Top Banner
KLONING GEN (DNA RECOMBINAN) (DNA RECOMBINAN)- (REKAYASA GENETIK) (REKAYASA GENETIK)
79

Kloning gen

Jul 02, 2015

Download

Education

Syarif Hamdani

materi bioteknologi
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Kloning gen

KLONING GEN(DNA RECOMBINAN)(DNA RECOMBINAN)--(REKAYASA GENETIK) (REKAYASA GENETIK)

Page 2: Kloning gen

Kloning - definisi

Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan

tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)

Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya

Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Page 3: Kloning gen

Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan

memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)

yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan

DNA yang kompleks.

Page 4: Kloning gen

Kloning Gen

Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut

Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

Page 5: Kloning gen

Tujuan mengklon Gen Menentukan urutan basa nukleotida penyusun

gen tersebut Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa

nukleotida pengendali gen tersebut Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang

disandi gen tersebut Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada

kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan

Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Page 6: Kloning gen

Sumber DNA untuk diklon

DNA kromosom cDNA (complementary DNA) yang disintesis

menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)

DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

Page 7: Kloning gen

Mensintesis cDNA

Page 8: Kloning gen

Perbanyakan DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)

Page 9: Kloning gen

Bahan / Alat untuk Mengklon

Enzim endonuklease restriksi Enzim ligase Vektors (Pembawa) Inang (Host) Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

Page 10: Kloning gen

Memotong DNA Menggunakan enzim

endonuklease restriksi Ujung “lengket” (sticky ends) Ujung “tumpul” (blunt ends)

Penamaan enzim EcoRI E = genus (Escherichia) co = species (coli) R = strain I = # of enzyme

Page 11: Kloning gen

Ujung “lengket” dan “tumpul” (Blunt & Sticky ends)

Page 12: Kloning gen

Penyambungan (pasting) DNA

Pembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)

Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA

Page 13: Kloning gen
Page 14: Kloning gen

Vektor untuk Mengklon

Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut

Page 15: Kloning gen

Plasmid

DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad

Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

Page 16: Kloning gen

Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki:

Replikator (origin of replication) Penanda (Marker) yang mudah diseleksi

(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik) Situs untuk mengklon (potongan DNA yang

memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda

Vektor untuk Mengklon

Page 17: Kloning gen

Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli

Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Page 18: Kloning gen
Page 19: Kloning gen

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)

Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain

Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan

Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"

Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

Page 20: Kloning gen
Page 21: Kloning gen

Kloning Terorientasi

Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu

Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda

Page 22: Kloning gen
Page 23: Kloning gen

Vektor untuk Mengklon

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga

3 Cosmid

4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)

& YAC (Yeast Artificial Chromosome)

Page 24: Kloning gen

1. Memiliki origin of replication dari inang yang

dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara

independen terhadap genom inang.

2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel

pembawa plasmid tersisipi DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik ganda

penapisan biru-putih

3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple

cloning sites, MCS)

4. Mudah diisolasi dari sel inang.

Vektor berupa Plasmid

Page 25: Kloning gen

Multiple Cloning Site (MCS)

Page 26: Kloning gen

Vektor berupa Plasmid

Page 27: Kloning gen

Vektor berupa Plasmid Keunggulan:

Kecil, mudah pengerjaannya Strategi seleksi mudah Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran

kecil (< 10kbp) Kelemahan:

Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

Page 28: Kloning gen

Bakteriofaga (λ phage)

Page 29: Kloning gen

Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)

Lengan kiri: Protein penyusun kepala

& ekorLengan kanan:

Sintesis DNA Pengendalian Lisis inang

Daerah yang dihilangkan: integrasi & eksisi Pengendalian

Page 30: Kloning gen

Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)

Page 31: Kloning gen

Vektor berupa Bakteriofaga

Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA

ukuran besar (10 - 23 kbp) Seleksi berdasar ukuran

Kelemahan: Lebih sulit pengerjaannya

Page 32: Kloning gen

Vektor Cosmid

Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA

berukuran sangat besar (32 - 47 kbp) Seleksi berdasar ukuran Pengerjaan seperti plasmid

Kelemahan: Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan

plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)

Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs λ cos (dihilangkan pada vektor λ)

Page 33: Kloning gen

Vektor Cosmid

Page 34: Kloning gen

λ ZAP

Page 35: Kloning gen

Vektor BAC Replikasi dimediasi

oriS dan oriE parA and parB

mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel

Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR

Page 36: Kloning gen

Vecktor YAC

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

telomere telomerecentromere

URA3ARS HIS3

replicationorigin

markers

largeinserts

Page 37: Kloning gen

BACs dan YACs

Keunggulan: Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA

dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp) Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa

nukleotida total genom

Kelemahan: Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan

ukuran sangat besar

BACs : Bacterial Artificial Chromosomes

YACs : Yeast Artificial Chromosomes

Page 38: Kloning gen

Shuttle Vector Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang

(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)

Page 39: Kloning gen

Memilih Vektor Ukuran DNA yang

disisipkan Ukuran vektor Situs enzim restriksi

yang tersedia Jumlah salinan (copy

number) Efisiensi kloning Kemampuan untuk

menapis DNA sisipan Rencana penelitian

selanjutnya

Page 40: Kloning gen

Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning (plasmid

bacterial) & DNA sumber gen Pemotongan DNA sumber gen

& vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama

Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase

Page 41: Kloning gen

Cara Mengklon DNA (2)

Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)

Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan)

Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

Page 42: Kloning gen

Transformasi Sel Inang

Memasukkan plasmid (yang merupakan vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel inang

Page 43: Kloning gen

Transformasi (1)

PRA-INKUBASISel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .

Page 44: Kloning gen

Transformasi (2)

INKUBASI Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.

coli kompeten. Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak

ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.

Page 45: Kloning gen

Transformasi (3)

KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.

Page 46: Kloning gen

Transformasi (4)

PENYEMBUHAN (RECOVERY)Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah mengalami cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)

Page 47: Kloning gen

Transformasi (5)

PENAPISAN (SCREENING)Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa oleh plasmid.

Page 48: Kloning gen

Koloni E. coli yang membawa plasmid dengan penanda gen pendar fluor (pGLO)

Page 49: Kloning gen

E. coli yang Membawa Plasmid pGlo

Page 50: Kloning gen

Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi

DNA asing ketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih

Penanda selektif

Page 51: Kloning gen

Penapisan Klon Medium pertumbuhan

diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin

Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya

Page 52: Kloning gen

Penapisan warna koloni Biru/Putih

lacZ insert

Enzim tidak berfungsi

X-gal produk

lacZ

Enzim berfungsi

X-gal produk

Page 53: Kloning gen

Penapisan Koloni Bakteri pembawa Plasmid Rekombinan

Page 54: Kloning gen

Hibridisasi Koloni

Dapat dilakukan jika memiliki DNA pelacak Bagian dari gen

yang dikehendaki Bagian dari gen

yang mirip dari jasad lain

Oligonukleotida sintetik

Page 55: Kloning gen

End

See ya ………

Page 56: Kloning gen

LAMPIRAN

Page 57: Kloning gen
Page 58: Kloning gen
Page 59: Kloning gen
Page 60: Kloning gen
Page 61: Kloning gen
Page 62: Kloning gen
Page 63: Kloning gen
Page 64: Kloning gen
Page 65: Kloning gen
Page 66: Kloning gen
Page 67: Kloning gen
Page 68: Kloning gen
Page 69: Kloning gen
Page 70: Kloning gen
Page 71: Kloning gen
Page 72: Kloning gen
Page 73: Kloning gen
Page 74: Kloning gen
Page 75: Kloning gen
Page 76: Kloning gen
Page 77: Kloning gen
Page 78: Kloning gen
Page 79: Kloning gen

Domba Dolly

Kloning dengan transfer inti,dengan memasukkan donor DNA dari hewan yang karakternya diinginkan ke dalam sel telur hewan yang inti DNA nya telah dihilangkan.setelah terbentuk embrioditanamkan ke rahim induk hewan yang akan membesarkannya.contoh domba Dolly(klon dari Skotlandia oleh IAN WILMOT)