AAA TTT AAAGA

sticky-sticky: tidak kompatibel

Cla I ATCGAT AT CGAT TAGCTA TAGC TA

Hind III AAGCTT A AGCTT TTCGAA TTCGA A

sticky-sticky: kompatibel

Cla I ATCGAT AT CGAT ATCGG TAGCTA TAGC TA TAGCC

Hpa II CCGG C CGG CCGAT GGCC GGC C GGCTA

ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAMetLysArgArgValLeuSerLeuIleLeuValProPheLeuLeuPheTyrAlaLeuProVal

EcoRV GATATCATGAAAAGAAGAGTAC AspIleMetLysArgArgVal

NcoI CCATGGATGAAAAGAAGAGTAC MetAspGluLysLysSer

CCATGGTGAAAAGAAGAGTAC MetValLysArgArgVal

CCATGGTTATGAAAAGAAGAGTAC MetValMetLysArgArgVal

Vektor-T

• Hasil PCR dengan menggunakan Taq DNA polymerase memiliki ekor-A pada ujung 3’

• Vektor-T: vektor kloning, dilinearkan dengan enzim restriksi menghasilkan blunt-end kemudian ditempeli ekor-T pada ujung 3’

AA

TT

DNA genomDNA vektorligasi

Transformasi cloning host

PCR

Enzim restriksi

... .

. ....

....

. . .

. ...

... .

. ....

....

. . .

. ...

•Isolasi plasmid rekombinan•Analisis•Transformasi expression host

Enzim restriksi

ekspresi

Protein rekombinan

• Fragmen yg akan disisipkan mudah dideteksi

• Dapat di sekuensing untuk mengetahui benar/tidaknya sisi restriksi

M 1 2 3 4 5 6

M. Marker 1. pGEM-Insert/EcoRI/EcoRV2. pGEM-Insert/EcoRI3. pGEM-Insert/EcoRI/EcoRV4. PGEM-Insert/EcoRV5. -6. pGEM/EcoRI/EcoRV

ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAGGTGCAGTTGAAAAAGAAGAACGAAAG M K R R V L S L I L V P F L L F Y A L P V G A V E K E E R KTGGCAGGATGAAACAATTTATTTCCTAATGGTAGATCGCTTTAACAATGGTGATCCAACAAATGATAAAGAAGTGAACACAAAGGATCCC W Q D E T I Y F L M V D R F N N G D P T N D K E V N T K D PAAGGCTTACCATGGCGGTGATTTCCAAGGGGTTATCGATCGATTGGATTACATCAAAGATATGGGATTCACTTCCATATGGCTGACTCCC K A Y H G G D F Q G V I D R L D Y I K D M G F T S I W L T PGTATTTGACAACCAGCCAAAAGGATACCATGGATATTGGATTACGGACTTTTATAAGACCGACGAGCATTTCGGTACGATGGAAACGTTC V F D N Q P K G Y H G Y W I T D F Y K T D E H F G T M E T FAAAAAGCTTGTAGAAGAAGCACATAAGCGGGATATGAAAGTCGTCCTTGATTTTGTGGTTAACCATGTGGGGCCGGAGCATCCCTGGGTG K K L V E E A H K R D M K V V L D F V V N H V G P E H P W VGATGACCCTGCAAAAGAAGACTGGTTCCACGAAAAACAGCCAATGAACTTCTCCGACAAAGAAAGTCTTCAGAACGCATGGCTGTATGAC D D P A K E D W F H E K Q P M N F S D K E S L Q N A W L Y DCTTCCTGATTTAAACACAGAGAATCCCGAAGTAAGGGAATATCTCTTTGATGCTGCCAAATGGTGGATCAAAGAAACGGATGTCGACGGT L P D L N T E N P E V R E Y L F D A A K W W I K E T D V D GTATCGTCTGGACACGGTGCGCCATGTTCCACAAGATTTTTGGAGTGATTTCAGTAAAGAAGTTAAATCAGTGAAAGACGATTTTTATCTT Y R L D T V R H V P Q D F W S D F S K E V K S V K D D F Y LCTTGGTGAAGTGTTTGATCGTGACCCACAGAAGATAGCAGAATATAACGATGTGGGTATCGATGGATTCGTTAATTTCCCCCAAGCTGAA L G E V F D R D P Q K I A E Y N D V G I D G F V N F P Q A EGAATTACGTTCAGTGTTTAACAAACCTGATACTTCAATGGACAGGTTGTTCAATTTCTGGAAGTACAATGAAACATTTTATGAAGATCCT E L R S V F N K P D T S M D R L F N F W K Y N E T F Y E D PTATTTGATGGGGACTTTTATAGACAACCATGATATGGAACGTTTTACACGTTTATTGGTACAGGAAAATGTTTTCCCTGGTACCCGTTGG Y L M G T F I D N H D M E R F T R L L V Q E N V F P G T R WAAACTCGCCTTGACATATATGTACACGACTCCGGGAATACCGATTGTGTATTATGGGTCTGAAATTGCCATGGATGGCGGGGAAGACCCG K L A L T Y M Y T T P G I P I V Y Y G S E I A M D G G E D PGATAACCGGCGGTTGATGAATTTCAGGGCCGACAAAGAACTGATTGATTACATTTCAAAACTGGGCAAGGTTCGAAAGGACTATCCTGCT D N R R L M N F R A D K E L I D Y I S K L G K V R K D Y P ATTGACAAGAGGAACGATAGAGCCGTTGTATGAACAAGACGGATTGGGAATATATAAACGCGCATACAAAGATCAAACGGTGGTTGTAGCC L T R G T I E P L Y E Q D G L G I Y K R A Y K D Q T V V V AATCAATAATTCCAGTGAGACCCAAACTGTCGAACTTGATGAAGGGGAGCTTGCTGATAACAATGAACTAAAAGGGTTACTTTCAGATGAC I N N S S E T Q T V E L D E G E L A D N N E L K G L L S D DCTGGTGAGAAGCGATGAAAACGGGACGTATAAAGTCGCTTTGGATCGTGAAGAAGCAGAGATTTATCTGCTTAAAGCCAAAAGTGGACTG L V R S D E N G T Y K V A L D R E E A E I Y L L K A K S G LAACATCCCATATTTATCAGCACTTGCTGCGGTGTATGTATTATTTTTATTATTTATTTATCTAGTATGGAAACGCGGAAGAAAAAACCGC N I P Y L S A L A A V Y V L F L L F I Y L V W K R G R K N RAAATCATAA 1539 bp K S . 512 aa

Urutan Gen -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2

Konstruksi vektor ekspresi rekombinan

Sel inang: E. coli

Primer PCR• Forward:

gatatcGAAGAACGAAAGTGGCAG • Reverse:

gaattcGATTTGCGGTTTTTTCTTCCG

5000 pb

4000 pb

3000 pb

2000 pb

1500 pb

Analisis plasmid rekombinan

• Analisis restriksi ada atau tidak insert

• Sekuensing apakah urutannya benar

6900 pb5400 pb1500 pb

Sel Inang

• Cloning host E. coli: TOP10, JM101, JM109, DH5, DH10β

• Expression host E. coli: BL21, origami, rosetta

Induksi: 0,5 mM IPTG selama 4 jamSDS-PAGE: 12%

M T0 T4

7295

55

43

34

26

Metoda: FuwaSubstrat: 0,125% patiInkubasi: 30 menitSuhu: 50 oCpH: 7 (Na-fosfat)

Kontrol Sampel

Ekspresi gen α-amilase B. aquimaris dalam E. coli BL21