ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS · PDF file96% kemudian di fraksinasi menggunakan metode ekstraksi cair-cair dengan fase ... kloroform (non polar) dan etil asetat ... 5% (E.Merck),

i

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

SENYAWA FLAVONOID FRAKSI KLOROFORM DAN FRAKSI ETIL

ASETAT DAUN TANAMAN ADAM HAWA (Rhoe discolor (L'hér.) Hance)

DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Hernalhis Esanda

NIM : 138114006

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kupersembahkan skripsi ini untuk :

Tuhan Yesus Kristus

Kedua orangtuaku (Bapak Eko Subono dan Liem Ik Ling)

Nenekku (Ny. Sulistyowati)

Adik-adikku (Paquita Sari dan Antonius Petra Mahesa Dharma Saputra)

Sahabat-sahabatku dan Almamaterku


v


vi


vii


viii


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv

PRAKATA ............................................................................................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... vii

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................ viii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL .................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii

ABSTRAK ........................................................................................................... xiii

ABSTRACT ........................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

METODE PENELITAN .......................................................................................... 2

Determinasi Tanaman ................................................................................ 2

Pengumpulan Bahan Uji ............................................................................ 2

Pembuatan Simplisia .................................................................................. 3

Ekstraksi………………………………………………………………….3

Fraksinasi ................................................................................................... 3

Isolasi Fraksi .............................................................................................. 4

Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat ....................................................... 4

Uji Aktivitas Antioksidan .......................................................................... 4

Perhitungan Nilai IC50 ..................................................................................................................... 5

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................ 6

KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 12

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 13

LAMPIRAN ........................................................................................................... 14

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................... 40


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Nilai Rf yang dihasilkan pad KLT Preparatif .......................................... 7

Tabel II. Identifikasi Senyawa Flavonoid Fraksi Kloroform dengan Pereaksi

Geser ........................................................................................................ 8

Tabel III. Identifikasi Senyawa Flavonoid Fraksi Etil Asetat dengan Pereaksi

Geser ........................................................................................................ 8

Tabel IV. Nilai IC50 dan Penggolongan Tingkat Aktivitas Antioksidan Rutin,

Fraksi Kloroform, dan Fraksi Etil Asetat .............................................. 11


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Malvidin………………………………………………..……9

Gambar 2. Mekanisme reaksi flavonoid menghambat radikal bebas DPPH..……9

Gambar 3. Grafik konsentrasi rutin terhadap %IC…………………………..…..10

Gambar 4. Grafik konsentrasi fraksi kloroform terhadap %IC ............................. 10

Gambar 5. Grafik konsentrasi fraksi etil asetat terhadap %IC .............................. 11


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Tanaman adam hawa ..................................................................... 15

Lampiran 2. Surat keterangan hasil determinasi tanaman .................................. 16

Lampiran 3. Sampel daun tanaman adam hawa .................................................. 17

Lampiran 4. Maserasi dan fraksinasi .................................................................. 17

Lampiran 5. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid ................................... 19

Lampiran 6. Uji aktivitas antioksidan (DPPH) .................................................. 22

Lampiran 7. Hasil uji statistik ............................................................................. 37


xiii

ABSTRAK

Penyakit-penyakit degeneratif seperti kanker, penuaan dini, dll sangat

marak terjadi di Indonesia. Penyebab terjadinya penyakit tersebut salah satunya

yaitu karena terpaparnya tubuh oleh senyawa radikal bebas. Reaktifitas radikal

bebas dapat dihambat oleh suatu senyawa yaitu senyawa antioksidan. Salah satu

tanaman yang mengandung senyawa antioksidan yaitu tanaman adam hawa (Rhoe

discolor (L’Her) Hance). Tanaman adam hawa mengandung senyawa flavonoid

yaitu senyawa antosianidin. Antosianidin diketahui memiliki aktivitas antioksidan

yang dapat digunakan sebagai salah satu sumber antioksidan alami untuk tubuh.

Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui nilai IC50 fraksi kloroform dan fraksi

etil asetat ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa dengan menggunakan

metode DPPH serta mengetahui jenis senyawa flavonoid pada fraksi kloroform

dan fraksi etil asetat ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa. Daun tanaman

adam hawa di ekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol

96% kemudian di fraksinasi menggunakan metode ekstraksi cair-cair dengan fase

diam berupa silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa n-butanol : asam asetat : air

(BAA) (4:1:5). Setelah itu di isolasi menggunakan KLT preparatif kemudian

identifikasi isolat dilakukan menggunakan pereaksi geser. Uji aktivitas

antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH dan dihitung nilai IC50 dari

masing-masing fraksi. Hasil dari uji aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa

fraksi kloroform dan fraksi etil asetat ekstrak etanol 96% daun tanaman adam

hawa memiliki nilai IC50 sebesar 767,104 ± 33,676 µg/mL dan 522,939 ± 9,0302

µg/mL.

Hasil identifikasi senyawa flavonoid dari kedua fraksi diduga

mengandung senyawa malvidin yang merupakan golongan antosianidin.

Kata kunci : Rhoe discolor (L’Her) Hance, IC50, antosianidin, DPPH


xiv

ABSTRACT

Degenerative diseases such as cancer, aging, etc are a very common

disease in Indonesia. The disease happens due to the exposure of the body by free

radicals. Reactivity of free radicals can be inhibited by a compound called

antioxidant. One of the plants that contain antioxidant compounds is adam hawa

plants (Rhoe discolor (L’Her) Hance). Adam hawa plant contains flavonoid

compound which is anthocyanidin. Anthocyanidins are known to have antioxidant

activity which can be used as a source of natural antioxidants for the body. The

purpose of this study is to determine the IC50 value of chloroform fraction and

ethyl acetate fraction of 96% ethanol extract of the leaves of adam hawa plants

using DPPH as well as knowing the type of flavonoid compounds in chloroform

fraction and ethyl acetate fraction of 96% ethanol extract of the leaves of adam

hawa plants. The leaves of adam hawa plant extracted using maceration method

by ethanol 96% then fractionated using liquid-liquid extraction with a stationary

phase such as silica gel 60 F254 and the mobile phase in the form of n-butanol:

acetic acid: water (BAA) (4: 1: 5). After that the leaves of adam hawa plants

isolated using preparative TLC and then the identification of isolates was done

using reagents sliding. Test of antioxidant activity using DPPH and IC50 values

calculated from each fraction. The results of the test showed that the fraction of

the antioxidant activity of chloroform fraction and ethyl acetate fraction of 96%

ethanol extract of the leaves of adam hawa plants has IC50 value of 767.104 ±

33.676 mg / mL and 522.939 ± 9.0302 mg / mL. The identification of compounds

from both fractions showed that it contains malvidin which is a class of

anthocyanidin compounds.

Keywords: Rhoe discolor (L'Her) Hance, IC50, anthocyanidin, DPPH


1

PENDAHULUAN

Pada jaman sekarang ini, penyakit-penyakit degeneratif seperti kanker, penuaan

dini, dll sangat marak terjadi di Indonesia. Penyebab terjadinya penyakit tersebut salah

satunya yaitu karena terpaparnya tubuh oleh senyawa radikal bebas. Radikal bebas sangat

sering dijumpai pada lingkungan sekitar seperti polusi asap kendaraan bermotor,

pembakaran sampah, dan makanan cepat saji. Radikal bebas reaktif melakukan reaksi

oksidasi patogenik terhadap sel, sehingga dapat menyebabkan timbulnya penyakit

degeneratif seperti kanker, penyakit kardiovaskular, kerusakan hati dan penuaan dini

(Winarsi, 2007). Reaktifitas radikal bebas dapat dihambat oleh antioksidan dimana

merupakan senyawa yang mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan sel dengan cara

mengikat radikal bebas dengan menghambat reaksi oksidasi (Kim et al., 2002).

Salah satu tanaman yang mengandung senyawa antioksidan yaitu tanaman adam

hawa (Rhoe discolor (L'hér.) Hance) yang termasuk dalam familia commelinaceae.

Kandungan kimia daun tanaman adam hawa merupakan senyawa-senyawa flavonoid,

antosianin, saponin, karotenoid, terpenoid, kumarin, dan steroid (Rosales-Reyes et al.,

2007). Senyawa flavonoid yang ada pada daun tanaman adam hawa ini merupakan

senyawa antosianidin. Tanaman adam hawa memiliki warna ungu pada bagian bawah

daunnya sehingga diduga mengandung senyawa flavonoid.

Avila et al. (2003) melakukan uji aktivitas antioksidan DPPH ekstrak etanol 96%

daun tanaman adam hawa dengan konsentrasi 1, 10, dan 100 µg/mL dengan % hambat

sebesar 67, 68, dan 79. Sitorus dkk. (2012) juga meneliti kandungan senyawa ekstrak daun

tanaman adam hawa menggunakan etanol 95% dan isolasi dengan KLT preparatif serta

identifikasi senyawa dengan spektrofotometer visibel dan senyawa yang diperoleh yaitu

antosianidin. Antosianidin merupakan aglikon antosianin yang terbentuk karena

terhidrolisis oleh asam (Kumalaningsih, 2006). Antosianin stabil pada pH 3,5 dan suhu

50°C (Handayani, 2012). Sifat kimia dari antosianidin dilihat dari kelarutan antosianidin

dalam pelarut seperti metanol, aseton, atau kloroform (Socaciu, 2007). Menurut penelitian

Tensiska dan Sukarminah (2007), senyawa antosianidin dapat larut dalam etil asetat.

Berdasarkan penelitian tersebut, tahap identifikasi senyawa flavonoid masih pada

tahap ekstrak daun tanaman sehingga perlu dilakukan tahap fraksinasi dan juga isolasi agar

senyawa yang didapatkan lebih spesifik. Fraksinasi dilakukan menggunakan pelarut

kloroform (non polar) dan etil asetat (semi polar). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk

mengetahui nilai IC50 fraksi kloroform dan fraksi etil asetat ekstrak etanol 96% daun


2

tanaman adam hawa dengan menggunakan metode DPPH dan mengetahui jenis senyawa

flavonoid pada fraksi kloroform dan fraksi etil asetat ekstrak etanol 96% daun tanaman

adam hawa.

METODE PENELITIAN

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain Shaker (Innova TM 2100),

vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UVmini-1240 single beam

A10935105039 CD), mikropipet (20-200 µL) (Acura 825, Socorex), UV Cabinet,

timbangan analitik METTLER TOLEDO (max 3100 g, min 0,5 g), timbangan analitik

OHAUS (max 210 g, min 0,0001 g), vakum penguap putar (vaccum rotary evaporator)

(Buchi R-205, Jerman), oven (Memmert 30-1060), ayakan no. mesh 40, blender,

sentrifugator (PLC-03), waterbath, corong pisah, peralatan gelas.

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini yaitu daun tanaman adam hawa

(CV. Merapi Farma Herbal) diambil pada bulan Agustus 2016. Bahan kimia yang

digunakan meliputi metanol pro analitik (E.Merck), AlCl3 5% (E.Merck), NaOH 2M

(E.Merck), HCl (E.Merck), etanol 96% (CV. General Labora), aquadest (CV. General

Labora), kloroform kualitas pro analitik (E.Merck), etil asetat teknis (CV. General Labora),

DPPH (Aldrich), lempeng KLT Silika Gel 60 F254 (E.Merck), rutin (Sigma), n-butanol

(E.Merck), asam asetat (E.Merck), alumunium foil.

Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman adam hawa di Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta menggunakan acuan buku Flora Untuk Sekolah di

Indonesia (Steenis, 1992). Bagian yang digunakan untuk determinasi adalah keseluruhan

tanaman adam hawa (akar, batang, daun, dan bunga).

Pengumpulan Bahan Uji

Bahan utama yang digunakan yaitu daun tanaman adam hawa yang diperoleh dari

CV. Merapi Farma, Yogyakarta. Daun dipetik secara manual dengan kriteria daun yang

digunakan yaitu daun utuh tua yang permukaan atasnya berwarna hijau dan bagian

bawahnya berwarna merah lembayung (ungu) dan segar, berbentuk pedang dengan

panjang 15-30 cm dan lebar 2,5-6 cm, ujung daun runcing, permukaan daunnya gundul.


3

Pembuatan Simplisia

Daun tanaman adam hawa sebanyak 1 kg disortasi basah terlebih dahulu untuk

memisahkan dari pengotor lalu dicuci dan ditiriskan hingga sisa air menghilang. Daun

tanaman adam hawa diiris menjadi beberapa bagian lalu dikeringkan menggunakan oven

dengan bantuan blower pada suhu 40°C. Proses pengeringan dilakukan sampai didapatkan

daun tanaman adam hawa kering yang mudah hancur apabila diremas dengan tangan. Daun

tanaman adam hawa yang sudah kering dihaluskan dengan blender lalu diayak

menggunakan ayakan nomor mesh 40 sehingga didapatkan serbuk simplisia daun tanaman

adam hawa.

Ekstraksi

Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi menggunakan 50 g serbuk

simplisia daun tanaman adam hawa dengan pelarut 250 mL etanol 96% dan digojog

menggunakan shaker selama 6 jam dan didiamkan selama 18 jam. Maserasi dilakukan

berulang-ulang (remaserasi) menggunakan pelarut yang sama hingga filtrat berwarna

jernih. Ekstrak dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga volume

ekstrak mencapai kurang lebih setengah dari volume awal. Proses pemekatan dilanjutkan

dengan menguapkan ekstrak di atas waterbath hingga diperoleh ekstrak kental dengan

bobot tetap. Lalu dilakukan perhitungan rendemen ekstrak.

Fraksinasi

Fraksinasi dilakukan dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan 5 g ekstrak

etanol 96% menggunakan air sebanyak 75 mL lalu diletakkan diatas waterbath sambil

diaduk hingga larut. Setelah itu di masukkan ke dalam corong pisah dan difraksinasi

menggunakan kloroform sebanyak 25 mL. Diperoleh fraksi air dan fraksi kloroform.

Fraksi kloroform dipisahkan, kemudian fraksi air difraksinasi lagi dengan kloroform

sebanyak 25 mL dilakukan hingga 3 kali sehingga pelarut kloroform yang digunakan

sebanyak 75 mL. Fraksi klorofrom pertama, kedua, dan ketiga dikumpulkan. Sisa fraksi air

difraksinasi dengan pelarut etil asetat sebanyak 25 mL dilakukan hingga 3 kali sehingga

pelarut etil asetat yang digunakan sebanyak 75 mL. Fraksi etil asetat pertama, kedua, dan

ketiga dikumpulkan. Fraksi dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator dan

dilanjutkan dengan penguapan kembali di atas waterbath hingga diperoleh ekstrak kental

dengan bobot tetap dan dihitung rendemen fraksi.


4

Isolasi Fraksi

Isolasi dilakukan dengan KLT preparatif menggunakan fase diam plat silika Gel

60 F254 dengan ukuran 10 cm x 20 cm. Plat KLT diaktifasi dengan cara dipanaskan pada

suhu 100 oC dalam oven selama 1 jam. Pertama, fraksi kloroform dan etil asetat 100 mg

dilarutkan menggunakan 10 mL etanol 96%, kemudian diinjeksikan 25,0 µL dengan

mikropipet di sepanjang plat pada jarak 1 cm dari garis bawah, 1 cm dari garis tepi, 1 cm

antar spot. Setelah itu dielusi menggunakan fase gerak n-butanol : asam asetat : air (BAA)

(4:1:5). Elusi dihentikan setelah gerakan fase gerak sampai pada garis batas. Hasil elusi

akan terbentuk pita dimana masing-masing diukur nilai Rf nya. Setelah itu bercak-bercak

diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Isolat-isolat

yang diperoleh dari hasil KLT preparatif diambil dengan cara mengerok pita-pita pada fase

diam yang telah terbentuk kemudian serbuk dilarutkan dengan metanol p.a sebanyak 10

mL dan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm untuk mengendapkan

fase diamnya. Supernatan diambil sebagai isolat.

Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat

Identifikasi dilakukan dengan cara isolat masing-masing fraksi diambil 1,0-2,0

mL dan diukur panjang gelombangnya menggunakan spektrofotometer visible pada λ 200-

600 nm, untuk mengetahui λ senyawa flavonoid. Bila spektrum menunjukan spektrum

khas flavonoid pita II (240-285) nm dan pita I (300-550), isolat ditambahkan reagen

pereaksi geser yaitu AlCl3 5% sebanyak 6 tetes, HCl sebanyak 3 tetes, NaOH 2 M

sebanyak 3 tetes secara bergantian kemudian diukur panjang gelombangnya menggunakan

spektrofotometer visibel.

Uji Aktivitas Antioksidan

Uji pendahuluan (penentuan panjang gelombang DPPH dan operating time (OT))

Larutan DPPH dibuat dengan konsentrasi 40 µg/mL dan diukur serapannya

menggunakan spektrofotometer UV/Vis pada panjang gelombang 400-600 nm. Lalu

ditentukkan panjang gelombang maksimal (λmaks). Penentuan OT dilakukan dengan

menggunakan 0,2 mL standar rutin dalam 3 seri konsentrasi (10 µg/mL, 30 µg/mL, 50

µg/mL) lalu mereaksikannya dengan 3,8 mL larutan DPPH. Kemudian dilakukan

pengukuran pada λ maksimum pada titik waktu 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55;

dan 60 menit. OT ditentukan pada waktu dimana terjadi penurunan absorbansi yang tidak

signifikan (stabil).


5

Uji Aktivitas Antioksidan Rutin

Uji aktivitas antioksidan rutin dilakukan dengan menimbang 10 mg rutin dan

dilarutkan menggunakan 10 mL metanol p.a hingga homogen (konsentrasi 1000 µg/mL).

Kemudian dibuat 5 seri konsentrasi rutin (20, 40, 60, 80, 100 µg/mL). Masing-masing

konsentrasi diambil 0,2 mL rutin ditambahkan dengan 3,8 mL DPPH lalu didiamkan

selama OT, diukur pada λ maksimum dan dihitung nilai IC50. Blanko dibuat menggunakan

0,2 mL metanol p.a dan 3,8 mL DPPH lalu didiamkan selama OT, diukur pada panjang

gelombang maksimum (λmaks). Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Kloroform dan Fraksi Etil Asetat

Uji aktivitas antioksidan fraksi dilakukan dengan menimbang 40 mg fraksi

kloroform (konsentrasi 4000 µg/mL) dan 60 mg fraksi etil asetat (konsentrasi 6000 µg/mL)

lalu dilarutkan menggunakan 10 mL metanol p.a hingga homogen. Kemudian dibuat 5 seri

konsentrasi dari masing-masing fraksi. Seri konsentrasi fraksi kloroform yang digunakan

yaitu 160 µg/mL, 320 µg/mL , 480 µg/mL, 640 µg/mL, 800 µg/mL, sedangkan untuk

fraksi etil asetat, seri konsentrasi yang digunakan yaitu 120 µg/mL, 240 µg/mL , 360

µg/mL, 480 µg/mL, 600 µg/mL. Masing-masing konsentrasi diambil 0,2 mL fraksi

ditambahkan dengan 3,8 mL DPPH lalu didiamkan selama OT, diukur pada λ maksimum

dan dihitung nilai IC50. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali untuk masing-masing fraksi.

Perhitungan Nilai IC50

Nilai IC50 dihitung berdasarkan presentase hambat terhadap radikal bebas DPPH

dari masing-masing konsentrasi larutan sampel dengan rumus :

Kemudian dihitung nilai IC50 berdasarkan persamaan regresi linear lalu diuji

normalitas menggunakan Shapiro-wilk dengan taraf kepercayaan 95% dan diuji T tidak

berpasangan (data terdistribusi normal) menggunakan aplikasi R 3.2.4 untuk menentukan

signifikansi perbedaan nilai IC50 fraksi kloroform dan fraksi etil asetat daun tanaman adam

hawa.


6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi dilakukan untuk memastikan identitas dari suatu tanaman sehingga

sampel tanaman yang digunakan benar-benar sesuai dengan kriteria acuan yang digunakan.

Hasil dari determinasi tanaman menyatakan bahwa sampel yang digunakan adalah tanaman

adam hawa (Rhoe discolor (L'hér.) Hance). Daun tanaman adam hawa yang telah

ditimbang, disortasi basah untuk memisahkannya dari pengotor dan bagian yang tidak

terpakai lalu dicuci menggunakan air bersih mengalir untuk menghilangkan kotoran yang

masih terdapat pada daun. Setelah itu, daun dipotong-potong untuk mempercepat

pengeringan. Daun tanaman adam hawa dikeringkan selama 12 hari menggunakan oven

dengan bantuan blower. Pengeringan menggunakan oven dengan bantuan blower yaitu

agar senyawa tidak rusak akibat suhu yang terlalu tinggi dan mengoptimalkan pengeringan.

Tujuan dari pengeringan adalah untuk meminimalkan kandungan air di dalam simplisia

sehingga tidak ditumbuhi bakteri atau jamur. Daun tanaman adam hawa kering dihaluskan

menggunakan blender dan diayak menggunakan ayakan nomer mesh 40 hingga didapatkan

serbuk simplisia daun tanaman adam hawa. Proses penghalusan simplisia menjadi serbuk

bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga luas permukaan menjadi lebih besar

yang dapat membuat proses ekstraksi menjadi maksimal karena luas area kontak antara

simplisia dan larutan penyari menjadi lebih besar. Pengayakan bertujuan untuk

menghomogenkan ukuran partikel, selain itu ukuran serbuk simplisia berpengaruh terhadap

rendemen ekstrak yang diperoleh (Sapri et al., 2014). Didapatkan berat serbuk simplisia

sebesar 50,34 g dengan rendemen sebesar 4,851% b/b. Nilai rendemen serbuk terbilang

kecil, hal ini disebabkan karena masih tingginya kandungan air dalam simplisia.

Ekstraksi dilakukan dengan metode ekstraksi dingin yaitu maserasi. Metode

maserasi digunakan karena senyawa flavonoid tidak stabil pada suhu tinggi sedangkan

maserasi dilakukan pada suhu ruangan sehingga tidak akan merusak senyawa flavonoid.

Pelarut etanol 96% digunakan karena etanol bersifat semipolar dan senyawa flavonoid

larut pada etanol. Proses remaserasi dilakukan untuk mengoptimalkan rendemen ekstrak

yang diperoleh. Maserasi dibantu menggunakan shaker dengan tujuan untuk meningkatkan

kelarutan dan mengoptimalkan maserasi. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan

menggunakan vacuum rotary evaporator agar pemekatan berlangsung lebih cepat dan

digunakan panas yang tidak terlalu tinggi (40oC) agar senyawa tidak rusak. Didapatkan

bobot tetap ekstrak sebesar 7,9706 g dengan rendemen sebesar % b/b.


7

Metode fraksinasi yang digunakan yaitu metode ekstraksi cair-cair dimana

merupakan metode pemisahan menggunakan prinsip “like dissolve like” dimana zat akan

terlarut pada pelarut yang memiliki polaritas yang sesuai dan senyawa akan terdistribusi

berdasarkan koefisien partisinya. Fraksinasi dilakukan menggunakan pelarut kloroform

(non polar) dan etil asetat (semi polar) karena senyawa antosianidin larut pada kloroform

dan etil asetat. Bobot tetap fraksi kloroform ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa

dari tiga kali fraksinasi sebesar 0,6483 g dengan rendemen sebesar 12,9512% b/b,

sedangkan bobot tetap fraksi etil asetat ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa dari

tiga kali fraksinasi sebesar 0,4810 g dengan rendemen sebesar 9,6090% b/b. Rendemen

dari fraksi etil asetat kecil, hal ini disebabkan karena kloroform lebih banyak melarutkan

senyawa pada fraksi air dibanding etil asetat.

Isolasi dilakukan dengan metode KLT Preparatif dengan tujuan untuk

memisahkan dan memurnikan senyawa flavonoid dalam fraksi. Isolasi dilakukan

menggunakan fase diam silika Gel 60 F254 yang bersifat polar dan eluen n-butanol : asam

asetat : air (BAA) (4:1:5) yang bersifat lebih polar dibanding fase diamnya sehingga

senyawa flavonoid dapat terelusi serta terpisah dengan baik. Eluen yang baik adalah eluen

yang bisa memisahkan senyawa dalam jumlah yang banyak, ditandai dengan munculnya

bercak dengan jarak yang jelas antara bercak satu dan bercak lainnya serta tidak berekor

(Harbone, 1987). Aktifasi plat KLT dilakukan dengan di oven selama 1 jam dengan suhu

100oC untuk menghilangkan air pada plat KLT.

Tabel 1. Nilai Rf yang dihasilkan pada KLT Preparatif

Fraksi Nilai Rf (cm) Warna Pita pada UV

Keterangan 254 nm 366 nm

Kloroform

Isolat 1 0,5 Abu-abu Abu-abu Bukan pita

Isolat 2 0,875 - Biru Senyawa flavonoid

Isolat 3 0,9375 Hijau Merah Jingga Klorofil

Etil Asetat

Isolat 1 0,475 Abu-abu Abu-abu Bukan pita

Isolat 2 0,875 - Biru Senyawa flavonoid

Isolat 3 0,975 Hitam Merah Jingga Klorofil

Tabel 1 menunjukkan terdapat tiga isolat dari fraksi kloroform dan fraksi etil

asetat. Masing-masing isolat yang terbentuk dikerok dan diukur λ tiap isolat menggunakan

spektrofotometer UV-Vis untuk melihat apakah isolat tersebut termasuk senyawa

flavonoid atau bukan. Spektrum khas flavonoid pada pita II (240-285) nm dan pita I (300-

550) nm. Isolat 1 fraksi kloroform tidak terbaca panjang gelombangnya pada

spektrofotometer UV-Vis karena diduga tidak adanya senyawa flavonoid pada isolat


8

tersebut. Isolat 3 fraksi etil asetat memiliki serapan pada 402 nm, sedangkan isolat 3 fraksi

kloroform memiliki serapan pada 422 nm. Kedua isolat tersebut diduga merupakan

senyawa klorofil karena pita yang terbentuk berwarna hijau ketika dilihat pada lampu UV

254 nm. Isolat 1 fraksi etil asetat memiliki serapan pada 215 nm dan isolat tersebut tidak

termasuk dalam spektrum khas senyawa flavonoid sehingga dapat diduga bahwa kedua

isolat tersebut bukan senyawa flavonoid. Isolat 2 fraksi kloroform hanya memiliki serapan

pada 538 nm sedangkan isolat 2 fraksi etil asetat memiliki serapan pada 537 nm dan 248

nm. Kedua isolat ini memiliki serapan yang termasuk dalam spektrum khas senyawa

flavonoid sehingga diduga kedua isolat ini merupakan senyawa flavonoid dan dilakukan

identifikasi jenis flavonoid menggunakan pereaksi geser.

Tabel II. Identifikasi Senyawa Flavonoid Fraksi Kloroform dengan Pereaksi

Geser

Reagen λ (nm) Mula-mula Pergeseran λ (nm)

Keterangan Pita I Pita II Pita I Pita II

Metanol 538 - Tetap - Antosianidin

Metanol +

NaOH 2N

- 217,5 - - Nihil

Metanol +

AlCl3 5%

537,5 223,5 -0,5 - Tidak ada o-diOH

Metanol +

AlCl3 5% +

HCl

537,5 208,5 -0,5 - Tidak ada o-diOH

Tabel III. Identifikasi Senyawa Flavonoid Fraksi Etil Asetat dengan Pereaksi

Geser

Reagen

λ (nm) Mula-mula Pergeseran λ (nm)

Keterangan Pita I Pita II Pita I

Pita

II

Metanol 537 248 Tetap Tetap Antosianidin

Metanol +

NaOH 2N

- 253 - +5 Nihil

Metanol +

AlCl3 5%

537 231 Tetap -17 Tidak ada o-diOH

Metanol +

AlCl3 5% +

HCl

537 208,5 Tetap -39,5 Tidak ada o-diOH

Pada Tabel II dapat dilihat bahwa fraksi kloroform hanya memiliki satu serapan

pada panjang gelombang 538 nm dalam pelarut metanol dan dapat digolongkan dalam

golongan antosianidin karena senyawa antosianidin merupakan senyawa flavonoid yang

memiliki spektrum khas yaitu pada panjang gelombang sekitar 500 nm (Harbone, 1987).

Pada Tabel III dapat dilihat bahwa fraksi etil asetat memiliki spektrum khas flavonoid pada


9

panjang gelombang 537 nm dan 248 nm dalam pelarut metanol dan dapat digolongkan

dalam golongan antosianidin. Kedua fraksi tersebut merupakan senyawa malvidin karena

menurut Aziz dan Djamil (2013), senyawa antosianidin memiliki pita warna biru pada

kromatografi kertas. Setelah direaksikan dengan pereaksi AlCl3 5%, tidak ada pergeseran

panjang gelombang yang signifikan sehingga diduga bahwa senyawa ini merupakan

senyawa malvidin (Harbone, 1987).

Gambar 1. Struktur Malvidin

Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH. DPPH digunakan sebagai

senyawa radikal bebas. Senyawa flavonoid memiliki aktivitas antioksidan karena flavonoid

dapat memberikan atom hidrogen pada senyawa radikal bebas DPPH sehingga DPPH

menjadi stabil dan tidak reaktif.

Gambar 2. Mekanisme reaksi flavonoid menghambat radikal bebas DPPH

Uji aktivitas antioksidan DPPH diawali dengan penentuan panjang gelombang

maksimum (λmaks) dilakukan menggunakan DPPH konsentrasi 40 µg/mL dan didapatkan

λmaks sebesar 515 nm. Panjang gelombang maksimum ditentukan untuk melihat serapan

DPPH yang paling optimal. Operating time dilakukan dengan menggunakan rutin dengan 3

seri konsentrasi supaya dapat merepresentasikan operating time dari 3 konsentrasi yang

berbeda yaitu konsentrasi tinggi (50 µg/mL), sedang (30 µg/mL), dan rendah (10 µg/mL).

Rutin yang direaksikan dengan DPPH diukur pada λmaks (515 nm) dan didapatkan OT

yaitu 25 menit. Dari hasil OT dapat dikatakan bahwa pada waktu 25 menit, terjadi

penurunan absorbansi optimal DPPH setelah bereaksi dengan rutin.

Uji aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH pada rutin (baku

pembanding), fraksi kloroform dan fraksi etil asetat ekstrak etanol 96% daun tanaman


10

adam hawa. Tujuan dari uji ini yaitu ingin melihat kemampuan rutin, fraksi kloroform dan

fraksi etil asetat dalam menghambat aktivitas radikal bebas DPPH yang dinyatakan dalam

%IC (persen hambat). Uji aktivitas antioksidan rutin dan fraksi dilakukan menggunakan 5

seri konsentrasi dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali pada masing-masing konsentrasi.

Seri konsentrasi yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan rutin yaitu 20, 40, 60, 80,

100 µg/mL. Seri konsentrasi fraksi kloroform yang digunakan 160, 320, 480, 640, 800

µg/mL, sedangkan fraksi etil asetat menggunakan seri konsentrasi 400, 800, 1200, 1600,

2000 µg/mL. Masing-masing konsentrasi dari tiap replikasi diukur absorbansinya pada

λmaks (515 nm) dan Operating time (OT) selama 25 menit.

Rutin digunakan sebagai baku pembanding karena rutin diketahui merupakan

senyawa flavonoid. Rutin merupakan senyawa tunggal yang stabil dan memiliki aktivitas

antioksidan yang dapat menghambat reaktifitas senyawa radikal bebas DPPH (Lima et al.,

2011). Pada pengujian ini dilakukan 3 kali replikasi pada setiap konsentrasi. Tujuan dari

dilakukannya replikasi yaitu untuk melihat keterulangan hasil. Pada penelitian ini tidak

dilakukan validasi metode karena metode DPPH merupakan metode yang sudah baku

sehingga penelitian ini hanya dilakukan verifikasi metode.

20

µg/ml

40

µg/ml

60

µg/ml

80

µg/ml

100

µg/ml

Replikasi 1 18.8862 33.0509 45.3995 55.0848 73.0024

Replikasi 2 16.3573 27.8422 40.9513 51.9722 67.4014

Replikasi 3 17.5991 29.7203 44.289 54.1958 72.3776

01020304050607080

%IC

Gambar 3. Grafik konsentrasi rutin terhadap %IC

Gambar 4. Grafik konsentrasi fraksi kloroform terhadap %IC

r = 0,9911

r = 0,9929

r = 0,9909

r = 0,9960

r = 0,9985

r = 0,9964


11

Gambar 5. Grafik konsentrasi fraksi etil asetat terhadap %IC

Pada ketiga grafik tersebut dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi,

aktivitas antioksidan (%IC) yang didapat semakin besar. Dari ketiga grafik tersebut

dihitung nilai r dimana nilai tersebut menggambarkan korelasi hubungan antara konsentrasi

dengan %IC berbanding lurus, dimana semakin tinggi konsentrasi fraksi/baku maka %IC

juga semakin besar. Nilai r yang bagus adalah yang mendekati 1 dan ketiga grafik diatas

memiliki nilai r yang mendekati 1 yang menunjukkan linearitas yang baik (Gandjar dan

Rohman, 2007). Hasil persamaan regresi linier digunakan untuk menghitung nilai IC50.

Semakin kecil konsentrasi yang dapat memberikan nilai IC50 yang besar maka aktivitas

antioksidan senyawa tersebut semakin baik. Tingkat aktivitas antioksidan dibagi menjadi 4

berdasarkan nilai IC50 yaitu sangat kuat (<50 µg/mL), kuat (50-100 µg/mL), sedang (110-

150 µg/mL), dan lemah (>150 µg/mL) (Fidrianny et al.,2014).

Tabel IV. Nilai IC50 dan Penggolongan Tingkat Aktivitas Antioksidan Rutin,

Fraksi Kloroform, dan Fraksi Etil Asetat

Sampel IC50 (µg/mL) Rerata ± SD

(µg/mL)

Intensitas

Antioksidan

Rutin

Replikasi 1 67,550

70,484 ± 3,536 Kuat Replikasi 2 74,410

Replikasi 3 69,492

Fraksi

Kloroform

Replikasi 1 783, 713

767,104 ± 33,676 Lemah Replikasi 2 789,248

Replikasi 3 728,350

Fraksi Etil

Asetat

Replikasi 1 512, 933

522,939 ± 9,0302 Lemah Replikasi 2 525,400

Replikasi 3 530,483

Dari Tabel IV dapat dilihat bahwa nilai IC50 fraksi kloroform dan fraksi etil asetat

jauh lebih besar dibanding rutin, ini menunjukkan bahwa kandungan senyawa antosianidin

r = 0,9934

r = 0,9918

r = 0,9977


12

pada kedua fraksi sedikit sehingga membutuhkan konsentrasi yang besar untuk

menghambat 50% aktivitas radikal bebas DPPH.

Uji statistik dilakukan menggunakan aplikasi R untuk memastikan perbedaan

bermakna dari nilai IC50 rutin, fraksi kloroform, dan fraksi etil asetat. Uji normalitas suatu

data dikatakan terdistribusi normal yaitu jika nilai p-value >0,05. Hasil uji normalitas data

statistik didapatkan nilai p-value rutin sebesar 0,5313, fraksi kloroform sebesar 0,1571, dan

fraksi etil asetat sebesar 0,5499 sehingga dapat dikatakan bahwa rutin, fraksi kloroform,

dan fraksi etil asetat memiliki data yang terdistribusi normal. Uji parametrik menggunakan

uji t tidak berpasangan dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan antara nilai IC50

rutin dengan fraksi kloroform, serta nilai IC50 rutin dengan fraksi etil asetat. Nilai p-value

dengan taraf kepercayaan 95% yang didapat yaitu 0,0006918 dan 0,0001406 sehingga

dapat dikatakan bahwa terdapat perbedaan signifikan antara nilai IC50 rutin dengan fraksi

kloroform dan fraksi etil asetat serta memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kecil

dibanding rutin dengan perbedaan bermakna.

KESIMPULAN DAN SARAN

Fraksi kloroform ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa diduga

mengandung senyawa antosianidin yaitu malvidin dan memiliki aktivitas antioksidan

dengan nilai IC50 sebesar 767,104 ± 33,676 µg/mL sedangkan fraksi etil asetat etanol 96%

daun tanaman adam hawa juga diduga mengandung senyawa antosianidin yaitu malvidin

dan memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50522,939 ± 9,0302 µg/mL.

Saran untuk penelitian berikutnya yaitu dilakukan uji aktifitas antioksidan dari

isolat, mengidentifikasi jenis dan struktur senyawa flavonoid menggunakan metode

karakterisasi lain seperti IR, GC-MS, LC-MS dan lain-lain serta melakukan pengukuran

kadar malvidin dalam fraksi dan isolat daun tanaman adam hawa.


13

DAFTAR PUSTAKA

Avila, M., Gonzalez, A., Arriaga, M., Garzaa, M., Carmen, M., 2003. Antigenotoxic,

antimutagenic and ROS scavenging activities of a Rhoeo discolor ethanolic crude

extract. Toxicology in Vitro., 17, 77-83.

Aziz, Z., Djamil, R., 2013. Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Dari Fase N-

Butanol Daun Jeruk Purut (Citrus hystrix. DC). Seminar POJAKNAS TOI ke-XLIV,

Palembang.

Fidrianny, I., Darmawanti, A., dan Sukrasno, 2014. Antioxidant Capacities From Different

Polarities Extracts of Cucurbitaceae Leaves Using Frap, DPPH Assays And

Correlation With Phenolic, Flavonoid, Carotenoid Content. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, (6), 858-862.

Gandjar, I., G., dan Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, 252-469.

Handayani, P. A., dan Rahmawati A., 2012. Pemanfaatan Kulit Buah Naga (Dragon Fruit)

Sebagai Pewarna Alami Makanan Pengganti Pewarna Sintesis. Jurnal Bahan Alam

Terbarukan, Semarang, 1 (2), 19-24.

Harborne, J., 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.

Cetakan Ketiga, Penerjemah: Padmawinata, K. dan I. soediro., Penerbit ITB,

Bandung, 71-80.

Jawi, dkk., 2007. Efek Antioksidan Ekstrak Umbi Ubi Jalar Ungu (Ipomoiea batatas L)

terhadap Hati setelah Aktivitas Fisik Maksimal Dengan Melihat Kadar AST dan

ALT Darah pada Mencit. Dexa Media, 3 (20), 52-53.

Kim, D.K., Lee, K.W., Lee, H.J., and Lee, C.Y., 2002. Vitamin C Equivalent Antioxidant

capacity (VCEAC) of Phenolic Phytochemicals. J. Agric. Food Chem, 50, 3713-

3717.

Lima, A.D.J.B., Corrêa, A.D., Saczk, A.A., Martins, M.P., Castilho, R.O., 2011.

Anthocyanins, Pigment Stability And Antioxidant Activity In Jabuticaba (Myrciaria

cauliflora (Mart.) O. Berg), Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal – SP, 33 (3), 877-887.

Rosales-Reyes et al., 2007. Aqueous Crude Extract of Rhoeo discolor, A Mexican

Medicinal Plant, Decrease the Formation of Liver Preneoplastic Foci in Rats. Journal

of Ethnopharmacology, 381-386.

Sapri, A., Fitriani, Narulita, R., 2014. Pengaruh Ukuran Serbuk Simplisia terhadap

Rendemen Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) dengan Metode

Maserasi. HKI-Kaltim, 1-4.

Sitorus, R.M.H., Wullur, A.C., Paulina, V.Y.Yamlean, 2012. Isolasi Dan Identifikasi

Senyawa Flavanoid Pada Daun Adam Hawa (Rhoe discolor). Pharmacon, 1 (1), 53-

57.

Socaciu, C., 2007. Food Colorants: Chemical and Functional Properties. CRC Press,

London, 55-56.

Steenis, Van., Bloembergen, Eyma, PJ., 1992. Flora Untuk Sekolah di Indonesia.

Percetakan Penebar Swadaya, Jakarta, 43-51, 136-138.


14

Tensiska dan Sukarminah, E., 2007. Ekstraksi Pewarna Alami dari Buah Arben dan

Aplikasinya Pada Sistem Pangan. Jurnal Teknol dan Industri Pangan, 25-31.

Winarsi, W., 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Kanisius, Yogyakarta, 15, 79-

81.


15

LAMPIRAN

Lampiran 1. Tanaman adam hawa

Gambar Tanaman Adam Hawa untuk Deteminasi Tanaman

Gambar Simplisia Daun Adam Hawa yang Sudah Kering


16

Lampiran 2. Surat keterangan hasil determinasi tanaman


17

Lampiran 3. Sampel Daun Tanaman Adam Hawa

Data Penimbangan

Daun Basah Tanaman Adam Hawa

Berat Wadah (g) Berat Wadah +

Sampel (g)

Berat Wadah +

Sisa Sampel (g)

Berat Sampel (g)

349,59 1387,22 349,59 1037,63

Serbuk Simplisia Daun Tanaman Adam Hawa


Sampel (g)

Berat Wadah +

Sisa Sampel (g)

Berat Sampel (g)

357,10 407,44 357,10 50,34

Rendemen Serbuk:

%rendemen =

%rendemen = = 4,851% b/b

Lampiran 4. Maserasi dan Fraksinasi

Data Penimbangan

Sampel serbuk yang digunakan untuk maserasi


Sampel (g)

Berat Wadah +

Sisa Sampel (g)

Berat Sampel (g)

1,426 51,389 1,513 49,876

Bobot tetap ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa

Ekstrak (g)

Wadah (g) 72,4432

Wadah + Isi (g) 80,4138

Isi (g) 7,9706

Rendemen Ekstrak:

%rendemen =


18

Fraksinasi

Data penimbangan ekstrak etanol 96%

Wadah (g) Wadah + Isi (g) Isi (g)

62,5218 67,5275 5,0057

Penimbangan Bobot Tetap Fraksi Kloroform

Fraksi (g)

Wadah (g) 52,0085

Wadah + Isi (g) 52,6568

Isi (g) 0,6483

Rendemen Fraksi Kloroform:

%rendemen =

%rendemen = = 12,9512% b/b

Penimbangan Bobot Tetap Fraksi Etil Asetat

Fraksi (g)

Wadah (g) 53,6101

Wadah + Isi (g) 54,0911

Isi (g) 0,4810

Rendemen Fraksi Etil Asetat:

%rendemen =

%rendemen = = 9,6090% b/b


19

Lampiran 5. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid

Penimbangan Fraksi Kloroform (100 mg)


61,9091 62,0100 0,1009

Data Penimbangan Fraksi Etil Asetat (100 mg)


44,5169 44,6229 0,1060

KLT Preparatif

Konsentrasi Fraksi Kloroform = = 10,09 mg/mL

Konsentrasi Fraksi Etil Asetat = = 10,60 mg/mL

Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Kloroform Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman

Adam Hawa pada UV 254 nm

Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Kloroform Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman



20

Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman


Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman


Gambar Spektra Fraksi Kloroform Isolat 2 dalam Metanol


21

Gambar Spektra Fraksi Kloroform Isolat 2 dalam NaOH

Gambar Spektra Fraksi Kloroform Isolat 2 dalam AlCl3 + HCl

Gambar Spektra Fraksi Etil Asetat Isolat 2 dalam Metanol


22

Gambar Spektra Fraksi Etil Asetat Isolat 2 dalam NaOH

Gambar Spektra Fraksi Etil Asetat Isolat 2 dalam AlCl3 + HCl

Lampiran 6. Uji Aktivitas Antioksidan (DPPH)

Penimbangan DPPH (10 mg)

Replikasi Wadah (g) Wadah + Isi (g) Isi (g)

1 50,3486 50,3586 0,0100

2 50,0332 50,0434 0,0100

3 62,5513 62,5612 0,0099

4 62,5484 62,5584 0,0100

Perhitungan Pengenceran Konsentrasi DPPH

- Replikasi 1

a. Konsentrasi Stok DPPH (100 µg/mL)

10 mg/100 mL = 0,1 mg/mL = 100 µg/mL

b. Konsentrasi Seri DPPH (40 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2

100 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40 mL


23

- Replikasi 2


10 mg/100 mL = 0,1 mg/mL = 100

µg/mL


M1 x V1 = M2 x V2

100 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40 mL

- Replikasi 3

a. Konsentrasi Stok DPPH (99,0 µg/mL)

9,90 mg/100 mL = 0,0990 mg/mL = 99,0

µg/mL


M1 x V1 = M2 x V2

99 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40,40 mL

- Replikasi 4


10 mg/100 mL = 0,1 mg/mL = 100

µg/mL


M1 x V1 = M2 x V2

100 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40 mL

Penentuan Panjang Gelombang

Panjang gelombang maksimum yang didapat dengan konsentrasi DPPH 40 µg/mL adalah 515

nm

Gambar Spektra DPPH dengan Konsetrasi 40 μg/mL


24

Penentuan OT

Konsentrasi Stok Rutin (1000 µg/mL)

10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1000 µg/mL

Konsentrasi Seri Rutin

Konsentrasi Seri (10 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 10 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,1 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 30 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,3 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 50 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,5 mL

Uji Aktivitas Antioksidan Rutin

Penimbangan Rutin (10 mg)


1 50,0590 50,0690 0,0100

2 64,6723 64,6823 0,0100

3 65,6337 65,6438 0,0101

Perhitungan Konsentrasi Rutin

Replikasi 1

a. Konsentrasi Stok Rutin (1000 µg/mL)

Waktu (menit) Konsentrasi Rutin (µg/mL)

Keterangan 10 30 50

5 0,777 0,615 0,463

10 0,778 0,610 0,445

15 0,785 0,606 0,439

20 0,790 0,601 0,434

25 0,787 0,601 0,431 OT

30 0,794 0,603 0,435

35 0,800 0,604 0,435

40 0,807 0,610 0,439

45 0,813 0,613 0,439

50 0,818 0,616 0,441

55 0,822 0,614 0,437

60 0,829 0,617 0,439


25

10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1000 µg/mL

b. Konsentrasi Seri Rutin

- Konsentrasi Seri (20 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 20 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,2 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,4 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 60 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,6 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 80 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,8 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,0 mL

Replikasi 2


10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1000 µg/mL



M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 20 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,2 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,4 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 60 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,6 mL


M1 x V1 = M2 x V2


26

1000 µg/mL x V1 = 80 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,8 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,0 mL

Replikasi 3


10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1010 µg/mL



M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 20 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,1980 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,396 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 60 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,594 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 80 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,792 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,990 mL


27

y = -0,0053x + 0,7745

R² = 0,9933

r = 0,9966

Ablanko = 0,826

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

20 0,670

40 0,553

60 0,451

80 0,371

100 0,223

Konsentrasi

(µg/mL)

%IC

20 18,8862

40 33,0509

60 45,3995

80 55,0848

100 73,0024


28

y = 0,6513x + 6,0048

50 = 0,6513x + 6,0048

x = (50 – 6,0048) / 0,6513

x = 67,5498 µg/mL = IC50

R² = 0,992

r = 0,9960

y = -0,0054x + 0,8358

R² = 0,9971

r = 0,9985

Ablanko = 0,862

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

20 0,721

40 0,622

60 0,509

80 0,414

100 0,281

Konsentrasi

(µg/mL)

%IC

20 16,3573

40 27,8422

60 40,9513

80 51,9722

100 67,4014


29

y = 0,6311x + 3,0394

50 = 0,6311x + 3,0394

x = (50 -3,0394)/ 0,6311

X = 74,410 µg/mL = IC50

R² = 0,9971

r = 0,9985


30

y = -0,0058x + 0,8286

R² = 0,9928

r = 0,9964

Ablanko = 0,858

y = 0,6702x + 3,4266

50 = 0,6702x + 3,4266

x = (50 – 3,4266) / 0,6702

X = 69,492 µg/mL = IC50

R² = 0,9928

r = 0,9964

Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Baku Rutin

Replikasi Nilai IC50

(µg/mL)

Total

Nilai IC50

Rata-Rata

Nilai IC50

(µg/mL)

SD CV (%)

1 67,550

211,452 70,484 3,536 5,017 2 74,410

3 69,492

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

20 0,707

40 0,603

60 0,478

80 0,393

100 0,237

Konsentrasi

(µg/mL)

%IC

20 17,5991

40 29,7203

60 44,2890

80 54,1958

100 72,3776


31

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi

Penimbangan Fraksi Etil Asetat (60 mg)


1 60,1932 60,2532 0,0600

2 59,5119 59,5720 0,0601

3 61,6278 61,6879 0,0601

Konsentrasi Fraksi Etil Asetat

Replikasi 1

a. Konsentrasi Stok Fraksi Etil Asetat (6000 µg/mL)

60 g/ 10 mL = 6,0 mg/ mL = 6000 µg/mL

b. Konsentrasi Seri Fraksi Etil Asetat


M1 x V1 = M2 x V2

6000 µg/mL x V1 = 120 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,2 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6000 µg/mL x V1 = 240 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,4 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6000 µg/mL x V1 = 360 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,6 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6000 µg/mL x V1 = 480 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,8 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6000mL x V1 = 600 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,0 mL

Replikasi 2


60,1 mg/ 10 mL = 6,01 mg/ mL = 6010 µg/mL


32



M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 120 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,199 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 240 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,399 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 360 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,599 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 480 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,799 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 600 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,998 mL

Replikasi 3


60,1 mg/ 10 mL = 6,01 mg/ mL = 6010 µg/mL



M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 120 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,199 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 240 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,399 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 360 µg/mL x 10 mL


33

V1 = 0,599 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 480 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,799 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6010 µg/mL x V1 = 600 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,998 mL

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat

Diketahui :

Replikasi 1 Akontrol = 0,866



Replikasi

Konsentrasi

Fraksi

(µg/mL)

Absorbansi %IC Persamaan

regresi

IC50

(µg/mL)

1

120

240

360

480

600

0,629

0,585

0,499

0,441

0,398

27,3672

32,4480

42,3788

49,0762

54,0416

y = 0,0583x +

20,069

R² = 0,9869

r =0,9934

512, 933

2

120

240

360

480

600

0,626

0,554

0,487

0,458

0,393

26,5258

34,9765

42,8404

46,2441

53,8732

y = 0,055x +

21,103

R² = 0,9837

r = 0,9918

525,400

3

120

240

360

480

600

0,614

0,557

0,495

0,451

0,377

26,2905

33,1333

40,5762

45,8583

54,7419

y = 0,058x +

19,232

R² = 0,9955

r = 0,9977

530,483

Total IC50 (µg/mL) 1568,816

Rata-Rata IC50 (µg/mL) 522,939

SD 9,0302

CV (%) 1,727


34

Penimbangan Fraksi Kloroform (40 mg)


1 61,9610 62,0013 0,0403

2 64,0723 64,1125 0,0402

3 52,5106 52,5509 0,0403

Konsentrasi Fraksi Kloroform

Replikasi 1

a. Konsentrasi Stok Fraksi Kloroform (4030 µg/mL)

40,3 mg/ 10 mL = 4,03 mg/ mL = 4030 µg/mL

b. Konsentrasi Seri Fraksi Kloroform


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 160 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,397 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 320 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,794 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 480 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,191 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 640 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,588 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 800 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,985 mL

Replikasi 2

Konsentrasi Stok Fraksi Kloroform (4020 µg/mL)

40,2 mg/ 10 mL = 4,02 mg/ mL = 4020 µg/mL

Konsentrasi Seri Fraksi Kloroform


M1 x V1 = M2 x V2

4020 µg/mL x V1 = 160 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,398 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4020 µg/mL x V1 = 320 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,796 mL


35


M1 x V1 = M2 x V2

4020 µg/mL x V1 = 480 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,194 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4020 µg/mL x V1 = 640 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,592 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4020 µg/mL x V1 = 800 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,990 mL

Replikasi 3

a. Konsentrasi Stok Fraksi Kloroform (4030 µg/mL)

40,3 mg/ 10 mL = 4,03 mg/ mL = 4030 µg/mL

b. Konsentrasi Seri Fraksi Kloroform


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 160 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,397 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 320 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,794 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 480 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,191 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 640 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,588 mL


M1 x V1 = M2 x V2

4030 µg/mL x V1 = 800 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,985 mL


36

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Kloroform

Diketahui :




Replikasi

Konsentrasi

Fraksi

(µg/mL)

Absorbansi %IC Persamaa

n regresi

IC50

(µg/mL)

1

160

320

480

640

800

0,676

0,642

0,550

0,503

0,417

21,9400

25,8661

36,4896

41,9169

51,8476

y =

0,0474x +

12,852

R² =

0,9822

r =0,9911

783, 713

2

160

320

480

640

800

0,651

0,611

0,542

0,495

0,410

23,5915

28,2864

36,3850

41,9014

51,8779

y =

0,0439x +

15,352

R² =

0,9858

r = 0,9929

789,248

3

160

320

480

640

800

0,638

0,603

0,519

0,437

0,394

23,4094

27,6110

37,6951

47,5390

52,7011

y =

0,0491x +

14,238

R² =

0,9818

r = 0,9909

728,350

Total IC50 (µg/mL) 2301,311

Rata-Rata IC50 (µg/mL) 767,104

SD 33,676

CV (%) 4,390


37

Lampiran 7. Hasil Uji Statistik

Uji Normalitas


38

Uji T tidak berpasangan


39


40

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Isolasi, Identifikasi Dan Uji Aktivitas

Antioksidan Senyawa Flavonoid Fraksi Kloroform Dan Fraksi Etil

Asetat Daun Tanaman Adam Hawa (Rhoeo discolor (L'Hér.) Hance)

Dengan Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH)” memiliki

nama lengkap Hernalhis Esanda. Dilahirkan di Yogyakarta pada

tanggal 15 Juni 1995 dari pasangan Bapak Eko Subono dan Ibu Liem

Ik Ling. Penulis telah menyelesaikan pendidikan SD Tarakanita

Bumijo Yogyakarta pada tahun 2007, lalu melanjutkan pendidikan di

SMP Stella Duce 1 Yogyakarta pada tahun 2007 hingga 2010.

Penulis menempuh Sekolah Menengah Atas di SMA Stella Duce 1

Yogyakarta pada tahun 2010 hingga 2013. Penulis melanjutkan pendidikan tinggi di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2013 hingga 2016. Selama menjadi

mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis cukup aktif dalam

kegiatan kemahasiswaan dan kepanitiaan di Universitas Sanata Dharma antara lain:

Anggota Divisi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (2014-2015), Peserta

Pelatihan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa I, Panitia Pharmacy Road to School

(2014), Panitia Student Exchange Programme Committee (2014), Panitia Latihan

Kepemimpinan I ISMAFARSI, Panitia Pharmacy Performance (2014), Peserta Latihan

Kepemimpinan I, Asisten Dosen Praktikum Kimia Dasar (2015).


ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS · PDF file96% kemudian di fraksinasi menggunakan metode ekstraksi cair-cair dengan fase ... kloroform (non polar) dan etil asetat ... 5% (E.Merck),

Documents