Kemampuan Conditioned Medium Dari Kultur Primer Pankreas … · 4 TINJAUAN PUSTAKA Pankreas Pankreas adalah organ yang memiliki 2 fungsi yang berbeda, yaitu menghasilkan hormon dan

4

TINJAUAN PUSTAKA

Pankreas

Pankreas adalah organ yang memiliki 2 fungsi yang berbeda, yaitu

menghasilkan hormon dan mensekresikan enzim. Organ tersebut terdiri dari 3

komponen utama, yaitu jaringan eksokrin yang terdiri dari sel-sel acinar dan

saluran pankreas (pancreatic duct) serta endokrin berupa pulau-pulau Langerhans

(islet of Langerhans) (Gambar 1). Sel-sel eksokrin (sel-sel acinar) bertanggung

jawab terhadap produksi enzim. Enzim yang dihasilkan kemudian akan

disalurkan ke dalam duodenum melalui saluran pankreas (pancreatic duct).

Berbeda dengan keduanya, sel-sel endokrin dari pulau-pulau Langerhans memiliki

fungsi untuk mensekresikan hormon yang kemudian akan dialirkan melalui aliran

darah ke seluruh tubuh. Sel-sel endokrin yang letaknya tersebar diantara sel-sel

eksokrin memiliki jumlah yang sangat sedikit bila dibandingkan dengan eksokrin.

Pada pankreas perbandingan antara jumlah sel-sel endokrin dan eksokrin

mencapai 1 : 10. (Ramiya et al. 2000, Murtaugh et al. 2007).

Gambar 1. Pankreas manusia, (a) pankreas, (b) sel acinar, (c) saluran pankreas, (d) sel alfa, (e) sel beta, (f) sel beta pankreas mensekresikan insulin ke dalam pembuluh darah, (g) insulin membantu penyerapan glukosa pada sel otot (NIH 2001).

a b

c

d

e

f

g

5

Pada awal pembentukannya, sel-sel endokrin pada pankreas dihasilkan

dari tunas (buds) yang muncul pada sel-sel epitel pada saluran pakreas atau

disebut juga dengan epithelium duct cells. Tunas tersebut kemudian tumbuh

hingga membentuk struktur spheroid. Setelah berbentuk spheroid, kumpulan sel

tersebut kemudian bermigrasi ke dalam jaringan acinar, mengalami angiogenesis

(pembentukan pembuluh darah) dan menjadi matang (mature). Kematangan sel-

sel endokrin tersebut ditandai dengan kemampuan sel-sel tersebut untuk

menghasilkan hormon dan mensekresikannya ke dalam pembuluh darah (Ramiya

et al. 2000, Peck et al. 2002, Oliver-Krasinski & Stoffers 2008).

Sel-sel endokrin/pulau-pulau Langerhans merupakan suatu kumpulan sel

yang terdiri dari 5 tipe sel yang berbeda, yaitu sel alfa (α) yang mensekresikan

hormon glukagon, sel beta (β) mensekresikan insulin, sel delta (δ) mensekresikan

somatostatin, sel PP mensekresikan pancreatic polypeptide, serta sel epsilon (ε)

yang mensekresikan ghrelin (Murtaugh et al. 2007). Namun, sel epsilon hanya

dapat ditemukan pada saat pembentukan dan perkembangan pankreas. Setelah

kelahiran jumlah sel tersebut akan menurun hingga akhirnya menghilang. Hal

tersebut menyebabkan sel-sel epsilon tidak banyak diketahui (Brissova & Powers

2008).

Pada rodentia (mencit dan tikus), morfologi pulau-pulau Langerhans

berupa kumpulan sel yang berbentuk bola (spheroid) dengan sel-sel beta terletak

di tengah-tengah dan dikelilingi atau dibungkus oleh sel-sel alfa. Sedangkan sel-

sel delta terletak tersebar diantara sel beta dan alfa (Ramiya et al. 2000, Bouwens

2004). Pada manusia, non-human primate, babi, dan anjing, letak sel beta

pankreas tidak berada di tengah-tengah atau menjadi inti dari pulau-pulau

Langerhans tapi tersebar di antara sel-sel lainnya (alfa, delta dan PP) (Brissova &

Powers 2008). Berdasarkan populasi ke empat sel endokrin yang ada, sel beta

pankreas memiliki jumlah yang paling banyak, yaitu sekitar 80% dari seluruh sel-

sel endokrin, diikuti dengan sel alfa, sel delta dan sel PP (Murtaugh et al. 2007,

Brissova & Powers 2008).

6

Proses Pembentukan Insulin

Insulin merupakan protein yang dihasilkan oleh sel beta dari pulau-pulau

Langerhans pankreas. Gen yang bertanggung jawab terhadap produksi insulin

pada mencit dan tikus (rodentia) adalah insulin 1 dan insulin 2. Kedua gen

tersebut bukan merupakan pasangan gen atau alel (non-allelic insulin genes)

(Artner & Stein 2008). Insulin 1 berasal dari insulin 2 karena insulin 1

merupakan hasil duplikasi dari insulin 2. Perbedaan antara kedua gen tersebut

terletak pada pengurangan sekitar 500 basepairs (bp) di bagian awal (upstream)

pada situs trankripsi pada insulin 1. Selain itu pada bagian yang mengkode

(coding region) pada insulin 1 juga hanya diselingi oleh 1 intron. Intron tersebut

jika disesuaikan letaknya pada insulin 2 berada pada intron pertama, sedangkan

intron kedua dan selanjutnya tidak dimiliki oleh insulin 1 (Devaskar et al. 1993,

Giddings et al. 1994, Artner & Stein 2008).

Ekspresi dari insulin 2 sebagai gen asal (ancestral gene) diekspresikan

tidak hanya pada organ pankreas namun juga dapat ditemukan ekspresinya pada

bagian otak. Sedangkan ekspresi dari insulin 1 hanya dapat ditemukan pada

pankreas. Pada pankreas ekspresi kedua gen tersebut (insulin 1 dan insulin 2)

menunjukkan ekspresi yang sama besar/setara yang menandakan bahwa kedua

gen tersebut memiliki peranan yang sebanding di dalam sintesa insulin pada

pankreas (Devaskar et al. 1993, Giddings et al. 1994).

Pada proses sintesis insulin, gen insulin akan ditranskripsikan menjadi

mRNA yang kemudian akan ditranslasi menjadi prekursor protein yang disebut

preproinsulin. Preproinsulin tersusun dari 4 bagian dengan urutan sebagai berikut,

rantai A, C-peptide, rantai B dan signal peptide (berupa hydrophobic N-terminal).

Signal peptide adalah suatu peptida yang terdapat pada prekursor protein dan

merupakan karakteristik dari protein yang akan disekresikan oleh hewan,

tumbuhan maupun bakteri. Signal peptide pada prekursor protein tersebut

menyandi tujuan atau tempat dimana prekursor protein akan dibawa dan

mengalami proses selanjutnya (post-translation process). Ketika disekresikan ke

dalam sitosol signal peptide akan berinteraksi dengan signal recognition particle

(SRP), yaitu partikel ribonucleoprotein di dalam sitosol yang akan memfasilitasi

pemisahan rantai polipeptida sehingga dihasilkan proinsulin (rantai A, C-peptide,

7

dan rantai B). Proinsulin kemudian akan ditranslokasikan ke dalam lumen

retikulum endoplasmik (RE) melalui peptide-conducting channel dan mengalami

perubahan bentuk sehingga menghasilkan bentuk dasar dari insulin akibat ikatan

sulfida yang terbentuk antara sulfid pada rantai A dan B. Setelah itu, proinsulin

kemudian dibawa menuju golgi aparatus (badan golgi) untuk dikemas dan

kemudian dilepas ke dalam sitoplasma berupa kantung-kantung yang nantinya

akan disekresikan (secretory vesicles). Di dalam secretory vesicles tersebut

proinsulin mengalami proses pematangan yaitu pemisahan rantai insulin dengan

peptida penghubungnya (connecting peptide atau C-peptide) sehingga dihasilkan

insulin dan C-peptide (Gambar 2). Keduanya kemudian akan disekresikan secara

bersamaan ke dalam darah pada saat terjadi peningkatan glukosa dalam darah

(Bosher 2001 & Steiner 2008).

Gambar 2. Proses sintesis insulin. (a) proinsulin dalam retikulum endoplasma membentuk bentuk dasar insulin, terjadi ikatan sulfida antar sulfid pada rantai A dan B, (b) proinsulin kemudian dikemas oleh badan golgi berupa kantung (vesicles), (c) dalam vesicles proinsulin mengalami pematangan membentuk insulin dan C-peptide dan siap disekresikan oleh secretory granules (Bosher 2001).

a

b

c

8

Diabetes dan Penanganannya

Sel beta pankreas dan sel alfa merupakan komponen terpenting dalam sel

endokrin pada pankreas. Setelah mengkonsumsi makanan (karbohidrat), kadar

gula (glukosa) dalam darah akan meningkat. Insulin yang dihasilkan oleh sel beta

pankreas akan menstimulasi penyerapan glukosa oleh sel-sel tubuh serta

menstimulasi hati untuk mengubah glukosa menjadi glikogen dan menyimpannya

dalam hati dan otot. Sedangkan pada saat terjadi penurunan glukosa, sel alfa akan

mensekresikan hormon glukagon yang menstimulasi hati untuk mengubah

glikogen menjadi glukosa (Bouwens & Rooman 2005).

Ketidakmampuan tubuh untuk menjaga keseimbangan kadar gula dalam

darah merupakan karakterisik dari penyakit diabetes. Berdasarkan data WHO,

diabetes diperkirakan akan diderita oleh lebih dari 150 juta orang di dunia dan

prevalensinya akan meningkat menjadi 2 kali lipat pada tahun 2025 (WHO 2002).

Berdasarkan tipenya, diabetes dapat dikelompokkan menjadi 2 tipe utama,

yaitu diabetes tipe 1 dan tipe 2. Diabetes tipe 1 juga dikenal sebagai Insulin

Dependent Diabetes Mellitus (IDDM). Penyakit tipe ini disebabkan karena

adanya kegagalan sistem imun dalam tubuh sehingga sistem imun tubuh

mengenali sel beta pankreas sebagai suatu benda asing yang harus dimusnahkan.

Berkurangnya hingga hilangnya sel beta pankreas menyebabkan jumlah insulin

yang dihasilkan tidak mampu memenuhi kebutuhan tubuh dan terus menurun

hingga akhirnya tidak lagi dihasilkan. Diabetes tipe ini ditangani dengan

penambahan insulin (exogenous insulin) secara berkala untuk memenuhi

kebutuhan tubuh akan insulin ataupun dengan melakukan transplantasi sel beta

pankreas maupun pankreas secara utuh sehingga tubuh kembali menghasilkan

insulin (Dugi 2006, Noguchi 2007, Oliver-Krasinski & Stoffers 2008).

Sedangkan pada diabetes tipe 2 atau disebut juga dengan Non Independent

Diabetes Mellitus (NIDDM), umumnya terjadi karena berkurangnya sensitivitas

reseptor insulin pada sel-sel tubuh. Hal ini menyebabkan insulin yang diperlukan

untuk menurunkan kadar gula dalam darah meningkat jumlahnya dari jumlah

yang seharusnya. Pengobatan yang dilakukan pada diabetes tipe 2 ini adalah

menstimulasi sel beta pankreas sehingga menghasilkan lebih banyak insulin.

9

Namun, pengobatan tersebut dapat menyebabkan terjadinya kelelahan pada sel

beta sehingga dalam proses yang berkelanjutan diabetes tipe 2 akan berubah

menjadi diabetes tipe 1 (Dugi 2006, Noguchi 2007, Oliver-Krasinski & Stoffers

2008).

Secara alami peningkatan jumlah sel beta pankreas terjadi pada saat masa

tubuh meningkat atau saat adanya pertambahan berat badan serta pada masa

kehamilan. Hal tersebut disebabkan karena di dalam pankreas terdapat sel-sel

progenitor yang terstimulasi untuk membentuk sel beta pankreas guna memenuhi

peningkatan kebutuhan tubuh akan insulin (Bouwens 2004). Namun, kecepatan

pembentukan sel beta pankreas yang tidak dapat mengimbangi kerusakan dan

kematian sel, serta adanya autoimmune attack pada diabetes tipe 1 menyebabkan

pasien harus mendapatkan transplantasai sel beta pankreas.

Kesulitan dalam pengadaan sel beta pankreas disebabkan karena sel-sel

tersebut tidak dapat diperbanyak melalui metode kultur. Selain itu jumlah sel

yang diperlukan dalam satu kali proses transplantasi juga cukup banyak (Colman

et al. 2004). Hal tersebut menunjukkan kendala yang harus dihadapi dalam

penggunaan cell replacement therapy untuk menanggulangi penyakit diabetes

yang timbul akibat kerusakan sel beta pankreas.

Embryonic Stem Cells

Stem cells adalah sel yang memiliki kemampuan untuk memperbaharui

diri (self-renewal) dan berdiferensiasi menjadi sel lain dengan fungsi yang lebih

spesifik. Kemampuan tersebut ditentukan oleh daya plastisitas yang dimilikinya

atau disebut juga dengan sifat pluripoten. Sifat pluripoten menyebabkan stem

cells mampu berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel dalam tubuh yang

dihasilkan dari tiga lapis kecambah, yaitu ektoderm, mesoderm, dan endoderm.

Namun demikian, sifat pluripoten tersebut akan berkurang seiring dengan

terjadinya diferensiasi atau pembentukan sel yang lebih spesifik (Burdon et al.

2002, NIH 2001, Mayhal et al. 2004).

Secara umum stem cells memiliki karakteristik morfologi berupa inti sel

(nukleus) yang besar bila dilihat dari perbandingan antara nukleus dengan

sitoplasmanya. Selain itu stem cells juga memiliki kecenderungan untuk tumbuh

10

membentuk koloni berlapis yang kompak (compact multilayered colonies).

Karakteristik lain yang dimiliki oleh stem cells adalah fase G1 yang pendek pada

siklus selnya, serta memiliki aktivitas telomerase yang tinggi, dan ukuran

telomere yang lebih panjang bila dibandingkan dengan sel-sel pada umumnya

(Bhat et al. 2004).

Berdasarkan sumbernya stem cells dapat dikelompokan menjadi 2

kelompok utama, yaitu embrionik (embryonic stem cells, ESC) dan non-

embrionik (adult stem cells, ASC). Embryonic stem cells adalah stem cells yang

diperoleh atau diisolasi dari embrio. Sedangkan ASC atau yang juga dikenal

sebagai mesenchymal stem cells (MSC) ataupun multipotent adult progenitor cells

(MAPC), adalah sel yang ditemukan di berbagai jaringan tubuh yang memiliki

fungsi untuk menjaga keseimbangan dan memperbaiki jaringan tubuh. Adult

stem cells dapat diisolasi dari sumsum tulang, otak, hati, kulit, lemak, otot, dan

darah (Davila et al. 2004). Namun dari kedua sumber utama stem cells tersebut,

ESC merupakan stem cells yang paling baik karena kemampuan proliferasinya

dalam waktu yang lebih panjang (long-term self-renewal) dan

kemampuan diferensiasinya menjadi berbagai tipe sel dari 3 lapis kecambah,

serta imunitas yang lebih rendah bila dibandingkan dengan stem cells dari sumber

lainnya (NIH 2001, Lie & Xie 2005).

Embryonic stem cells mulai diisolasi pada tahun 1980an. Diawali dengan

keberhasilan Evans dan Kaufman dalam mengisolasi inner cell mass dari

blastosis mencit pada tahun 1981. Selain itu, Evans dan Kaufman juga berhasil

menemukan kondisi kultur in vitro yang baik sehingga dapat menumbuhkan ESC

mencit hingga menghasilkan cell lines (sel yang telah diisolasi dan dikultur

secara in vitro dengan tetap mempertahankan sifat-sifat yang dimilikinya). Pada

penelitian-penelitian selanjutnya selain berhasil membiakkan stem cells para

peneliti juga melakukan pengarahan stem cells secara in vitro sehingga stem cells

berdiferensiasi menjadi sel-sel dengan tipe tertentu. Hal tersebut kemudian

menjadikan stem cells sebagai sumber sel yang sangat potensial bagi terapi untuk

menggantikan sel-sel atau jaringan yang rusak (NIH 2001).

11

Berbagai penelitian pada hewan coba telah dilakukan dengan

menggunakan stem cells sebagai terapi terhadap suatu penyakit dengan hasil yang

lebih baik bila dibandingkan dengan terapi konvensional. Penyakit-penyakit

yang dapat disembuhkan dengan menggunakan stem cells antara lain luka bakar,

penyakit jantung, stroke, diabetes tipe 1, osteoarthritis dan rheumatoid arthritis,

Parkinson dan Alzheimer, serta penyakit-penyakit lain yang diakibatkan

kerusakan sistem saraf (NIH 2001, Bhat et al. 2005). Namun penggunaan stem

cells tidak hanya terbatas dalam terapi pada penyakit tapi juga digunakan pada

penelitian-penelitian dasar (basic research) seperti dalam memahami kejadian

kompleks yang terjadi dalam proses perkembangan (development). Selain itu

stem cells juga digunakan dalam mempelajari fungsi-fungsi gen yang terkait

dalam mekanisme “on” dan “off” nya suatu gen, ataupun pada proses

pengembangan suatu obat (drug development) (NIH 2001, Davila et al. 2004,

Bhat et al. 2005, Trounson 2006).

Isolasi Inner Cell Mass

Embryonic stem cells diperoleh dengan mengisolasi inner cell mass (ICM)

dari embrio pada fase blastosis. Blastosis adalah suatu tahapan pada

perkembangan embrionik pada saat embrio mencapai pertumbuhan pada hari ke 4

setelah terjadinya pembuahan. Pada saat tersebut embrio mengalami kompaksi

dan sel-sel pada bagian paling luar akan mensekresikan suatu cairan. Dominasi

cairan tersebut akan mendesak sel-sel yang berada pada bagian dalam sehingga

terkumpul pada satu sisi dan menghasilkan suatu rongga yang berisi cairan yang

disebut dengan blastosol. Sel-sel yang mengeliling pada bagian paling luar

dinamakan trophectoderm. Sedangkan sel-sel yang terkumpul pada bagian tengah

disebut dengan inner cell mass (ICM) (Nagy et al. 2003, O’Shea et al. 2004,

Zwaka & Thomson 2005) (Gambar 3). Inner cell mass tersebut yang kemudian

akan diisolasi dan menjadi sumber dari ESC.

Inner cell mass digambarkan sebagai suatu koloni dengan ukuran sel yang

kecil, mempunyai nukleus berukuran besar dan sitoplasma yang sedikit. Selain

itu jumlah dan kualitas ICM juga sangat dipengaruhi oleh kualitas pertumbuhan

blastosis (Stojkovic et al. 2004, Kim et al. 2005).

12

Namun sebelum dilakukan isolasi ICM, zona pelucida yang membungkus

blastosis harus dihilangkan terlebih dahulu. Zona pellucida adalah lapisan

glikoprotein yang membungkus embrio, yang berfungsi untuk menjaga kesatuan

embrio saat embrio belum mengalami kompaksi (pre-compacted). Pada in vivo,

zona pellucia akan lisis akibat enzim tripsin yang dihasilkan oleh sel-sel

tropechtoderm, yang disebut dengan stripsin (Budhiarko et al. 2008). Pada in

vitro, proses penghilangan zona pellucida dilakukan dengan menggunakan enzim

pronase berkonsentrasi 0,25-0,50% (Oh et al. 2005) ataupun menggunakan asam

tyrode (Cowan et al. 2004, Skottman & Hovatta 2006).

Gambar 3. Embrio fase blastosis: (a) zona pellucida; (b) trofoblas; (c) blastosol; (d) inner cell mas, ICM. Bar = 40 μm

Pengisolasian ICM dari blastosis dapat dilakukan dengan metode

immunosurgery, microsurgery atapun enzimatik (Nagy et al. 2003, Bryja et al.

2006). Umumnya metode yang banyak digunakan adalah metode

immunosurgery. Prinsip dasar dalam metode immunosurgery adalah

pengisolasian ICM dengan cara melisiskan sel-sel trophectoderm yang ada di

sekeliling ICM. Pelisisan sel-sel trophectoderm dilakukan dengan bantuan

antibodi dan komplemen. Antibodi akan berikatan dengan sel-sel trophectoderm

(antigen) sehingga terbentuk kompleks antigen-antibodi. Kemudian dengan

penambahan komplemen akan terjadi lisis pada sel-sel trophectoderm akibat

d

c

b

a

13

adanya aktivasi cascade complement yang menyebabkan terjadinya membrane

attack complex (Nagy et al. 2003) sehingga diperoleh ICM sebagai hasil akhir

(Gambar 4).

Pada microsurgery, ICM diperoleh dengan melakukan pembedahan mikro

terhadap blastosis. Sedangkan pada metode enzimatik digunakan enzim trypsin

dengan konsentrasi 2.5% (Bryja et al. 2006). Namun selain kedua metode

tersebut, isolasi juga dapat dilakukan dengan cara alami yaitu dengan

membiarkan blastosis untuk melekat (attach) dan kemudian mengisolasi ICM

yang berupa agregat (Cowan et al. 2004, Bryja et al. 2006, Hoffman & Carpenter

2005). Ataupun menggunakan teknik single cell embryo biopsy yaitu teknik yang

umum digunakan pada saat melaluikan pre-implantation genetic diagnosis (PGD)

(Chung et al. 2005, Skottman & Hovatta 2006).

Gambar 4. Isolasi ICM dengan metode immunosurgery: (a) blastosis diinkubasi dengan rabbit anti-mouse serum; (b) dilanjutkan dengan menginkubasi blastosis dengan guinea pig complement; (c) sel-sel trofoblas mengalami lisis sehingga diperoleh ICM (Nagy et al. 2003)

Dibandingkan dengan teknik immunosurgery, penggunaan microsurgery

dianggap lebih menguntungkan dalam proses isolasi ESC pada manusia. Hal ini

disebabkan karena tidak terjadinya kontak antara blastosis dengan antibodi yang

berasal dari hewan yang umumnya digunakan pada proses immunosurgery.

Kelemahan pada metode immunosurgery adalah risiko terbawanya sisa sel

trophectoderm pada proses isolasi yang dapat mempengaruhi dan menghambat

pertumbuhan ESC (Stojkovic et al. 2005, Skottman & Hovatta 2006).

c b a

14

Kultur Embryonic Stem Cell

Inner cell mass yang diperoleh kemudian dikultur dengan tetap

mempertahankan sifat undifferentiated yang dimilikinya (Pour et al. 2004). Pada

umumnya ESC dikultur dalam dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)

(Sigma, USA) yang mengandung fetal bovine serum (FBS) 10-20% (Sigma,

USA), β-mercaptoethanol 0,1 mM (Sigma, USA), nonessential amino acids 1%

(Sigma, USA), penicillin-streptomycin 5 μl/ml (Sigma, USA), dan Leukimia

inhibitory factor (LIF) 20 ng/ml. Penambahan LIF dalam medium kultur

berfungsi untuk mempertahankan sifat undifferentiated ESC. Leukimia inhibitory

factor akan berikatan dengan komplek reseptor heterodimer (heterodimeric

receptor complex) yang terdiri dari LIF receptor (LIFR) dan reseptor gp 130.

Ikatan tersebut akan mengaktifkan faktor transkripsi Janus-associated tyrosine

kinases (JAK) yang melekat pada reseptor LIF dan gp 130 sehingga mengalami

fosforilasi. JAK yang terfosforilasi akan mengikat signal transducer and

activator of transcription 3 (STAT3). Ikatan yang terbentuk antara STAT3 dan

JAK menyebabkan STAT3 terfosforilasi dan memiliki kecenderungan untuk

membentuk dimer. STAT3 dalam bentuk dimer tersebut kemudian akan

bertranslokasi ke dalam nukleus dan mengaktifkan gen-gen yang terkait dalam

kemampuan self-renewal ESC (Burdon et al. 2002, Yu & Thomson 2008).

Selain penggunaan LIF, pada kultur ESC juga digunakan feeder layer

berupa mouse embryonic fibroblast (MEF). Penggunaan MEF dalam kultur ESC

dapat mengurangi konsentrasi LIF yang digunakan yaitu dari 20 ng/ml menjadi 10

ng/ml. Hal tersebut disebabkan karena MEF juga mensekresikan basic fibroblast

growth factor (bFGF) dan LIF yang berperan dalam mempertahankan sifat

undifferentiated ESC (Hoffman & Carpenter 2005, Xu et al. 2005). Mouse

embryonic fibroblast sebagai feeder cells selain menghasilkan mediator

pertumbuhan (growth promoting) juga berfungsi sebagai tempat melekat (cell

attachment factors) bagi ESC (Wobus & Boheler 2005).

15

Karakteristik Embryonic Stem Cells

Embryonic stem cells memiliki karakteristik sebagai berikut berasal dari

embrio yang belum melekat pada dinding rahim (preimplantation); dapat

berproliferasi tanpa berdiferensiasi dalam waktu yang panjang; dapat berkembang

menjadi berbagai sel yang berasal dari 3 lapis kecambah (endoderm, mesoderm,

dan ektoderm) (Kitiyanant et al. 2000).

Molekul penanda yang dapat digunakan dalam mendeteksi keadaan

undifferentiated pada ESC antara lain adanya Stage Specific Embryonic Antigen

(SSEA), Octamer-4 (Oct4), dan Nanog. Stage specific embryonic antigen adalah

glikoprotein spesifik yang diekspresikan pada awal perkembangan embrionik dan

stem cells yang belum berdiferensiasi (undifferentiated stem cells). Terdapat 3

tipe SSEA yang berperan dalam ESC, yaitu SSEA-1, -3 dan -4. SSEA-1

diekspresikan pada permukaan preimplantaion embryo dan teratocarcinoma stem

cells. SSEA-3 dan -4 disintesis selama oogenesis dan ditemukan pada permukaan

oosit, zigot, dan awal pembelahan embrio. Embryonic stem cells pada primata,

embryonic carcinoma (EC) dan ESC manusia mengekspresikan SSEA-3 dan

SSEA-4, sedangkan SSEA-1 diekspresikan oleh ESC mencit. Sedangkan Oct4

dan Nanog adalah faktor transkripsi yang berperan dalam menjaga ESC pada fase

undifferentiated (NIH 2001, Hoffman & Carpenter 2005, Wobus & Boheler

2005).

Selain itu keadaan belum berdiferensiasi (undifferentiated) dapat pula

diketahui dengan melihat aktivitas dari enzim alkaline phosphatase (AP).

Menurut O’Connor et al. 2008 pewarnaan AP merupakan indikator yang sensitif,

spesifik dan kuantitatif untuk mengetahui tingkat pluripotensi pada ESC.

Diferensiasi Embryonic Stem Cells Menjadi Sel Beta Pankreas

Stem cells yang bersifat pluripoten telah menjadi alternatif sumber sel

dalam cell replacement therapy. Pada penggunaannya, stem cells terlebih dahulu

diarahkan/diferensiasikan sehingga membentuk sel beta pankreas. Beberapa

metode yang telah dilakukan dalam diferensiasi stem cells menjadi sel beta

pankreas antara lain, melalui modifikasi genetik sehingga stem cells akan

mengekspresikan pancreas specific promotor atau melalui diferensiasi spontan

16

yang diikuti seleksi, penggunaan growth factors (seperti activin, fibroblast growth

factor, retinoic acid, dan transforming growth factor) (Shi et al. 2005; Ku et al.

2004; Skoudy et al. 2004), penggunaan extracellular matrix (seperti laminin,

firbronectin dan collagen) (Blyszczuk et al. 2004; Schroeder et al. 2006) serta

penggunaan conditioned medium (CM) (Vaca et al. 2006).

Sel beta pankreas yang terbentuk dari hasil pengarahan ESC dapat

diidentifikasi dari adanya warna merah yang dihasilkan pada pewarnaan

dithizone, ataupun dari pewarnaan imunohistokimia serta analisa menggunakan

ELISA untuk melihat adanya insulin yang dihasilkan (Shiroi et al. 2002, Lin et al.

2006, Vaca et al. 2006). Selain itu dapat juga dilakukan analisa terhadap

Connecting-peptide (C-peptide), yaitu suatu peptida yang dihasilkan dari proses

sintesis insulin (Rajagopal et al. 2003, Marques et al. 2004, Vaca et al. 2006). Sel

beta pankreas juga dapat diidentifikasi melalui ekspresi dari mRNA yang

dihasilkan pada proses sintesa insulin (proinsulin 1 dan 2) (Shiroi et al. 2005, Ku

et al. 2004, Lin et al. 2006).

Conditioned Medium

Conditioned medium adalah suatu medium yang diperoleh dari supernatan

suatu kultur sel. Penggunaan CM dalam pengarahan stem cells dilakukan karena

CM dianggap mengandung protein-protein yang disekresikan dalam kultur sel

sebelumnya. Conditioned medium dapat digunakan dalam mempertahankan

undifferentiated pada stem cells ataupun mendukung diferensiasi stem cells

menjadi suatu tipe sel tertentu. Beberapa penelitian yang telah dilakukan pada

stem cells menggunakan CM antara lain, penggunaan CM yang dihasilkan dari

kultur sel fibroblas dalam mempertahankan sifat undifferentiated ESC (Xu et al.

2004, Ouyang et al. 2007), CM dari kultur sel glial untuk mengarahkan

diferensiasi ESC menjadi sel neuron (Tian et al. 2005), CM dari kultur sel testis

yang mengarahkan diferensiasi ESC sehingga membentuk struktur ovari yang

mengandung oosit (Lacham-Kaplan et al. 2005), dan CM dari kultur pankreas

untuk mengarahkan diferensiasi ESC menjadi sel beta pankreas (Vaca et al.

2006).

17

Penggunan CM yang dihasilkan dari kultur primer pankreas fetus usia 16.5

hari yang disertai dengan modifikasi genetik (penyisipan gen tertentu untuk

kemudian dilakukan screening) telah mengarahkan diferensiasi ESC menjadi sel

beta pankreas melalui ekspresi insulin dan C-peptide yang dihasilkan (Vaca et al.

2006). Penelitian mengenai regenerasi pankreas pada hewan model

memperlihatkan bahwa ductal cells mengandung kumpulan progenitor yang akan

membentuk sel-sel endokrin melalui ekspresi pdx1. Sel-sel endokrin yang

dihasilkan muncul sebagai tunas/buds yang letaknya dekat dengan saluran

pankreas/ducts (Colman et al. 2004). Selain itu kultur primer pankreas ataupun

sel-sel pancreatic ducts yang dikultur selama 3-4 minggu menunjukkan adanya

sel beta pankreas melalui pewarnaan dithizone pada akhir masa kultur (Katdare et

al. 2004, Leng 2005, Lin 2006). Kedua hal tersebut membuktikan bahwa

pankreas memiliki sel-sel progenitor yang terletak pada saluran pankreas/ducts

yang berperan sebagai sumber sel bagi pembentukan sel beta pankreas. Oleh

sebab itu, CM yang dihasilkan selama masa kultur tersebut dapat digunakan

dalam pengarahan ESC menjadi sel beta pankreas karena mengandung faktor-

faktor yang mendukung diferensiasi ESC menjadi sel beta pankreas.