High Performance Liquid Chromatography (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. HPLC paling sering digunakan untuk penetapan kadar senyawa-senyawa tertentu, menentukan senyawa aktif obat, memurnikan senyawa dalam suatu campuran, memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekul dalam suatu campuran. Keterbatasan metode HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektrometer masa (MS). Keterbatasan lain adalah jika sampel sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Gholib, 2011). PRINSIP KERJA Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
High Performance Liquid Chromatography(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik
untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. HPLC paling sering digunakan untuk
penetapan kadar senyawa-senyawa tertentu, menentukan senyawa aktif obat,
memurnikan senyawa dalam suatu campuran, memisahkan polimer dan
menentukan distribusi berat molekul dalam suatu campuran. Keterbatasan metode
HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan
spektrometer masa (MS). Keterbatasan lain adalah jika sampel sangat kompleks,
maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Gholib, 2011).
PRINSIP KERJA
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa
gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara
solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat
berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom
dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram
kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk
mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil
pengukuran HPLC (Gholib, 2011).
INSTRUMENTASI
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa,
alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase gerak atau eluen
biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gholib,2011).
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak
juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis
(Gholib,2011).
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap
selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah
selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas.
Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang
kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas
(Gholib,2011).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik (Gholib,2011).
Fasa gerak HPLC harus memenuhibeberapa persyaratan berikut :
1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
akandianalisis.
2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yangdapat
mengganggu interpretasi kromatogram.
3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada
kolom.Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran
diameter 0,45µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring
partikel kotoransekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat
mengganggu base line.
4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun.
5) Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP
(centiPoise).
6) Sesuai dengan detektor.
Tabel 1. Properties of HPLC mobile phase
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus
inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah
gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Untuk tujuan preparatif,
pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran
fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi.
2. Kelluara bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.
4. Bahan tahan korosi.
Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan
dan kerugian yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic.
Gambar Pompa
Pompa reciprocating
Jenis pompa ini sekarang paling banyak dipakai. Popa ini terdiri dari
ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang
dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.
Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,
sebaliknya ketika piston maju bola bawah menutup saluran pelarut danpelarut yang
telah berada diruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.Gerakan piston mundur dan
maju terjadi secara terus menerus sehinggamemeberikan aliran eluen konstan. Pompa ini
menghasilkan pulsa yang dapatmengganggu base-line kromatogram, karena itu
dipasang peredam pulsa untuk menghilangkan gangguan base-line sedangkan
keuntungan pompa ini adalah memiliki volume internal yang kecil. Untu
mengurangi bond broadening. Selain itu, pompa ini menghasilkan tekanan tinggi,
kecepatan alir konstan yang tidak brgantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut
(Hendayana, 2006).
Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung
yangdilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini jugamenghasilkan aliran
yang cenderung tidakbergantung tekanan balik klom danvisikositas pelarut. Selain itu,
keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapipompa ini keterbatasan kapasitas pelarit dan
tidak mudah untu mealkukanpergantian pelarut (Hendayana, 2006).
Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis
murah dan bebeas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasab kapasitasdan tekanan yang
dihasilkan serta kecepatan alir bergantung pada viskositaspelarut dan tekanan balik
kolom (Hendayana, 2006).
3. Tempat penyuntikan sampel
Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat
menyebabkanband broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil
mungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem
HPLC melalui injeksi srynge, injeksi “stop-flow”, dan kran cuplikan
(Hendayana, 2006).
Injeksi syringe
Alat yang paling dulu ada dan paling paling mudah untuk memasukkancuplikan
adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) danuntuk ini
dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapiketerulangan injeksi
syringe ini sedikit labih baik dari2-3% dan sering lebih jelek (Hendayana, 2006).
Injeksi ‘stop-flow’
Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini
aliranpelarut dihentikan sementara, asambungan pada ujung kolom dibuka
dancuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah
menyambungkankembali kolom maka pelarut dialirkan kembali (Hendayana, 2006).
Kran cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk
memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dualangkah :
1. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”,
cuplikan masih berada dalam loop.
2. Kran diputar untuk mengubah cuplikan “load” menjadi posisi “injeksi”dan fasa
gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan
tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 µL. Dengansistem
pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan padatekanan 7000 psi
denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia denganvolume 0,5 hingga
5µL.
Gambar Tipe injector katup putaran
(Hendayana, 2006).
4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3
keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.
(Hendayana, 2006).
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam
pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika
dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS
atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun
tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan
air yang digunakan (Hendayana, 2006).
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat terjadinya
pemisahan campuran menjadi komonen-komponennya. Bergantung keperluannya
kolom utama dapat digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan
preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang
berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Selain kolom
utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom) (Hendayana, 2006).
Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantungkeperluan,
misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penularan ion.Kolom jenis C-18 dan C-8
paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam jenisterikat ini dapat dibuat dengan
mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yangdikenal dengan reaksi silanisasi
(Hendayana, 2006).
Fasa Diam
Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang
dilapiskan padamaterial kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 .
fasa diammungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasadiam
ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasadiam diperoleh
dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilanedengan bentukumu Si
(CH3)2RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi.
Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus – SiOH, silicasering
direaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat
organosilane‟s gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasadiam akan
polar. Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (-C2H4CN), diol (-
C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karenafasa diam polar, fasa
bergerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar.Kombinasi dari fasa diam polar
dan fasa gerak non polar disebut kromatografifasa normal. Dalam kromatografi
fasa terbalik, sering ditemui dalam HPLC, fasadiam non-polar dan fasa gerak
polar. Fasa diam non-polar paling umummenggunakan organochlorosilane dengan R
adalah n-octyl (C8) atau n-octyldecyl (C18) rantai hidrokarbon (Gholib, 2011).
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia (Gholib, 2011).
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
(Gholib, 2011).
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik
detektor seperti berikut :
Detektor Sensitifitas
(g/ml)
Kisaran
linier
Karakteristik
Absorbansi Uv-
vis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometer
photo-diode
array
5 x 10-10
5 x 10-10
> 2 x 10-10
104
105
105
Sensitivitas bagus, paling
sering digunakan, selektif
terhadap gugus-gugus dan
struktur-struktur yang
tidak jenuh.
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada
elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri
10-8
10-12
104
105
Peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan alir
fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut
ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan
adanya kontaminasi
elektroda.
(Hendayana, 2006).
6. Rekorder
Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan puncak
(kromatogram). Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai
puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Gholib,
2011).
INTERPRETASI HASIL
Sistem HPLC memberikan dua tipe data. Pertama, dikenal dengan
kromatogram, dan yang lain disebut spectrum. Kromatogram adalah grafik yang
merekam signal dari detector selama waktu pengukuran. Pada saat senyawa
dideteksi oleh instrument, signal meningkat dan kromatogram menampilkan
puncak-puncak (peak) (Clark, 2007).
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-
masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor
dan menerap sinar UV. Sepanjang kondisi kolom tetap terkontrol, waktu retensi
dapat digunakan untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.
Dimana, senyawa murni dari komponen yang akan dianalisis sudah diukur dalam
kondisi yang sama (Clark, 2007).
Hasil pengukuran dari detektor disebut Liquid Chromatogram
Gambar 1. Contoh kromatogram dari sejumlah kecil volume sampel yang
diekstraksi dari kapsul vitamin E yang dilarutkan dalam pelarut organic.
Setiap puncak pada kromatogram mengindikasikan adanya senyawa kimia
di dalam sampel. Setiap puncak dilabel oleh waktu retensi (retention time). Waktu
retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui
kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur dari waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai titik dimana layar menunjukan ketinggian puncak maksimum
untuk senyawa itu. Senyawa berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk
beberapa senyawa, waktu retensi akan bervariasi tergantung pada tekanan yang
digunakan (karena mempengaruhi laju alir pelarut), sifat fase diam, komposisi
pelarut, dan suhu kolom (Clark, 2007).
Kuantitas senyawa dapat diperoleh dengan mengukur tinggi peak kromatogram
dari dasar, serta mengukur luas peak.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah komponen A yang
melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar
computer (Clark, 2007).
Jika terdapat dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan
Y). Maka tidak dapat ditentukan jumlah relatifnya, jika menggunakan serapan UV
sebagai metode pendeteksinya (Clark, 2007).
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area
dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X,
tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih
sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi
jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil (Clark, 2007).
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan
mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak
saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya
jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample
ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja (Clark, 2007).
DAFTAR PUSTAKA
Clark, J. 2007. High Performance Liquid Chromatography. [Online]. Tersedia
online di: http://www.chem-is-try.org (diakses tanggal 2 Januari 2013)
Hendayana, S. 2006. Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya Offset
Gholib, Ibnu. 2011.Kimia Farmasi Analisis.Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Note: Karena nggak tahu batasan segimana yg harus dicari ttg HPLC, jadi semuanya aku masukin. Kalo sekiranya gak perlu, mangga hapus aja