I. PENDAHULUAN UMUM - repository.ipb.ac.id · jaringan, misalnya peptida antimikroba Snakin-1 (SN1) dari umbi kentang. Snakin ... aktivitas protein dalam menghambat proliferasi sel

I. PENDAHULUAN UMUM

A. Latar Belakang

Kecenderungan pemakaian bahan alam terutama tumbuh-tumbuhan sebagai

obat-obatan semakin meningkat, karena mahalnya obat sintetik dan berbagai efek

sampingnya yang merugikan. Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa

tanaman menghasilkan senyawa aktif yang berkhasiat sebagai obat.

Diantara senyawa aktif yang dihasilkan oleh tanaman diantaranya protein

bioaktif, yang biasanya digunakan sebagai protein pertahanan bagi tanaman

penghasilnya. Protein bioaktif tersebut diekspresikan pada berbagai organ dan

jaringan, misalnya peptida antimikroba Snakin-1 (SN1) dari umbi kentang. Snakin

mempunyai aktivitas anti bakteri dan anti jamur, menyebabkan agregasi pada

bakteri gram negatif dan gram positif (Segura et al. 1999). Protein anti jamur,

misalnya protein PR-5 dari daun labu (Cucurbita sp.) dan protein PR-5d dari daun

serta akar tembakau. Keduanya mempengaruhi permiabilitas membran plasma,

sehingga menyebabkan kebocoran membran dan keluarnya material intraseluler

dari organisme target (Cheong et al. 1997; Koiwa et al. 1997). Protein antivirus

dari akar Bougainvillea spectabilis (BAP 1) menunjukkan aktivitas penghambatan

sintesis protein secara in vitro (Balasaraswati et al. 1998). Protein anti virus

MAP 30 dari biji Momordica charanthia dan GAP 31 dari Gelonium multiflorum.

Kedua protein tersebut menghambat infeksi virus HIV-1 dan perkembangbiakan

virus pada sel yang sudah terinfeksi dengan menghambat HIV-integrase dan

menonaktifkan topologi HIV-LTR (Huang et al. 1999). Protein penginaktivasi

ribosom (ribosom inactivating protein = RIPs), menghambat sintesis protein pada

organisme lain. RIPs bekerja dengan memotong N-glikosida pada Subunit besar

ribosom pada situs spesifik, akibatnya ribosom tidak dapat berinteraksi dengan

faktor elongasi, sehingga menghambat perpanjangan rantai polipeptida (Endo

et al. 1987; Jensen et al. 1999).

Protein bioaktif menarik perhatian para peneliti karena dapat dikembangkan

potensinya sebagai senyawa toksik pada imunotoksin. Protein dikonjugasikan

dengan antibodi untuk mengenali sel target, sehingga tidak menyerang sel lainnya.

Imunotoksin digunakan untuk perlakuan penyakit penting pada manusia seperti

kanker, AIDS dan penyakit degeneratif (Minami et al. 1992; Girbes et al. 1993).

Protein bioaktif yang telah digunakan dalam imunotoksin antara lain

protein antivirus dari daun dan biji Phytolaca americana (PAP). PAP termasuk

kelompok protein penginaktivasi ribosom, yang dapat menahan serangan virus

pada tanaman maupun manusia seperti virus influenza, herpes simplek, polio dan

HIV-1. PAP dikonjugasikan dengan antibodi TXU (anti CD7) menjadi TXU-PAP

untuk perlakuan sel yang terinfeksi HIV. Konjugat TXU-PAP sangat efektif

dalam menghambat perkembangbiakan HIV-1 in vitro, efisiensi pengham-

batannya meningkat 400 kali dibanding dengan PAP, selain itu tidak toksik

terhadap sel-T (Anonym, 1998).

Untuk mendapatkan protein dari tanaman dapat diperoleh dengan

mengekstrak langsung tanaman yang berasal dari lapang, atau melalui kultur in

vitro. Keuntungan dari kultur in vitro adalah kultur dalam kondisi aseptik,

lingkungan tumbuh dapat diatur, dan waktu relatif pendek. Kultur in vitro yang

sering dilakukan untuk memproduksi suatu metabolit adalah kultur sel dan kultur

organ. Kendala yang sering terjadi antara lain pada tingkat sel seringkali metabolit

yang diinginkan tidak terbentuk, atau terbentuk tetapi jumlahnya sangat kecil.

Sedangkan untuk menjaga kelangsungan pertumbuhan sel atau jaringan

diperlukan zat pengatur tumbuh (ZPT). Pemberian ZPT pada suatu kultur secara

terus menerus dalam waktu lama dapat mengubah komposisi genetik sel, dan

berpengaruh terhadap pertumbuhan dan kestabilan metabolit yang dihasilkan

(Baiza et al. 1999).

Kultur in vitro yang lebih menjanjikan adalah kultur akar rambut (hairy

root) melalui bantuan Agrobacterium rhizogenes yang mampu mentransfer

sebagian materi genetiknya (T-DNA) ke genom tanaman. Ekspresi T-DNA dari

plasmid Ri (root inducing) mengakibatkan tumbuhya akar adventif dari tempat

infeksi. Keunggulan kultur akar rambut adalah akar dapat tumbuh dan

berkembang tanpa pemberian ZPT, karena terintegrasinya T-DNA dalam genom.

Oleh karenanya dapat menurunkan biaya produksi dan mempunyai kestabilan

genetik tinggi, sehingga pertumbuhan kultur serta metabolit yang diproduksi juga

lebih stabil.

Uji pendahuluan aktivitas protein dilakukan dengan uji kematian larva

udang (brine shrimp lethality test) menggunakan larva Artemia salina mengikuti

metode Meyer (1982). Menurut Hostettmann (1991) metodenya sederhana,

bahannya mudah didapat, relatif murah, perlu waktu singkat, dan mempunyai

korelasi positif dengan pengujian sitotoksisitas pada 3PS (P-388 murine leukemia

in vivo).

Uji selanjutnya menggunakan galur sel kanker in vitro untuk mengetahui

aktivitas protein dalam menghambat proliferasi sel kanker. Uji in vitro

menggunakan kultur sel dapat mengamati secara langsung pengaruh protein

terhadap viabilitas sel (Wilson, 1992). Uji in vitro sering dilakukan sebelum

melangkah ke uji in vivo karena lebih ekonomis dan cepat.

Kanker adalah salah satu penyakit yang mendapat perhatian besar dalam

ilmu kedokteran. Dengan perubahan pola hidup serta tingginya polusi, penderita

kanker semakin meningkat jumlahnya dari tahun ke tahun. Berbagai pengobatan

untuk penanggulangan penyakit kanker telah dilakukan, namun karena mahalnya

biaya pengobatan dan dampak sampingnya yang berat semakin banyak dicari obat

alternatif dari alam antara lain tumbuh-tumbuhan.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan bagian tanaman dari tiga spesies

Cucurbitaceae yaitu B. hispida (Thunb.) Cogn, Coccinia grandis (L.) Voigh.dan

T. cucumirena L. var anguina (L.) Haines, dan kultur akar rambut dari bagian

tanaman terpilih yang menghasilkan protein bioaktif dengan rendemen dan

aktivitas tinggi serta dapat menghambat proliferasi galur sel kanker in vitro.

Tujuan Khusus 1. Mendapatkan informasi dari bagian tanaman, yaitu akar, buah dan biji dari

tiga spesies Cucurbitaceae yang menghasilkan protein bioaktif dengan

rendemen dan aktivitas tinggi dan BM 20-40 kDa.

2. Mendapatkan kultur akar rambut dari spesies terpilih yang dapat tumbuh dan

berkembang dengan stabil dalam medium tanpa zat pengatur tumbuh dan

menghasilkan protein bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi.

3. Mendapatkan protein bioaktif dari dari bagian tanaman dan kultur akar rambut

terpilih yang dapat menghambat proliferasi galur sel kanker.

C. Hipotesis

1. A. rhizogenes mampu mentrasfer T-DNA ke genom tanaman T. cucumirena L.

var anguina (L.) Haines), sehingga dihasilkan kultur akar rambut yang dapat

tumbuh dan berkembang dalam medium tanpa zat pengatur tumbuh.

2. Terdapat bagian tanaman dan kultur akar rambut yang menghasilkan protein

bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi serta mempunyai BM

20-40 kDa.

3. Terdapat fraksi protein bioaktif asal tanaman dari lapang dan akar rambut

yang dapat menghambat proliferasi secara spesifik terhadap galur sel kanker

in vitro.

D. Manfaat Penelitian

Dari penelitian ini diharapkan :

1. Mendapatkan metode induksi dan pemeliharaan kultur akar rambut untuk

memproduksi protein bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi.

2. Mendapatkan informasi tentang bagian tanaman atau kultur akar rambut

yang menghasilkan protein bioaktif yang dapat menghambat proliferasi sel

kanker.

3. Meningkatkan nilai ekonomis dari beberapa spesies Cucurbitaceae dari

kelompok sayuran menjadi fitofarmaka.

E. Perumusan Masalah

Penelitian terdiri dari tiga tahap seperti tersaji dalam diagram alir penelitian

(gambar 1), yaitu :

1. Penapisan protein bioaktif dari bagian tanaman tiga spesies Cucurbitaceae,

bertujuan untuk mendapatkan informasi dari bagian tanaman yang

menghasilkan protein bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi

(Penelitian 1).

2. Induksi kultur akar rambut dari spesies terpilih untuk mendapatkan protein

bioaktif, dengan tujuan untuk mendapatkan kultur akar rambut yang dapat

tumbuh dan berkembang dengan stabil dalam medium tanpa ZPT serta

menghasilkan protein dengan rendemen dan aktivitas tinggi (Penelitian 2).

3. Uji aktivitas protein bioaktif dari bagian tanaman dan kultur akar rambut

terhadap proliferasi galur sel kanker in vitro, bertujuan mendapatkan protein

bioaktif dari bagian tanaman atau akar rambut terpilih yang dapat

menghambat proliferasi sel kanker (Penelitian 3).

Gambar 1. Diagram Alir Penelitian

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. DISKRIPSI CUCURBITACEAE

ekstraksi, fraksinasi, uji aktivitas, karakterisasi protein

Organ tanaman terpilih yang menghasilkan

protein bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi

I. Penapisan protein bioaktif dari bagian

tanaman pada tiga spesies Cucurbitaceae

II.Induksi kultur akar rambut dari spesies terpilih untuk

mendapatkan protein bioaktif

Klon akar rambut : ♣ dapat tumbuh dalam

medium tanpa ZPT ♣ menghasilkan protein

dengan rendemen dan aktivitas tinggi

Uji penghambatan proliferasi sel in vitro

- Konfirmasi transformasi - Seleksi klon

III.Uji aktivitas protein bioaktif dari bagian tanaman dan kultur

akar rambut terhadap proliferasi galur sel kanker in vitro.

Protein bioaktif dari bagian tanaman/kultur akar rambut terpilih yang menghambat

proliferasi sel kanker

1. Benincasa hispida (Thunb.) Cogn

Benincasa hispida (Thunb.) Cogn di Indonesia disebut bligo merupakan

tanaman tahunan, umumnya berumah satu. Tanaman tumbuh baik pada dataran

rendah, relatif toleran terhadap kekeringan. Batang tebal, menjalar hingga

mencapai panjang beberapa meter. Daun sederhana, panjang tangkai daun

5-20 cm, helaian daun berukuran 10-25 cm x 10-20 cm, dengan 5-7 sudut. Bunga

terletak pada ketiak daun, berwarna kuning, diameter 6-12 cm, panjang tangkai

bunga 5-15 cm pada bunga jantan dan 2-4 cm pada bunga betina, bunga jantan

mempunyai 5 benang sari. Buah besar, berbentuk lonjong, berukuran 20-60 cm x

10-25 cm, berwarna hijau tua, tertutup lapisan kapur, daging buah berwarna putih

dengan ketebalan 2-4 cm. Biji berbentuk pipih lonjong, berwarna kuning

kecoklatan, berukuran 10-15 mm x 5-7 mm x 1-2 mm. Perbanyakan tanaman

melalui biji, untuk perkecambahan biji perlu waktu 1-2 minggu. Berbunga pada

umur 50-80 hari setelah tanamm, penyerbukan memerlukan bantuan serangga.

Pemasakan buah 1-2 bulan setelah penyerbukan, buah muda dapat dipanen

1-2 minggu setelah berbunga, buah tua 100-160 hari setelah tanam (Rifai dan

Reyes, 1994).

2. Coccinia grandis (L.) Voigh

Coccinia grandis (L.) Voigh, di Indonesia dikenal dengan nama papasan

atau kemarongan, merupakan tanaman tahunan. Tempat tumbuh sampai dengan

ketinggian 1500 m, dengan kelembaban tinggi, dan tidak tahan genangan.

Tanaman ini berumah dua, merupakan herba menjalar dapat mencapai panjang

20 m, akar berumbi. Batang muda berwarna hijau, setelah tua berbintik putih dan

berkayu. Daun sederhana, berseling, panjang tangkai daun 1-5 cm, helaian daun

berukuran 3-12 cm x 3-15 cm dengan 3-5 sudut. Bunga jantan diketiak daun,

tunggal atau berpasangan, panjang tangkai bunga 0.7-7 cm, kelopak 5 helai

dengan panjang lebih dari 6 mm, mahkota berwarna kuning kemerahan. Bunga

betina juga diketiak daun, tunggal, panjang tangkai bunga lebih dari 2.5 cm. Bakal

buah silindris, panjang 1.5 cm, tangkai putik panjang 3 mm, kepala putik 3 lobi.

Buah berbentuk lonjong, berukuran 3-7 cm x 1-3.5 cm, buah muda berwarna hijau

dengan garis putih, setelah masak berubah merah, panjang tangkai buah 4 cm. Biji

pipih, umumnya berukuran 6mm x 3mm x 1.5 mm. Tanaman ini merupakan satu-

satunya Cucurbitaceae yang diperbanyak melalui stek. Daun dan buah muda

biasanya dimanfaatkan sebagai sayuran (Boonkerd et al. 1994).

4. Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines

Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines, di Indonesia ada yang

menyebutnya paria belut atau paria ular. Tempat tumbuh pada dataran rendah

tropis, tidak tahan kekeringan, perlu kelembaban tinggi, dan tidak tahan genangan.

Tanaman ini merupakan tanaman tahunan, berumah satu, berbatang lunak, dan

tumbuh menjalar. Daunnya sederhana dengan 5-7 lobi, berukuran 7-25cm x

8-20 cm, berambut halus, panjang tangkai daun 2-10 cm. Bunga jantan terdiri dari

5 bunga atau lebih, panjang tangkai bunga 10-30 cm. Buah silindris memanjang,

berukuran 30-180 cm x 2-10 cm, berwarna hijau keputihan saat masih muda dan

berubah kemerahan setelah tua. Biji tebal, berwarna cokelat, panjang 1-1,5 cm.

Berbunga sekitar 5 minggu setelah tanam, bunga jantan muncul lebih dulu, kira-

kira tiga hari kemudian diikuti bunga betina, penyerbukan dibantu serangga. Buah

muda berwarna hijau, dipanen 12-20 hari setelah berbunga atau setelah mencapai

panjang 30-60 cm, sedangkan buah tua 1-2 bulan kemudian. Perbanyakan

tanaman melalui biji, yang dipanen setelah buah benar-benar masak. Bagian

tanaman yang dimanfaatkan buahnya, digunakan sebagai sayuran (Gildemacher

et al. 1994).

B. PROSES PEMBENTUKAN AKAR RAMBUT

Agrobacterium adalah genus bakteri tanah familia Rhizobiaceae yang

bersifat gram negatif. Spesies Agrobacterium yang bersifat parasit pada tanaman

dan sudah dikenal luas adalah Agrobacterium tumefaciens dan Agrobacterium

rhizogenes. Kedua Agrobacterium tersebut dapat menginfeksi berbagai tanaman

spesies dikotil serta beberapa monokotil. A. tumefaciens menyebabkan timbulnya

tumor, sedangkan A. rhizogenes menyebabkan tumbuhnya akar adventif pada

tanaman yang terinfeksi. Timbulnya tumor maupun akar adventif tersebut akibat

ditransfernya sebagian materi genetik (T-DNA) dari Ti-plasmid A. tumefaciens

atau Ri-plasmid A. rhizogenes ke genom tanaman.

Menurut McClean (1998) pada proses transfer T-DNA terdapat dua tahap

penting yaitu terjadinya kontak antara Agrobacterium dengan sel tanaman dan

proses transfer T-DNA, dimana masing-masing tahap melibatkan sekelompok gen

yang berbeda. Selanjutnya adalah proses integrasi T-DNA didalam kromosom

tanaman.

a) Kontak antara Agrobacterium dengan sel tanaman

Dalam tahap ini diperlukan peranan dari gen-gen kromosom antara lain

dua lokus yang saling berpautan yaitu chvA dan chvB, dimana chvB berfungsi

mensintesis β-1-2glukan dan chvA mensekresikan senyawa tersebut. Mutasi pada

dua lokus tersebut menurunkan kemampuan Agrobacterium untuk kontak dengan

sel tanaman. Gen lainnya adalah pscA (ExoC) berperan dalam sintesis polisakarida

ekstraseluler.

b) Proses transfer DNA ke sel tanaman

Didalam proses transfer melibatkan berbagai gen vir yang terdiri dari virA,

virB, virD dan virG yang berpenanan dalam proses transfer, virC dan virE untuk

meningkatkan efisiensi transfer. Pada sel tanaman terluka mengeluarkan suatu

senyawa fenol dengan BM rendah yaitu asetosiringone (AS) atau hidroksi

asetosiringone (OH-AS). AS akan menginduksi ekspresi gen vir pada

Agrobacterium melalui dua sistem komponen yaitu komponen sensor disandi oleh

gen virA, dan komponen regulator oleh gen virG. VirA merupakan protein

membran dalam, berfungsi sebagai khemoreseptor untuk menangkap AS. Dengan

terdeteksinya senyawa AS oleh reseptor virA, AS ditransduksikan dari sensor

virA ke regulator virG, mengakibatkan terjadinya aktivasi virG. Selanjutnya virG

mengaktivasi ekspresi gen vir lainnya, diikuti terjadinya perubahan pada elemen

T-DNA. Gen virD memproduksi protein virD1 dan virD2 yang berfungsi sebagai

endonuklease untuk memotong kedua border dari T-DNA sehingga dihasilkan

utas T (T-strand), yaitu molekul intermediet yang ditransfer dari Agrobacterium

ke sel tanaman. Gen virC menghasilkan dua polipeptida yang berfungsi

meningkatkan aktivitas virD1 dan virD2 sebagai nuklease pada T-DNA border.

Gen virE memproduksi protein virE2 yang berperan dalam memproses utas T

menjadi DNA utas tunggal dan berikatan dengan T-DNA utas tunggal tersebut

membentuk ”ssDNA binding protein”. Selain virE2 protein lainnya yang

berikatan dengan DNA utas tunggal adalah protein virD2 yang berikatan pada

ujung 5', kedua protein tersebut berfungsi melindungi utas T dari degradasi

nuklease. Fungsi virD2 lainnya adalah sebagai helikase yang menjaga agar utas T

tidak menggulung sehingga tetap dalam posisinya, dan sebagai pilot yang

memandu transfer utas T dari Agrobacterium ke sel tanaman. Protein produk dari

gen virB diduga berfungsi mengarahkan transfer T-DNA melalui membran

Agrobacterium. Selanjutnya transfer T-DNA dari Agrobacterium ke sel tanaman

dipandu oleh protein virD2.

c) Integrasi T-DNA ke genom tanaman

Tahap ini diawali dengan interaksi antara protein virD2 yang terdapat pada

ujung 5’ dari T -DNA dengan titik potong (nick) pada DNA tanaman. DNA utas

tunggal menempel pada suatu utas DNA tanaman dan terjadi pemilinan pada

DNA tanaman yang menghasilkan titik potong kedua. Masing-masing utas dari

T-DNA berligasi dengan DNA tanaman dan menghasilkan utas homolog.

Penyusunan kembali dan replikasi dari titik potong yang berturutan pada DNA

tanaman menghasilkan duplikasi dan perubahan susunan pada DNA target.

A. rhizogenes mentransfer T-DNA dari Ri (root inducing) plasmid ke sel

tanaman yang diinfeksinya. Didalam Ri plasmid terdapat gen yang berfungsi

mendorong pertumbuhan akar adventif. Ri plasmid. membawa satu atau beberapa

T-DNA, dan dapat mentransfernya satu persatu atau beberapa T-DNA sekaligus.

Ri plasmid selain membawa gen yang mendorong pertumbuhan akar adventif,

juga membawa gen penyandi enzim yang memproduksi dan mensekresikan opin.

Senyawa opin merupakan substrat pertumbuhan bagi Agrobacterium. Berdasarkan

jenis opin yang diproduksi, antara lain terdapat A. rhizogenes strain mannopin dan

A. rhizogenes strain agropin. A. rhizogenes strain manopin hanya mempunyai satu

T-DNA. Sedangkan strain agropin mempunyai dua T-DNA yaitu TL-DNA dan

TR-DNA. Salah satu dari T-DNA yaitu TR-DNA mempunyai homologi dengan

T-DNA A. tumefaciens, yaitu gen iaaM dan iaaH yang meregulasi biosintesis

auksin, dan gen penyandi sintase yaitu gen ags yang menyandi agropin.

Sedangkan TL-DNA mempunyai beberapa homologi dengan T-DNA dari strain

manopin. Pada kondisi tertentu TL-DNA tanpa TR-DNA dapat menginduksi

pembentukan akar rambut, tetapi pada kondisi lainnya memerlukan TR-DNA,

diduga meningkatnya biosintesis auksin endogen memacu kerja gen TL-DNA

(Nilsson dan Olsson, 1997).

Analisis sekuens terhadap TL-DNA mengindikasikan adanya 18 open

reading frame (ORF), tetapi dari 18 ORF tersebut hanya 4 lokus yang berpengaruh

terhadap morfologi akar rambut yang dihasilkan. Lokus tersebut adalah root locus

A-D (rolA-D), yaitu rolA (ORF 10), rolB (ORF11), rolC (ORF12) dan rolD

(ORF15). Akar yang diinduksi oleh oleh T-DNA mutant rolA mempunyai

fenotipe lurus. Mutan rolB menyebabkan A. rhizogenes tidak virulen,

menunjukkan begitu pentingnya lokus rolB pada induksi akar. Mutant rolC terjadi

penghambatan pertumbuhan akar, sedangkan mutant rolD meningkatkan

pembentukan kalus sehingga menghambat pertumbuhan akar (Oono et al. 1993).

Pada pembentukan akar rambut yang paling berpengaruh adalah gen rolA

dan gen rolB, dimana gen rolA diduga berpengaruh terhadap rasio

sitokinin/auksin. Sedangkan gen rolB bekerja melalui dua mekanisme, yaitu :

1) meningkatkan pool auksin aktif bebas dengan memediasi terjadinya hidrolisis

IAA konjugat yang tidak aktif, 2) meningkatkan sensitivitas sel terhadap IAA.

(Nilsson dan Olsson, 1997). Selain itu gen rolB diduga mendorong pembentukan

meristem. Gen rolA maupun rolB secara tunggal mampu menginduksi

pertumbuhan akar rambut, sedangkan gen rol C memerlukan promoter yang kuat

(35S promoter). Tetapi bila semua gen rol berada bersama-sama akan bekerja

secara sinergis dan cenderung mempunyai efek lebih kuat dibanding dalam

keadaan tunggal (Nilsson dan Olsson, 1997).

Meskipun produksi akar rambut akibat infeksi A. rhizogenes merupakan

hasil proses transfer gen seperti pada tumor akibat infeksi A. tumefaciens, tetapi

proses yang terjadi pasca infeksi sangat berbeda. Selain itu sejumlah gen yang

terlibat juga berbeda, dalam hal ini ekspresi gen rol terutama gen rolB sangat

penting untuk terjadinya akar rambut. Sedangkan ORF lainnya seperti gen iaaM

dan iaaH hanya merupakan faktor pelengkap yang diperlukan untuk terbentuknya

akar rambut. Perbedaan lainnya antara crown gall dan akar rambut adalah crown

gall terdiri dari sel yang tidak terdeferensiasi, tumbuh dengan cepat membentuk

tumor yang terdiri dari sel-sel tertransformasi dan sel-sel non-transformasi.

Karena pada crown gall seringkali terjadi difusi auksin dan sitokinin yang

disintesis oleh sel tertransformasi ke sel sekitar yang tidak tertransformasi.

Sebaliknya akar rambut terdiri dari sel-sel yang terdeferensiasi dan

tertransformasi, karena akar rambut berasal dari sel tunggal yang tertransformasi

(Nilsson dan Olsson, 1997).

Pola ekspresi gen rol menunjukkan sel target pada proses infeksi dan hampir

semua gen rol mempunyai persamaan pola ekspresi yaitu pada jaringan tertentu

(tissue specific expression) terutama meristem akar dan floem. Kecuali gen rolD

ekspresinya diregulasi oleh perkembangan tanaman (developmentally regulated

expression), terjadi pada fase elongasi/ekspansi dan pemasakan jaringan.

Promoter rolB terekspresi pada parenkhim floem dan sel ray, demikian pula

promoter rol C diekspresikan pada sel floem (Nilsson et al. 1997).

Altamura et al. (1991) melaporkan ada korelasi tinggi antara ekspresi gen

rol dan inisiasi akar, yang ditunjukkan dengan diekspresikannya promoter rolB

dan rolC pada sel-sel pericycle sebelum dan selama inisiasi serta pertumbuhan

akar adventif. Menurut Maurel et al. (1994), promoter rolB diaktivasi oleh auksin,

sedangkan aktivitas rolC dimodulasi oleh sukrosa. Kandungan sukrosa paling

tinggi terdapat didalam floem dimana sukrosa ditransportasikan. Sedangkan

konsentrasi IAA maksimal terdapat didalam pembuluh kambium, tetapi sejumlah

IAA juga ditransportasikan melalui floem. Pengaturan promoter rolB dan rolC

oleh sukrosa dan auksin menunjukkan pentingnya peranan kedua senyawa

tersebut selama inisiasi akar, keduanya merupakan komponen yang diperlukan

dalam induksi akar adventif. Oleh karena itu sel-sel dengan kandungan sukrosa

dan auksin tinggi kompeten sebagai asal meristem akar dan merupakan sel target

yang ideal untuk infeksi A. rhizogenes, sel-sel tersebut adalah sel ray dan sel

floem.

C. BIOSINTESIS PROTEIN PADA TANAMAN

Biosintesis protein pada tanaman bersifat khas berbeda dengan organisme lain,

karena tanaman mampu mensintesis asam amino yang diperlukan untuk

pembentukan protein (Salysbury dan Ross, 1991).

1. Pembentukan Asam Amino

Pembentukan asam amino pada tanaman memerlukan dua unsur penting

yaitu karbon dan nitrogen, serta sulfur untuk asam amino tertentu. Berdasarkan

cara mendapatkan sumber nitrogen Salysbury dan Ross (1991) membagi tanaman

menjadi tiga kelompok: a) melalui fiksasi N2, b) menggunakan NO3 sebagai

sumber nitrogen, c) menggunakan NH4 sebagai sumber nitrogen.

Pada proses fiksasi nitrogen terjadi reduksi N2 oleh mikroorganisme

prokariot membentuk NH3. Proses tersebut merupakan kerjasama secara simbiotik

antara mikroorganisme dan sel akar, ditandai dengan terbentuknya nodul akar.

Tanaman inang mensuplai karbohidrat hasil fotosintesis dari daun, ditrans-

lokasikan melalui floem ke nodul akar dalam bentuk sukrosa. Kemudian sukrosa

dioksidasi oleh bakteroid pada nodul akar, hasilnya untuk mereduksi NAD+

menjadi NADH atau NADP+ menjadi NADPH. Selain karbohidrat pada tanaman

lain terjadi oksidasi piruvat yang mereduksi protein flavodoksin. Selanjutnya

flavodoksin, NADH atau NADPH mereduksi feredoksin atau protein lain mirip

feredoksin yang sangat efektif dalam mereduksi N2 menjadi NH3. Reaksi fiksasi

nitrogen yang mereduksi N2 menjadi NH3 sebagai berikut:

N2 + 16 ATP + 8e + 8 H ◊ 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Tanaman yang menggunakan NO3 sebagai sumber nitrogen mereduksi NO3,

sebagian besar terjadi di akar atau daun di tempat nitrat reduktase paling aktif.

Proses reduksi nitrat terdiri dari 2 reaksi, masing-masing dikatalisir oleh ensim

yang berlainan. Reaksi pertama reduksi nitrat ke nitrit dikatalisir ensim nitrat

reduktase, terjadi di sitosol diluar organel sebagai berikut :

NO3 - + NAD(P)H + H+ + 2e ◊ NO2 - + NAD(P) + H2O

Selanjutnya nitrit dari sitoplasma ditransportasikan ke kloroplas daun atau ke

proplastid akar. Reaksi berikutnya adalah reduksi NO2- menjadi NH4+

dikatalisir

oleh ensim nitrit reduktase sebagai berikut :

NO2 - + 6Fdred + 8H+ + 6e ◊ NH4+ + 6 Fdox + 2H2O

Tanaman yang menggunakan NH4 sebagai sumber nitrogen utama,

mengabsorbsi nitrogen dalam bentuk NH4. Tanaman ini biasanya hidup didaerah

dengan kondisi pH tanah rendah, sehingga menghambat proses nitrifikasi.

Selain proses reduksi nitrogen pembentukan asam amino tertentu

melibatkan asimilasi sulfur. Pada tanaman sumber sulfur umumnya dalam bentuk

oksidasi atau sulfat, sehingga terjadi proses reduksi membentuk S = sebagai

berikut :

SO4= + ATP + 8e- +8 H+ ◊ S = + 4H2O + AMP + PPi

Sulfur merupakan unsur penting dalam pembentukan asam amino sistein dan

metionin (Crawford et al. 2000).

Rangka karbon pada asam amino diperoleh dari berbagai asam organik

produk berbagai proses reaksi antara lain siklus Calvin, glikolisis, dan siklus asam

sitrat (Coruzzi dan Last., 2000). Asam organik tersebut antara lain :

a. á-ketoglutarat, menyumbangkan rangka karbon untuk asam amino

glutamat, glutamin, histidin, prolin dan arginin.

b. Oksaloasetat, menyumbangkan rangka karbon untuk asam amino aspartat,

asparagin, treonin, isoleusin, metionin dan lisin.

c. 3-fosfogliserat, sebagai sumber rangka karbon dari serin, glisin, sistein.

d. Fosfoenol piruvat, merupakan sumber rangka karbon dari triptofan, tirosin

dan fenilalanin.

e. Piruvat , merupakan sumber rangka karbon dari alanin, leusin dan valin.

Pembentukan asam amino melalui berbagai proses antara lain proses reduksi

aminasi yang terjadi pada pembentukan glutamat dari á-ketoglutarat yang

dikatalisir oleh ensim glutamat dehidrogenase. Selanjutnya pembentukan glutamin

yang dikatalisir ensim glutamin sintetase, kemudian glutamin mentransfer gugus

amidanya ke asam aspartat membentuk asparagin, dikatalisir ensim asparagin

sintetase. Pembentukan asam amino lainnya melalui berbagai reaksi transaminasi

dua arah. Reaksi transaminasi ini melibatkan perpindahan dua arah gugus

α-amino dari suatu asam amino ke gugus α-keto dari asam α-keto, diikuti dengan

terbentuknya asam amino baru dan asam α-keto baru (Coruzzi dan Last, 2000).

2. Sintesis Protein

Protein merupakan hasil ekspresi gen yang terbentuk melalui proses

transkripsi, prosesing dan translasi. Pada proses transkripsi DNA dihasilkan

pre-mRNA, selanjutnya pre-mRNA mengalami prosesing menjadi mRNA,

kemudian mRNA ditranslasi atau diterjemahkan menjadi protein (Sugiura dan

Takeda, 2000).

a. Perangkat sintesis protein

Menurut Spremulli (2000) berbagai makromolekul yang berperanan dalam

proses translasi, antara lain :

- Messenger RNA (mRNA)

Messenger RNA (mRNA) berperanan sebagai pola cetakan suatu rangkaian

asam amino, dimana pola tersebut ditetapkan dalam rangkaian kodon pada

mRNA. Kodon adalah rangkaian tiga basa yang berdampingan, yang

berdasarkan sandi genetik mampu menyandi satu asam amino.

- Transfer RNA (tRNA)

Transfer RNA (tRNA) berperanan sebagai penterjemah runtunan kodon mRNA

menjadi runtunan asam amino, dibantu seperangkat ensim. Antikodon tRNA

mengenali kodon mRNA melalui pasangan basa, masing-masing basa dari

kodon membentuk pasangan dengan basa yang komplementer dari antikodon.

- Ribosom

Merupakan organel tempat sintesis protein berlangsung, mempunyai struktur

spesifik dan komplek. Pada sel eukariot ribosom terletak dalam sitoplasma,

mempunyai koefisien sedimentasi 80S yang terbagi menjadi dua yaitu Subunit

besar (60S) dan Subunit kecil (40S). Subunit kecil terdiri dari molekul RNA

tunggal 18S, sedangkan Subunit besar mempunyai tiga molekul RNA (28S, 7S,

dan 5S). Pada ribosom terdapat satu situs untuk mRNA, dua situs untuk tRNA

(situs A dan situs P), dan satu situs untuk ensim peptidil transferase yaitu situs.

Situs mRNA terdapat pada subunit kecil, sedangkan dua situs tRNA sebagian

besar terletak pada subunit besar dan sebagian lagi pada subunit kecil, situs

peptidil transferase pada subunit besar. Pada tanaman selain ribosom pada

sitoplasma juga terdapat ribosom lain pada organel yaitu pada mitokondria dan

kloroplas. Ribosom organel berfungsi mensintesis protein yang diperlukan oleh

organel tersebut .

b. Mekanisme sintesis protein

Mekanisme sintesis protein disebut translasi, karena merupakan

penterjemahan dari pasangan empat macam basa asam nukleat kedalam 20 macam

asam amino. Menurut Watson et al. (1998) mekanisme sintesis protein meliputi

berbagai tahap sebagai berikut :

- Pembentukan aminoasil-tRNA

Pada proses ini terjadi perpautan antara asam amino dengan tRNA membentuk

aminoasil-tRNA, dikatalisir aminoasil-tRNA sintetase, yang disebut

"activating enzyme". Perpautan ini berfungsi mengaktivasi gugus karboksil

untuk membentuk suatu peptida. dan sebagai molekul adaptor karena asam

amino tidak dapat mengenali langsung kodon pada mRNA. Satu aminoasil-

tRNA sintetase mengkatalisir satu asam amino, karena setiap ensim berbeda

ukuran, struktur subunit, maupun komposisi asam aminonya. Molekul tRNA

penerima suatu asam amino mempunyai sekuensi basa spesifik untuk asam

amino tersebut, sehingga dengan cepat dapat bergabung dengan sintetase yang

sesuai.

- Inisiasi

Pada proses ini terjadi ikatan antara inisiator tRNA dengan tanda awal (start

signal) dari mRNA. Inisiator tRNA menempati situs P (peptidil) pada ribosom.

Proses inisiasi terdiri dari tiga tahap :

- penempelan subunit kecil ribosom pada tRNA inisiator

- penempelan mRNA pada kompleks subunit kecil ribosom dan tRNA

inisiator

- pembentukan kompleks subunit besar ribosom, subunit kecil ribosom, tRNA

dan mRNA yang siap membaca kodon-kodon mRNA.

Proses inisiasi dibantu dua molekul protein yang disebut eIF2 dan eIF3 (eIF =

eucaryotic initiation factor). Didalam sitoplasma kedua faktor inisiasi

menempel pada subunit kecil ribosom. Fungsi eIF2 mendorong penempelan

aminoasil-tRNA inisiator dan mRNA pada subunit kecil ribosom. Sedangkan

eIF3 berfungsi memisahkan subunit kecil ribosom dari subunit besar setelah

ribosom selesai melakukan translasi.

- Elongasi

Perpanjangan rantai polipeptida melibatkan sejumlah protein faktor

perpanjangan EF (elongation factor), enzim peptidil tranferase serta GTP.

Proses ini terdiri dari tiga tahap, yaitu pengikatan aminoasil-tRNA (pengenalan

kodon), pembentukan ikatan peptida, dan translokasi.

- Terminasi

Merupakan akhir proses translasi yang terjadi bila tanda berhenti (stop signal)

pada mRNA dibaca oleh protein faktor pembebas, dan terjadi pelepasan rantai

polipeptida dari ribosom.

Didalam setiap tahapan proses sintesis protein terjadi interaksi antara

berbagai perangkat (makromolekul) yang berperanan dalam proses sintesis

protein. Interaksi tersebut terjadi dalam semua tahapan sintesis protein yaitu

didalam proses inisiasi, elongasi dan terminasi (Spremulli, 2000).

Proses inisiasi diawali dengan penempelan eIF2, GTP dan aminoasil-tRNA

inisiator pada subunit kecil ribosom. Sedangkan eIF3 sudah lebih dulu menempel

pada subunit kecil ribosom pada saat pemisahan kedua subunit ribosom setelah

selesai proses translasi periode sebelumnya. Dengan adanya penempelan faktor

inisiasi ini terjadi interaksi antara subunit kecil ribosom dengan mRNA, dimana

subunit kecil ribosom akan menempel pada ujung 5' dan kemudian bergerak

sepanjang mRNA untuk mencari kodon awal AUG. Pada proses inisiasi terjadi

hidrolisis ATP menjadi ADP dan P yang diperlukan untuk mencari kodon awal.

Setelah subunit kecil menyelesaikan inisiasi, subunit besar ribosom bergabung,

dan GTP yang menempel pada eIF2 dihidrolisis menjadi GDP dan P. Kemudian.

eIF2 dan eIF3 terlepas dari ribosom, dan ribosom siap memulai proses

perpanjangan polipeptida. Pada akhir proses inisiasi subunit besar ribosom bersatu

dengan subunit kecil ribosom dan berasosiasi dengan aminoasil-tRNA inisiator

serta mRNA.

Proses elongasi dimulai dengan masuknya aminoasil-tRNA kedua ke situs

A. Pada prokariot masuknya aminoasil-tRNA dibantu oleh faktor elongasi EF-Tu

serta GTP yang membentuk kompleks EF-Tu-GTP-aminoasil-tRNA. Setelah

terjadi hidrolisis GTP menjadi GDP dan P, maka EF-Tu-GDP terlepas dari

aminoasil-tRNA. Protein faktor elongasi lainnya EF-Ts mengembalikan EF-Tu-

GDP menjadi EF-Tu-GTP untuk berperan kembali dalam siklus berikutnya.

Sedangkan pada eukariot hanya ada satu protein faktor elongasi yaitu EF1 yang

mempunyai peran kombinasi EF-Tu dan EF-Ts.Tahap berikutnya adalah

pembentukan ikatan peptida. Bila antikodon pada aminoasil tRNA sesuai dengan

kodon mRNA pada situs A, maka ensim peptidil transferase akan melepaskan

asam amino dari tRNA pada situs P dan menggabungkannya dengan asam amino

yang terdapat pada aminoasil-tRNA pada situs A. Pada aminoasil-tRNA asam

amino berikatan dengan tRNA melalui gugus karboksilnya (-COO-) sedangkan

gugus aminonya (-NH) dalam keadaan bebas. Peptidil tranferase akan melepaskan

ikatan -COO- dari ujung 3' tRNA dari aminoasil-tRNA pada situs P dan

merangkaikannya pada gugus amino pada situs A membentuk ikatan peptida,

sehingga terbentuk dipeptidil pada situs A. Reaksi tersebut disebut reaksi

transpeptidasi. Transpeptidasi berikutnya tidak akan berlangsung selama peptidil-

tRNA masih berada pada situs A, maka untuk reaksi transpeptidasi berikutnya

terjadi perpindahan tempat atau translokasi. Pada proses translokasi ini terjadi tiga

pergerakan, yaitu : tRNA yang tidak bermuatan meninggalkan situs P, peptidil-

tRNA berpindah dari situs A ke situs P, dan mRNA bergeser sejauh tiga

nukleotida. Dengan demikian kodon berikutnya menduduki posisi yang dapat

dibaca oleh aminoasil-tRNA baru. Translokasi memerlukan faktor elongasi kedua,

yaitu EF2 (translokase). GTP yang terikat oleh EF2 dihidrolisa pada saat

translokasi. Hidrolisis GTP menyebabkan EF2 dikeluarkan dari ribosom,

karenanya GTP juga berfungsi sebagai katalitik. Setelah translokasi, situs A

menjadi kosong, dan segera mengikat aminoasil-tRNA baru untuk memulai

elongasi berikutnya

Terminasi terjadi bila ribosom menemukan salah satu kodon akhir UAA,

UAG atau UGA. Pada kondisi tersebut tidak ada aminoasil-tRNA yang dapat

menempel pada situs A, karena tidak ada tRNA dengan antikodon yang

komplementer dengan tanda stop (stop signal). Tetapi tanda stop ini dikenali oleh

protein faktor pembebas (RF = release factor). Kemudian RF berikatan dengan

kodon akhir pada situs A, mengubah aktivitas peptidil transferase. Ensim tersebut

tidak mereaksikan polipeptida dengan aminoasil-tRNA melainkan dengan H2O,

akibatnya terjadi proses hidrolisis. Peptidil tRNA pada situs P dan rantai

polipeptida terlepas dari tRNA, selanjutnya GTP terhidrolisis menjadi GDP dan P,

disosiasi antara ribosom, tRNA dan mRNA, dan terurainya ribosom menjadi

Subunit besar dan Subunit kecil.

D. PROTEIN BIOAKTIF

Protein bioaktif adalah protein yang mempunyai aktivitas biologis diluar

aktivitas dari fungsi protein tersebut. Protein bioaktif yang sudah dikenal luas

antara lain protein anti-jamur, protein anti-bakteri, protein anti-virus, dan protein

penginaktivasi ribosom. Protein bioaktif pada tanaman penghasilnya diduga

sebagai senyawa yang berfungsi dalam sistem pertahanan.

Protein anti jamur protein PR-5 dari daun labu ditemukan Cheong et al.

(1997) dan protein PR-5d dari tembakau oleh Koiwa et al. (1997). Kedua protein

ini mempunyai mekanisme kerja dengan meningkatkan permiabilitas plasma

membran, sehingga menyebabkan kebocoran membran dan keluarnya material

intraseluler pada jamur.

Protein antivirus dari akar Bougainvillea spectabilis (BAP 1) menunjukkan

aktivitas penghambatan sintesis protein secara in vitro. (Balasaraswati et al. 1998)

Protein anti virus MAP 30 dari biji Momordica charanthia dan GAP 31 dari

Gelonium multiflorum. Kedua protein tersebut mampu menghambat infeksi virus

HIV-1 dan menghambat replikasi virus pada sel yang sudah terinfeksi, dengan

menghambat HIV-integrase dan menginaktivasi topologi HIV-LTR (Huang et al.

1999).

Segura et al. (1999) menemukan peptida antimikroba Snakin-1 (SN1) dari

umbi kentang. Protein ini menunjukkan aktivitasnya pada konsentrasi kurang dari

10 µM terhadap bakteri dan jamur patogen pada kentang dan spesies tanaman

lainnya. Snakin-1 diketahui menyebabkan agregasi bakteri gram negatif maupun

gram positif.

Protein yang menonaktifkan ribosom, menghambat sintesis protein pada

organisme lain, dikenal sebagai ribosom inactivating protein (RIPs). Protein ini

merupakan toksin tanaman dengan aktivitas N-glikosidase yang memotong

N-glikosida pada Sub unit besar ribosom mamalia, jamur, dan bakteri. RIPs

memotong N-glikosida rRNA pada situs spesifik, yaitu pada A4324 dari 28S rRNA

liver tikus, A3024 pada 26S rRNA yeast dan A2660 dari 23S rRNA E. coli. Dengan

terjadinya pemotongan N-glikosida pada Sub unit besar, ribosom tidak dapat

berinteraksi dengan faktor elongation 2 (EF2) pada eukariot atau EFG pada

prokariot sehingga menghambat elongasi rantai polipeptida (Girbes et al. 1993;

Jensen et al. 1999).

RIPs dibedakan menjadi 2 tipe, yaitu

a) Tipe 1, merupakan rantai polipeptida dengan aktivitas ensim yang unik. RIPs

tipe 1 relatif banyak, lebih dari 30 jenis telah berhasil diisolasi.

b) Tipe 2, terdiri dari satu atau dua dimer dari dua rantai polipeptida yang

berlainan yang digabungkan dengan jembatan disulfida. Salah satu rantai

polipeptida bersifat ensimatik (rantai A), sedangkan rantai lainnya adalah lektin

(rantai B) yang dapat berikatan dengan gula membran, terutama residu

galaktosa.

RIPs tipe 2 bekerja dengan mengikatkan toksin dari rantai B ke reseptor

pada permukaan sel, kemudian rantai A masuk ke sitoplasma dan menonaktifkan

sub unit besar ribosom 60 S. RIPs tipe 2 sangat jarang baru 5 jenis yang berhasil

dideteksi dan diisolasi.

RIPs tipe 1 mempunyai banyak kemiripan struktur, termasuk berat molekul

(26-32 kD), dan sebagian besar merupakan glikoprotein. Umumnya cukup stabil

terhadap degradasi denaturan maupun proteolitik (Jensen et al. 1999).

Pada umumnya protein bioaktif disintesa dalam bentuk tidak aktif,

selanjutnya ditransport ketempat dimana protein tersebut disimpan, dan pada

tempat protein tersebut disimpan mengalami proses pengaktifan. Kloning cDNA

pada ricin menunjukkan bahwa molekul disintesa dalam bentuk prepro sebagai

polipeptida tunggal, kemudian 12 asam amino yang menghubungkan antara dua

rantai dipotong untuk menghasilkan protein aktif. Hal serupa dijumpai pada toksin

diphteria dimana disintesa sebagai polipeptida tunggal, kemudian mengalami

proses proteolitik membentuk dua rantai. Endopeptidase yang dapat memotong

sekuen intervening 12 asam amino pada preporicin telah diisolasi dari protein

pada biji jarak (Ricinus communis L), dimana toksin disimpan. Proricin tanpa

sekuen signal, tetapi dengan sekuen intervening dapat mengikat galaktosa, bentuk

ini bersifat inaktif dalam uji rantai ensim. Oleh karena itu sel jarak diduga

memproteksi perangkat sintesis proteinnya dari pengaruh inaktivasi oleh ricin

dengan mengekspresikan molekul ricin yang tidak aktif (proricin), kemudian

menjadi aktif (ricin) setelah diekspor ke biji (Jensen et al. 1999).

Park et al. (2003) mengisolasi dan mengkarakterisasi RIPs tipe I dari akar

rambut Phytolaca americana yang disebut PAP-H. Protein tersebut disekresikan

secara konstitutif kedalam medium sebagai eksudat akar. Selain mempunyai

aktivitas menghambat sintesis protein dengan menonaktifkan ribosom PAP-H

juga mempunyai aktivitas anti-jamur.

E. UJI KEMATIAN LARVA UDANG

Dasar pertimbangan dari metode ini adalah senyawa bioaktif bersifat toksik

pada dosis tinggi, sehingga kematian in vivo dari hewan sederhana Artemia salina

Leach dapat digunakan untuk memonitor dengan mudah dan cepat dalam skrining

ekstrak bioaktif tanaman. Selain metodenya cukup sederhana, bahannya mudah

didapat, relatif murah dan perlu waktu singkat. Menurut Hostettmann (1991)

metode ini mempunyai korelasi positif dengan pengujian sitotoksisitas pada 3PS

(P-388 murine leukemia in vivo). Telur A. salina Leach (larva udang) tersedia dan

dijual dengan harga murah dan tahan disimpan beberapa tahun dalam kondisi

kering. Untuk menetaskannya sangat mudah dengan menaruh telur dalam medium

air laut buatan, dalam waktu 24 jam akan diperoleh larva (nauplii ) dalam jumlah

banyak.

Larva A. salina Leach tidak mempunyai alat untuk mempertahankan diri

dari serangan musuh, satu-satunya cara untuk menghindar dari musuh adalah

dengan hidup diperairan kadar garam tinggi, dalam kondisi ini jarang organisme

yang dapat bertahan hidup. Pada habitatnya A. salina memakan sisa-sisa jasad

hidup yang sudah menghancur, ganggang, bakteri dan cendawan.

A. salina Leach berkembangbiak dengan dua cara yaitu ovipar melalui telur

dan ovovivipar langsung melalui larva. Perkembangbiakan ovovivipar terjadi bila

lingkungan cukup baik, kadar garam tidak terlalu tinggi dan oksigen cukup. Tetapi

bila lingkungan buruk seperti meningkatnya kadar garam dan menurunnya

oksigen maka larva akan berkembangbiak secara ovipar melalui telur yang

bercangkang tebal disebut cyste. Dan bila lingkungan membaik telur akan

menetas dalam waktu 24 – 36 jam (Meyer, 1982).

A. salina Leach atau brine shrimp adalah jenis udang-udangan primitif,

dengan sistematika sebagai berikut :

filum : Arthropoda

subfilum : Mandibulata

kelas : Crustaceae

subkelas : Branchiopoda

ordo : Anostraca

famili : Artemiidae

genus : Artemia

spesies : Artemia salina Leach

Uji kematian larva udang (brine shrimp lethality test = BSLT) telah

digunakan secara luas dalam berbagai pengujian antara lain untuk menguji residu

pestisida, mikotoksin, anastesi, senyawa golongan morfin, dan toksisitas limbah

Gambar 2. Larva Artemia salina Leach

minyak (Hostettman, 1991). Oberlies et al. (1998) menggunakan uji BSL pada

skrining sitotoksisitas buah muda alpokat Persea americana. Hasil penelitiannya

menunjukkan buah muda yang diekstraksi dengan ethanol 95% pada uji BSL

memperoleh LC50 pada konsentrasi 31 µg/ml. Jaki et al. (1999) menguji 86

ekstrak lipofilik dan hidrofilik dari 43 sampel cyanobacteria untuk penapisan

bioaktivitasnya dengan uji BSL. Hasil penelitiannya menunjukkan 8,1% dari

ekstrak mengakibatkan kematian ≥ 60% A. salina Leach pada konsentrasi

500 ppm. Lieberman (1999) memantau toksisitas limbah kimia rumah tangga

dengan uji BSL menggunakan Artemia franciscana.

F. UJI MENGGUNAKAN GALUR SEL KANKER IN VITRO

Pada pertumbuhan normal terjadi pengaturan laju proliferasi sel dari suatu

organ, meningkat atau menurunnya proliferasi sel setara dengan laju kerusakan sel

sehingga ukuran organ tetap terjaga. Sebaliknya sel kanker tidak mengikuti aturan

tersebut, tetapi terjadi proliferasi yang tidak terkendali, sehingga terbentuk tumor

(Hood et al. 1997).

Tumor yang disebabkan oleh proliferasi sel disebut neoplasma atau

pertumbuhan baru. Berdasarkan kemampuan menyebar neoplasma dibedakan

antara neoplasma maligna dan neoplasma benigna. Neoplasma maligna atau

kanker adalah neoplasma yang menyerang jaringan sekelilingnya, kemudian

menyebar keseluruh tubuh (metastasis). Neoplasma yang membentuk tumor yang

tidak menyebar disebut neoplasma benigna. Berdasarkan asalnya antara lain

terdapat dua jenis tumor yaitu tumor yang berasal dari sel epitel disebut

karsinoma, sedangkan yang berasal dari sel stroma atau mesenkhim disebut

sarkoma (Van de Velde et al. 1999).

Pengobatan penyakit kanker umumnya dilakukan melalui biopsi, radioterapi

dan khemoterapi yang memerlukan biaya sangat mahal. Oleh karena itu berbagai

penelitian dilakukan untuk mencari obat alternatif yang berasal dari alam antara

lain tumbuh-tumbuhan. Indonesia sebagai negara dengan kekayaan flora terbesar

kedua di dunia kaya akan berbagai tanaman berkhasiat obat, termasuk obat anti

kanker (Maat, 2000).

Untuk mengidentifikasi senyawa anti kanker dilakukan evaluasi praklinik

yang ekstensif dari berbagai senyawa untuk mendeteksi aktivitas neoplastik.

Pengujian yang dilakukan meliputi pengujian in vivo menggunakan hewan model,

dan pengujian in vitro menggunakan kultur sel. Pada kultur sel dapat diamati

secara langsung sitotoksisitas suatu senyawa terhadap viabilitas sel (Wilson,

1992).

Berdasarkan asalnya Freshney (1992) membagi kultur sel menjadi beberapa

jenis, yaitu : 1) Sel primer adalah kultur sel yang belum disubkultur, berasal dari

jaringan yang diisolasi dan dikulturkan. Sel ini dapat mewakili atau mempunyai

kemiripan dengan jaringan asal, tetapi pemeliharaannya sulit.. 2) Finite Cell Line,

kultur sel yang mempunyai masa hidup terbatas, umumnya merupakan kultur

jaringan sel normal atau sel-sel yang tidak berubah selama masa pengkulturan. Sel

masih mempunyai kemiripan atau dapat mewakili jaringan asal, pemeliharaannya

sulit dan waktu penggandaan sel 24-96 jam 3) Continuous cell line, adalah galur

sel yang mempunyai masa hidup tidak terbatas (immortal), bisa berasal dari tumor

atau sel yang mengalami perubahan selama pengkulturan. Umumnya sel kurang

terdeferensiasi, pemeliharaannya mudah, dan memerlukan waktu penggandaan

12-24 jam.

Griffiths (1992) membedakan kultur sel berdasarkan sifat pertumbuhannya,

sebagai berikut : a) sel suspensi adalah sel yang tumbuh membentuk suspensi

dalam medium kultur, dapat hidup dan berkembang tanpa menempel pada cawan

kultur. Sel yang berasal dari darah, limpa atau sumsum tulang, khususnya sel yang

belum dewasa cenderung tumbuh dalam bentuk suspensi. Sel suspensi berbentuk

seperti bola-bola kecil, dan mudah dipanen. Keuntungan lain dari sel suspensi

adalah dapat menghasilkan sel dalam jumlah besar. b) Sel yang menempel,

adalah sel yang tumbuh membentuk satu lapisan (monolayer), menempel pada

permukaan cawan kultur. Sel yang berasal dari lapisan embrionik ektodermal atau

endodermal cenderung tumbuh secara menempel, antara lain sel fibroblas dan sel

epithel. Sel yang tumbuh secara menempel mempunyai beragam bentuk, tetapi

umumnya pipih. Kelebihan dari pertumbuhan yang menempel adalah kemampuan

dari sel untuk menempel dan menyebar pada permukaan, memudahkan dalam

pengujian mikroskop, hibridisasi dan pengujian fungsional lainnya.

Contoh galur sel kanker yang mempunyai masa hidup tidak terbatas adalah

sel HeLa yang diisolasi dari epitheloid carcinoma pada servic seorang wanita

negro berusia 31 tahun. Sel Hela merupakan sel monolayer, dan bersifat

aneuploid. Sel lainnya adalah sel K-562 (ATCC CCL 243) diisolasi pertamakali

oleh Lozzio (1972) dari efusi pleural wanita berumur 53 tahun yang menderita

leukemia myleogenous kronik pada akhir masa blast. Sel K-562 merupakan galur

erythroleukemia, multipotensial dan sel malignant haematopoeitic. Galur sel

K-562 ini merupakan tipe sel yang dibiakkan dalam bentuk suspensi (ATCC,

1992).

Pada setiap kultur diperlukan pengamatan berkala secara makroskopis atau

mikroskopis, karena bila sel tidak sehat percobaan tidak reprodusible.

Pengamatan kultur menurut Hay (1992) meliputi : a) warna medium, umumnya

media mempunyai indikator pH, bila berubah menjadi kuning menunjukkan

bersifat asam atau keunguan menunjukkan basa. Medium yang terlalu asam atau

basa menunjukkan terjadinya kontaminasi, pertumbuhan yang berlebihan,

kematian kultur, atau kurangnya aliran CO2. b) ada selaput yang menyelimuti

medium, menunjukkan kontaminasi atau pertumbuhan kultur yang berlebihan.

c) terbentuk gumpalan sel pada kultur suspensi atau terjadi pengelupasan pada

kultur yang menempel.