kolom cepat

LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

KROMATOGRAFI KOLOM CEPAT

KELOMPOK 4

PENYUSUN:

Amalia Ayuningtyas (105070500111022)

Zulkarnaen (105070500111023)

Rangga Adi Wijaya (105070500111024)

Dilah Rahmah R (105070500111027)

Irwinda Grafiyan P (105070500111028)

Oktavia Rahayu A (105070500111029)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

Eluen

Dilakukan optimasi eluen dengan uji KLT untuk mengetahui komposisi eluen yang memberikan pemisahan yang baikDigunakan untuk kolom cepat

Hasil

Silica gel 60 GF 254 Ekstrak

Ditimbang sebanyak 15 gram menggunakan cawan porselenDiratakan pada kolom cepat dengan cara ditekan pelan-pelan hingga ketinggian silica ¾ dari tinggi kolom sambil dinyalakan vakumDimasukkan n-heksana sebanyak 20 ml dan dinyalakan vakumDitampung tetesan n-heksena sampai habis

Ditimbang sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakanDilarutkan dalam metanol 2 mlDitambahkan silica kristal hingga keringDimasukkan ke dalam kolomDinyalakan vakum

I. TUJUAN

Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi ekstrak dengan menggunakan

kromatografi kolom cepat.

II. METODOLOGI

2.1. Alat dan bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu seperangkat alat vakum,

kromatografi kolom cepat, timbangan analitik, vial, gelas ukur, kaca arlogi, kertas

perkamen, plat KLT, spektrofotometri UV-VIS. Sedangkan bahan yang digunakan

yaitu silica gel 60 GF254, n- heksana, etil asetat, metanol.

2.2 Skema Kerja

- Ditambahkan satu lapis fase diam dan dinyalakan vakum- Ditambahkan n-heksana 20 ml, dinyalakan vakum dan ditampung tetesan

n-heksana sampai habis- Ditambahkan n-heksana: etil asetat (9:1 = 18 ml: 2 ml), dinyalakan vakum

dan ditampung tetesan sampai habis- Ditambahkan n-heksana: etil asetat (8:2 = 16 ml: 4 ml), dinyalakan vakum

dan ditampung tetesan sampai habis

Ditambahkan n-heksana: etil asetat (7:3 = 14 ml: 6 ml), dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habisDitambahkan n-heksana: etil asetat (6:4 = 12 ml: 8 ml), dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habisDitambahkan n-heksana: etil asetat (5:5 = 10 ml: 10 ml), dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habisDitambahkan n-heksana: etil asetat (4:6 = 8 ml: 12 ml), dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habisDitambahkan n-heksana: etil asetat (3:7 = 6 ml: 14 ml), dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habisDitambahkan n-heksana: etil asetat (2:8 = 4 ml: 16 ml), dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habisDitambahkan n-heksana: etil asetat (1:9 = 2 ml: 18 ml), dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habisDitambahkan etil asetat 20 ml, dinyalakan vakum dan ditampung tetesan sampai habis

Hasil tampungan

Dilakukan KLT pada tiap hasil tampung menggunakan eluen n-heksana

Hasil

III. DATA PENGAMATAN

NO PERLAKUAN PENGAMATAN

1 Cawan porselen kosong

ditimbang

Terdapat berat cawan porselen kosong sebesar

40,1886 gram

2 Silica gel ditimbang sebanyak

15 gram

Terdapat berat silica gel sebanyak 15 gram

pada cawan porslen

3 Disiapkan alat kolom cepat

dengan menghubungkan antara

vakum dengan labu fitrat lalu

alat dihubungkan dengan

sumber listrik

Terdapat alat kolom cepat yang siap dipakai

4 Silica gel sebanyak 3 spatula

dimasukkan ke dalam kolom

Terdapat alat kolom cepat berisi silica gel

lalu dipasangkan pada labu

filtrat

5 Vakum dinyalakan dan silica

gel ditekan tekan dengan tabung

reaksi secara perlahan hingga

merata di dalam kolom

Silica gel rata di dalam kolom

6 Vakum dimatikan lalu langkah

no 4 dan 5 diulangi hingga

ketinggian silica mencapai ¾

tinggi kolom

Terdapat silica gel rapat di dalam kolom

dengan ketinggia ¾ dari kolom

7 Ditambahkan n-heksana 20 ml

ke dalam kolom, ditunggu

hingga turun

Eluen (n-heksana) turun

8 Ekstrak ditimbang sebanyak

0,13 gram

Terdapat ekstrak sebanyak 0,13 gram

9 Metanol diukur sebanyak 3 ml Terdapat metanol sebanyak 3ml

10 Silica gel ditimbang sebanyak 4

gram

Terdapat Silica gel sebanyak 4 gram

11 Ekstrak+metanol di dalam

porslen diaduk hingga homogen

Terdapat Ekstrak+metanol di dalam porslen

homogen

12 (11)+serbuk silica ad homogen

dan kering

Terdapat Ekstrak+metanol di dalam porslen

homogen dan kering

13 (12) ditambahkan dengan silica

gel hingga serbuk ekstrak

tertutup

Terdapat Ekstrak tertutup silica gel

14 (13) dimasukkan n-heksan 20

ml

Terdapat eluen pertama di dalam kolom

15 Tetesan dari kolom dari vial

ditampung hingga habis

Terdapat vial 1 terisi tetesan dari kolom

16 Ditambahkan eluen kedua yaitu

n heksana:etil asetat (9:1) dan

ditampung tetesan dari vial

hingga habis



17 Ditambahkan eluen ketiga yaitu



hingga habis



18 Ditambahkan eluen ke-4 yaitu n

heksana:etil asetat (7:3) dan


hingga habis






hingga habis






hingga habis








hingga habis




hingga habis






hingga habis



24 Ditambahkan eluen ke-10 yaitu



hingga habis



25 Masing masing vial diberi label

1-10

26 Masing-masing vial berlabel 1-5

ditotolkan pada lempeng KLT

sebanyak 6 totolan

menggunakan pipa kapiler

Terdapat totolan tidak berwarna sebanyak 6

totolan masing masing terhadap tetesan pada

vial berlabel 1-5

27 Masing-masing vial berlabel 6-

11 ditotolkan pada lempeng

KLT sebanyak 4 totolan

menggunakan pipa kapiler

Terdapat totolan berwarna kuning sebanyak 4

totolan masing masing terhadap tetesan pada

vial berlabel 6-11

28 Membuat eluen dengan

mencampurkan antara

kloroform:ethanol:asam asetat

glacial dengan perbandingan

(95:5:1) sebanyak 20ml,

dimasukkan ke dalam chamber,

dimasukkan kertas saring

hingga jenuh

eluen kloroform:ethanol:asam asetat glacial

dengan perbandingan (95:5:1) sebanyak 20ml

terdapat di dalam chamber, dan telah jenuh

29 Lempeng KLT yang telah di

totol dengan tetesan dari

masing-masing vial dimasukkan

ke dalam chamber yang berisi

eluen lalu di eluasi sampai pada

batas atas lempeng KLT

30 Lempeng KLT yang telah

selesai di eluasi di keringkan di

lemari asam

31 Diamati dibawah sinar UV UV = 254 nm

Keterangan:

1 = Larutan standar

2 = Senyawa curcumin (fraksi 7)



UV = 365 nm

41 2 3

51 3 42

Keterangan:

1 = Larutan standar

2 = Minyak atsiri(fraksi 4 & 5)




Perhitungan Rf:

Rf standar :

Rf 1 = 1,2/8 = 0,15

Rf 2 = 2/8 = 0,25

Rf 3 = 3,8/8 = 0,475

Pada fraksi 4 :

Rf 1 = 7,3/8 = 0,9125

Pada fraksi 5 :

Rf 1 = 7,3/8 = 0,9125

Pada fraksi 7 :

Rf 1 = 0,8/8 = 0,1

Rf 2 = 1,7/8 = 0,2125

Rf 3 = 4,3/8 = 0,5375

Pada fraksi 8 :

Rf 1 = 0,8/8 = 0,1

Rf 2 = 1,6/8 = 0,2

Rf 3 = 4,1/8 = 0,5125

Pada fraksi 9 :

Rf 1 = 0,6/8 = 0,075

Rf 2 = 1,5/8 = 0,1875

Rf 3 = 3,9/8 = 0,4875

Pada fraksi 10 :

Rf 1 = 0,7/8 = 0,0875

Rf 2 = 1,5/8 = 0,1875

Rf 3 = 2,3/8 = 0,2875

Rf 4 = 3,9/8 = 0,4875

IV. PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Mekanisme kerja dari kromatografi kolom adalah pemisahan suatu senyawa

dalam kolom kromatografi dengan silica gel sebagai fasa diam dan campuran pelarut

polar-non polar sebagai fasabgerak yang akan mengeluasi sampel, eluen bergerak turun

dan mengeluasi sampel digerakkan oleh daya gravitasi bumi. Eluen yang digunakan

pada percobaan ini adalah n-heksana dan etil asetat. N-heksana bersifat non polar dan

etil asetat bersifat polar. Eluen akan mengeluasi sampel kunyit menuju bawah (keluar

kolom menuju vial). Fasa diam (silica gel) memiliki daya absorbsi yang cukup besar

sehingga ketika eluen yang membawa sampel melewati fasa diam akan terbentuk fraksi-

fraksi warna yang berbeda. Semakin pekat warna fraksi maka semakin banyak senyawa

atau zat aktif yang dipisahkan dalam fraksi tersebut.

Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan alat-alat yang akan

digunakan yaitu seperangkat alat vakum, kromatografi kolom, timbangan analitik, vial,

kertas perkamen, spektrofotometri UV, chamber, pipa kapiler, pipet tetes, gelas ukur,

gelas beaker, gelas arloji, batang pengaduk, pinset, kertas saring, lempeng KLT, tissue,

pensil, penggaris dan cawan porselen. Alat vakum digunakan untuk mempercepat

pemampatan dalam pembentukan fase diam dan juga untuk mempercepat aliran fase

gerak pada fase diam, kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan komponen

yang ada pada ekstrak menjadi beberapa fraksi (fraksinasi ekstrak), timbangan analitik

digunakan untuk menimbang ekstrak dan silica, vial digunakan untuk menampung hasil

fraksinasi, chamber digunakan untuk meletakkan eluen dan lempeng KLT sehingga

totolan dapat naik, pipa kapiler digunakan untuk menotolkan larutan ekstrak pada

lempeng KLT, pipet tetes digunakan untuk mengambil larutan, gelas ukur digunakan

untuk mengukur larutan yang akan digunakan, gelas beaker digunakan sebagai wadah

dari larutan yang telah diambil, gelas arloji digunakan sebagai penutup chamber dan

wadah dalam penimbangan ekstrak, cawan porselen digunakan sebagai wadah dalam

penimbangan ekstrak, batang pengaduk digunakan untuk mengaduk (meratakan)

campuran dan mengambil ekstrak, pinset digunakan untuk mengambil lempeng KLT,

spektrofotometer UV digunakan untuk melihat noda pada lempeng KLT sehingga dapat

diidentifikasi senyawa yang ada, lempeng KLT digunakan sebagai tempat menaiknya

totolan sehingga dilihat nodanya pada spektrofotometer UV, tissue digunakan untuk

membersihkan alat-alat, penggaris dan pensil digunakan untuk memberi tanda batas atas

dan batas bawah pada lempeng KLT. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu ekstrak

kunyit (Curcuma domestica), silica gel 60 GF254, n- heksana, etil asetat dan metanol.

Ekstrak kunyit (Curcuma domestica) merupakan ekstrak yang akan difraksinasi, silica

gel merupakan fase diam yang digunakan pada kromatografi kolom. Silica gel 60

GF254 dengan G melambangkan Gypsum (CaSO4), F melambangkan floroscene dan

angka 254 menunjukkan besarnya panjang gelombang, yaitu 254 nm. metanol

digunakan untuk melarutkan ekstrak, sedangkan n- heksana dan etil asetat merupakan

komposisi dari eluen yang akan digunakan (fase gerak).

Silica gel ditimbang sebanyak 15 gram dalam cawan porselen menggunakan

timbangan digital (neraca analitik). Kemudian disiapkan alat kolom cepat dengan

menghubungkan antara vakum dengan labu fitrat lalu alat dihubungkan dengan sumber

listrik. Setelah alat terangkai, silica gel sebanyak 3 spatula dimasukkan ke dalam kolom

lalu dipasangkan pada labu filtrat. Vakum dinyalakan dan silica gel ditekan

menggunakan tabung reaksi secara perlahan hingga merata di dalam kolom. Vakum

dimatikan kemudian langkah diatas diulangi hingga ketinggian silica mencapai ¾ tinggi

kolom. Setelah itu ditambahkan n-heksana sebanyak 20 ml ke dalam kolom dan

ditunggu hingga turun. Hal ini dilakukan untuk pengkondisian kromatografi kolom

sebelum dilakukan fraksinasi ekstrak.

Ekstrak kunyit (Curcuma domestica) ditimbang sebanyak 0,13 gram di dalam cawan

porselen menggunakan timbangan digital dan metanol diukur sebanyak 3 ml

menggunakan gelas ukur. Silica gel ditimbang sebanyak 4 gram dalam cawan porselen

menggunakan timbangan digital. Kemudian ekstrak dilarutkan dalam metanol pada

cawan poselen dan diaguk hingga homogen menggunakan batang pengaduk. Ekstrak

tersebut ditambahkan serbuk silica kering dan diaduk hingga homogen dan ekstrak

menjadi kering kembali. Sebelum dilakukan fraksinasi, disiapkan 11 macam eluen yang

akan digunakan, seperti pada tabel berikut:

FraksiVolume eluen yang digunakan (ml)

n-heksana Etil asetat

1 20 -

2 18 2

3 16 4

4 14 6

5 12 8

6 10 10

7 8 12

8 6 14

9 4 16

10 2 18

11 - 20

Ekstrak kering dimasukkan ke dalam kolom hingga rata dengan dinyalakan

vakum. Kemudian ditambahkan satu lapis fase diam dan dinyalakan vakum. Eluen

pertama yaitu n-heksana sebanyak 20 ml dimasukkan ke dalam kolom, dinyalakan

vakum dan ditampung tetesan n-heksana pada vial 1 sampai habis. Setelah itu

ditambahkan eluen kedua yaitu n heksana:etil asetat (9:1), dinyalakan vakum dan

ditampung tetesan pada vial 2 hingga habis. Kemudian dikondisikan kembali dengan n-

heksana, hal ini diulangi setiap akan dilakukan pergantian eluen pada kolom. Hal yang

sama dilakukan pada eluen ketiga hingga kesebelas dan masing-masing hasil ditampung

pada masing masing vial (vial 1-11). Dalam proses pemisahan dengan kromatografi

kolom, adsorben silica gel harus senantiasa basah karena jika dibiarkan kering, kolom

yang terbentuk bisa retak sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain

itu, adsorben yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses eluasi dalam

kolom

Pada dasarnya, curcumin banyak terdapat pada kunyit sehingga dapat dipastikan

dari setiap fraksi yang diperoleh memiliki kandungan curcumin. Untuk menguji

keberadaan curcumin maka dilakukan metode pemisahan dengan kromatografi lapis

tipis (KLT). Pada praktikum ini digunakan dua kromatografi, yaitu kromatografi kolom

cepat dan kromatografi lapis tipis. Setelah didapatkan 11 fraksi, dilakukan identifikasi

senyawa menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Eluen yang digunakan adalah

kloroform:ethanol:asam asetat glacial dengan perbandingan 95:5:1 sebanyak 20ml.

Eluen yang telah dibuat kemudian dimasukkan ke dalam chamber . Setelah itu, kertas

saring disiapkan dengan ukuran 2 cm x 10 cm. Kertas saring ini dimasukkan ke dalam

chamber lalu ditutup dan dibiarkan hingga jenuh (eluen naik dalam seluruh bagian

kertas saring).

Dalam waktu yang bersamaan, dilakukan penotolan masing-masing fraksi pada

lempeng KLT. Namun sebelumnya, pipa kapiler dicuci terlebih dahulu dengan metanol

dengan cara menotolkan metanol pada tissue. Kemudian disiapkan 2 buah lempeng

KLT, diberi tanda batas bawah (1,5 cm) dan batas atas (0,5 cm). Fraksi 1-5 ditotolkan

pada lempeng KLT pertama sebanyak 6 μL (6 kali penotolan) menggunakan pipa

kapiler. Sedangkan fraksi 6-11 ditotolkan pada lempeng KLT kedua sebanyak 4 μL (4

kali penotolan) menggunakan pipa kapiler. Masing-masing lempeng KLT dimasukkan

ke dalam chamber dan diamati totolan tersebut hingga naik mencapai tanda batas atas.

Setelah sampai tanda batas atas, lempeng KLT diambil menggunakan pinset dan

dibiarkan kering pada lemari asam. Noda yang tampak diamati secara visual, kemudian

menggunakan UV 254 dan 366 nm untuk melihat noda lebih jelas

4.2 Analisa hasil

Dari hasil kromatografi kolom didapatkan 11 buah fraksi. Sedangkan dari hasil

kromatografi lapis tipis didapatkan noda berwarna kuning sedikit orange yang diamati

secara visual. Jika diamati menggunakan spektrofotometer UV 254 nm, terdapat tampak

noda pada fraksi 7,8 dan 9. Sedangkan pada panjang gelombang 366 nm terlihat tampak

noda pada fraksi 4,5,7,8 dan 9. Ada tidaknyanya noda yang tampak dipengaruhi oleh

komposisi eluen yang digunakan. Pada praktikum ini, eluen pada fraksi 7,8 dan 9

merupakan eluen yang paling sesuai digunakan untuk pemisahan senyawa curcumin

pada ekstrak kunyit. Fraksi 1 -5 menggunakan eluen dengan komposisi n-heksana yang

lebih banyak daripada etil asetat sehingga fasa gerak yang digunakan bersifat non-polar.

Fase gerak yang bersifat non-polar ini tidak dapat menarik komponen lain pada ekstrak,

karena senyawa curcumin bersifat polar dan fasa diam yang digunakan dalah polar

sehingga senyawa curcumin tidak mengalami eluasi yang optimal. Hal ini sesuai dengan

teori like dissolve like dimana senyawa yang bersifat polar akan larut pada senyawa

yang bersifat polar, begitu pula sebaliknya sehingga pada pengamatan menggunakan

sinar UV 366 nm tidak tampak noda pada lempeng KLT. Namun pada pengamatan

menggunakan sinar UV 254 nm, terdapat noda berwarna biru tua, yaitu minyak atsiri.

Eluen pada fraksi 4 dan 5 kondisinya bersifat non polar, sehingga eluen tersebut hanya

bisa memisahkan komponen yang bersifat non polar yaitu minyak atsiri.

Keterangan:

1 = Larutan standar




Gambar 1. Hasil Kromatogram pada UV 254 nm.

41 2 3

Keterangan:

1 = Larutan standar

2 = Minyak atsiri (fraksi 4 & 5)




Gambar 2. Hasil Kromatogram pada UV 366 nm.

Fraksi 6-9 merupakan fraksi semipolar karena komposisi eluen yang digunakan

menyebabkan fasa gerak yang digunakan bersifat semipolar sehingga dapat menarik

komponen polar yang terdapat pada ekstrak kunyit (fraksi 7,8 dan 9). Sedangkan fraksi

10 dan 11 merupakan fraksi yang sangat polar karena komposisi eluennya mengandung

etil asetat yang lebih banyak daripada n-heksana. Pada fraksi 10 terlihat noda kuning

yag samar, sedangkan pada fraksi 11 terlihat noda yang sangat samar (hampir tidak

kelihatan).

Dari hasil KLT yaitu pada fraksi 7,8 dan 9 diperoleh 3 buah noda yang tampak

pada lempeng KLT. Hal ini menunjukkan adanya 3 komponen utama yang terkandung

pada senyawa curcumin tersebut. Senyawa curcuminoid tersebut adalah curcumin,

demethoxycurcumin dan bis-demethoxycurcumin. Senyawa curcumin dapat mengalami

penurunan dengan lepasnya gugus –OCH3 dalam setiap penurunan. Curcumin akan

mengalami dua kali penurunan. Turunan pertamanya adalah demethoxycurcumin dan

turunan keduanya adalah bis-demethoxycurcumin. Curcumin akan terelusi paling akhir

(berada paling bawah) karena sifatnya yang polar. Ketika senyawa curcumin mengalami

degradasi, akan menjadi senyawa demethoxycurcumin (terdapat pada bagian tengah)

yang lebih polar dari curcumin karena telah kehilangan sebuah gugus –OCH3.

Sedangkan bis-demethoxycurcumin merupakan turunan kedua dari curcumin yang tidak

51 3 42

mengandung gugus –OCH3 sehingga senyawa ini bersifat paling polar dari ketiga jenis

senyawa curcumin sehingga senyawa ini akan tereluasi terlebih dahulu (berada pada

lapisan yang paling atas) karena fasa diam yang digunakan (silica gel) bersifat polar.

Jika diurutkan berdasarkan kepolarannya, 3 buah noda yang terdapat pada

lempeng KLT fraksi 7,8 dan 9 adalah senyawa curcumin, demethoxycurcumin dan

bisdemethoxycurcumin dimana senyawa yang paling bawah adalah senyawa yang paling

polar dibandingkan senyawa curcuminoid lainnya yaitu bisdemethoxycurcumin, noda

yang ditengah adalah demethoxycurcumin dan yang paling atas adalah curcumin. Noda

tersebut diidentifikasi senyawanya berdasarkan harga Rf yang menunjukkan kecepatan

migrasi suatu senyawa pada kromatogram. Dari hasil perhitungan Rf, pada Rf noda

pada fraksi 7 dari noda paling atas ke bawah adalah 0,1; 0,2125 dan 0,5375. Sedangkan

Rf noda pada fraksi 8 dari noda paling atas ke bawah adalah 0,1; 0,2 dan 0,5125. Rf

noda pada fraksi 9 dari noda paling atas ke bawah adalah 0,075; 0,1875 dan 0,4875. Rf

senyawa standar adalah Rf 1 = 1,2/8 = 0,15; 0,25 dan 0,475. Sedangkan pada literatur,

diketahui Rf noda pada ekstrak Curcuma domestica pada sinar UV 365 nm adalah ~ 0,6

yang menunjukkan senyawa curcumin; demethoxycurcumin dengan nilai Rf berkisar

0,5-0,55; dan bisdemethoxycurcumin dengan nilai Rf ~ 0,3. Dari nilai Rf yang didapat

pada percobaan lebih kecil daripada Rf pada literatur,namun hampir sama dengan Rf

standar. Berdasarkan kepolarannya dan harga Rf dapat dipastikan bahwa pada fraksi 7,8

dan 9 mengandung senyawa curcuminoid yaitu curcumin, demethoxycurcumin dan

bisdemethoxycurcumin.

Gambar 3. Senyawa curcuminoid (Wagner and Bladt, 1996).

Gambar 4. Senyawa curcumin (Wagner and Bladt, 1996).

Gambar 5. Senyawa bisdemethoxycurcumin (Wagner and Bladt, 1996).

V. KESIMPULAN

Pada praktikum ini, didapatkan 11 fraksi ekstrak Curcuma domestica dengan

menggunakan kromatografi kolom cepat dan diidentifikasi dengan kromatografi lapis

tipis. Eluen yang dapat memisahkan komponen senyawa dengan baik yaitu eluen pada

fraksi 7,8, dan 9. Sedangkan fraksi 4 dan 5 hanya bisa memisahkan minyak atsiri saja.

Pada fraksi 7,8 dan 9 terdapat senyawa curcuminoid yaitu curcumin,

demethoxycurcumin dan bisdemethoxycurcumin.

DAFTAR PUSTAKA

Wagner H, Bladt S. 1996. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas 2nd

Edition. New York: Springer.

kolom cepat

Documents