Dasar Teori Teknik pengecatan Gram dikembangkan oleh Hans
Christian Gram (dokter berkebangsaan Denmark, 1884). Pengecatan
Gram merupakan salah satu langkah awal mengidentifikasi sel bakteri
yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram
positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna
merah) Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan
sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses
dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami
dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan
pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram
negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir
pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Bakteri gram
negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga
pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri
gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding
sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel
tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan
tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan
bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi
terlalu pendek. Alat dan bahan : - biakan bakteri - larutan kristal
violet - larutan iodin - larutan alkohol (etil alkohol 95%) - kaca
objek dan kaca penutup - mikroskop - jarum ose
- bunsen (lampu spiritus) - aquadesh Langkah Kerja : 1. Kaca
objek dibersihkan dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali pada
nyala api bunsen 2. Membuat olesan tipis bakteri dengan mengambil
isolat bakteri dengan jarum ose secara aseptis dan diberi 1-2 tetes
aquadesh. Kering anginkan dan melewatkannya pada nyala api bunsen
(lampu sriritus) 3. Olesan tersebut dibubuhi kristal violet (Gram A
= cat utama), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air
mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga
kering
4. Dibubuhi dengan larutan iodin (Gram B = larutan mordan),
dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga
tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering 5. Melakukan
dekolorisasi dengan dibubuhi etil alkohol 95% selama 10-20 detik,
segera aliri dengan air selama beberapa detik untuk menghentikan
aktivitas dekolorisasi, dianginkan hingga kering 6. Olesan bakteri
ditetesi dengan safranin selama 20-30 detik, dicuci dengan air
mengalir selama beberapa detik untuk menghabiskan sisa-sisa cat.
Selanjutnya air dihisap dengan kertas penghisap dan kering anginkan
7. Melakukan pengamatan dengan mikroskop dan sel-sel yang tampak,
digambar pada lembar kegiatan
Preparat basah bakteri dengan pewarnaan GramPerbesaran : kali
Gambar. Keterangan1. 2. Mari kita diskusikan: 1. Bagaimana hasil
pengamatan dari bakteri setelah dilakukan pewarnaan Gram? 2.
Mengapa sel bakteri ada yang berwarna biru (ungu) dan merah? 3.
Apakah sel yang berwarna merah selalu bakteri gram negatif? Catatan
: - Kegiatan ini memerlukan bimbingan dari guru, membutuhkan
peralatan dan bahan laboratorium khusus seperti jarum ose, kaca
objek, bunsen, larutan kristal violet, iodin, alkohol, safranin dan
mikroskop - Teknik aseptis dilakukan untuk menghindari terjadinya
kontaminasi mikroba. Teknik aseptis yang dilakukan pada kegiatan
ini pada saat awal membersihkan kaca benda dan pada saat membuat
olesan pada kaca benda dari biakan bakteri Like Be the first to
like this post.
Home My Friendster My Facebook ASC UGM Profile
PENGECATAN GRAMDiposkan oleh Mohammad Septa Ayatullah | May 03 |
Label: teknologi pangan |Pengecatan Gram merupakan salah satu
teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi
untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi
mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas
terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan
untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan
dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat
membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu
hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan
oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram,
bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif
dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak
bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel
seperti Mycoplasma sp. PERSIAPAN Sebelum dilakukan pengecatan Gram,
tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan
yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari
penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge
telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal. Spesimen
yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear)
terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang
diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass)
atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat
diamati di bawah mikroskop. a. Pembuatan preparat Alat dan bahan
yang diperlukan adalah : Alat :
Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus
Bahan :
Bahan yang akan diperiksa.
Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat
yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai
sumber bahan. a.1. Bahan langsung dari penderita Bahan disentrifuge
terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang
berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan
ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas
obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu
spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala
api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah
kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan
sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat. a.2.
Bahan dari biakan cair
Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak
dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari
biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan
menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk
diameter kirakira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian
dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan
preparat langsung. a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil
gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan
memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau
NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu
koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk
diameter 1 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian
tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat
dengan bahan berasal dari penderita. Prinsip yang selalu harus
diingat dan dipatuhi adalah :
Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah
dipakai. Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di
sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung)
ose dengan tangan. Usahakan tidak banyak bicara pada saat
kerja.
b. Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu
cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan
fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram,
adalah sebagai berikut : 1. Cat Gram A Cat ini terdiri atas :
Kristal violet : 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat :
0,8 gram Akuades : 80 ml Cat Gram A berwarna ungu (karena
mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang
akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini,
semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. 2.
Cat Gram B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram
Kalium Yodida : 2 gram Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna
coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia
yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme
target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh
bakteri akan lebih baik (lebih kuat). 3. Cat Gram C Cat ini terdiri
atas : Aseton : 50 ml Etil alkohol 95 % : 50 ml Cat Gram C tidak
berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya.
Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan : Mikroorganisme
(bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol.
Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol.
Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif.
Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol.
Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri
yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.
4. Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas : Safranin : 0,25 gram Etil
alkohol 95 % : 10 ml Akuades : 90 ml Cat ini berwarna merah. Cat
ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk
memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai
spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat
Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :
Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah
jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat
Gram D. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat
sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu
mengikat cat Gram D.
Dasar teori cat Gram
Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan
menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua
teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu : 1. Teori
Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di
dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut
selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel
membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan
dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram positif mengalami
denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan
alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil
sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan
dan bakteri akan tetap berwarna ungu. 2. Teori permeabilitas
dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan
peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai
susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang
terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan
kompleks kristal yodium tidak dapat keluar. Bakteri Gram negatif
mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 2 lapisan dan
susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel
lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks
kristal yodium. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum melakukan pengecatan
Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Pastikan semua alat
dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di
tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga
menyulitkan dan memakan waktu. Alat dan bahan yang diperlukan
adalah : Alat :
Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir
Bahan :
Cat Gram A, B, C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM Kelebihan :
1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan
terapi antibiotik,sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab
infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri
terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan
negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis
antibiotika. 2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat
Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram
ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus
(nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk
penyakit infeksi gonore. Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan
mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 10 4 per ml.
Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan
serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk
mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil
sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara
mikroskopis. Pustaka acuan : Nirwati, Hera, _______, Pembuatan
Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi,
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta Strohl, William A, Rouse,H, Fisher, BD, 2001,
Lippincotts Illustrated Reviews: Microbiology, Lippincott William
& Wilkins, USA
Metabolisme Karbohidrat DEFINISI Karbohidrat adalah gula.
Beberapa gula sederhana, dan lainnya lebih kompleks. Sucrose (gula
meja) dibuat dari dua gula yang lebih sederhana yaitu glukosa dan
fruktosa. Lactose (gula susu) terbuat dari glukosa dan galactose.
Baik sucrose maupun lactose harus dipecahkan ke dalam gula
pembentuknya dengan enzim sebelum badan bisa menyerap dan memakai
mereka. Karbohidrat pada roti, pasta, padi, dan makanan lain yang
berisi karbohidrat adalah rangkaian panjang molekul gula sederhana.
Molekul ini yang lebih panjang juga harus dibongkar oleh tubuh.
Jika enzim yang diperlukan untuk mengolah gula tertentu hilang,
gula bisa menumpuk di badan, menyebabkan masalah. 1. Penyakit
Penyimpanan Glikogen Glikogen terbuat dari banyak molekul glukosa
yang berikatan satu sama lain. Gula glukosa adalah sumber utama
energi tubuh untuk otot (termasuk jantung) dan otak. Glukosa yang
tidak dengan segera dipakai untuk tenaga disimpan sebagai cadangan
di hati, otot, dan ginjal dalam bentuk glikogen dan dilepaskan
kalau diperlukan oleh tubuh. Ada banyak berbagai penyakit
penyimpanan glikogen (juga disebut glikogenosis), masing-masing
dikenali dengan angka Roma. Penyakit ini disebabkan oleh kekurangan
yang diturunkan dari salah satu enzim yang esensial untuk memproses
glukosa menjadi glikogen dan memecah glikogen menjadi glukosa.
Sekitar 1 dari 20.000 orang bayi mempunyai suatu bentuk penyakit
penyimpanan glikogen.
Beberapa penyakit ini menyebabkan sedikit gejala; yang lain
fatal. Gejala spesifik, usia dimana gejala mulai, dan keparahan
mempengaruhi variasi di antara penyakit ini. Untuk jenis II, V, dan
VII, gejala utamanya adalah merasa lemah. Untuk jenis I, III, dan
VI, gejalanya adalah kadar gula rendah di darah dan perut membuncit
(karena kelebihan atau glikogen abnormal dapat memperbesar hati).
Kadar gula darah rendah menyebabkan rasa lemah, berkeringat,
kebingungan, dan kadang-kadang pingsan dan koma. Akibat lain bagi
anak mungkin termasuk pertumbuhan terhambat, sering infeksi, atau
luka pada mulut dan usus. Penyakit penyimpanan Glikogen cenderung
menyebabkan asam urat, limbah, menumpuk di sendi (yang bisa
menyebabkan encok) dan di ginjal (yang bisa menyebabkan batu
ginjal). Pada jenis I penyakit penyimpanan glikogen, kegagalan
ginjal biasa terjadi setelah beberapa lama. Diagnosa spesifik
dibuat ketika pemeriksaan kimiadari jaringan sampel, biasanya otot
atau hati, menentukan bahwa enzim tertentu hilang. Pengobatan
tergantung pada jenis penyakit penyimpanan glikogen. Bagi banyak
orang, makan beberapa kali sedikit makanan kaya karbohidrat
menolong mencegah kadar gula darah turun. Bagi orang yang mempunyai
penyakit penyimpanan glikogen yang menghasilkan gula darah rendah,
kadar glukosa dipelihara dengan memberi tepung maizena mentah
setiap 4 sampai 6 jam. Kadang-kadang larutan karbohidrat diberikan
melalui tabung perut sepanjang malam untuk mencegah kadar kadar
gula darah turun malam hari. Tipe dan karakterisitik penyakit
penyimpanan glikogen Nama Tipe O Penyakit von Gierke (Tipe IA) Tipe
IB Organ yang terkena Hati, otot Gejala Memperbesar hati dengan
penumpukan lemak di dalam sel hati (hati berlemak); episode kadar
gula darah rendah (hypoglycemia) kalau berpuasa Memperbesar hati
dan ginjal; memperlambat pertumbuhan; kadar gula darah yang sangat
rendah; kadar asam yang luar biasa tinggi, lemak, dan asam urat di
darah. Sama seperti penyakit von Gierke tetapi mungkin lebih tidak
parah; sel darah putih hitung rendah; infeksi berulang mulut dan
usus atau penyakit Crohn Memperbesar hati dan jantung, otot lemah .
Memperbesar hati atau sirosis; kadar gula darah rendah; kerusakan
otot dan kerusakan jantung pada beberapa orang. Sirosis pada tipe
awal; kerusakan otot dan kelumpuhan jantung (terlambat datangnya)
pada tipe lanjut.
Hati, ginjal
Hati, sel darah putih
Penyakit Semua organ Pompe (Tipe II) tubuh Hati, otot, Penyakit
Forbes jantung, sel (Tipe III) darah putih Penyakit Hati, otot,
Andersen (Tipe hampir semua
IV) Penyakit McArdle (tipe V) Penyakit Hers (tipe VI)
jaringan Otot Hati Kejang otot atau kelemahan selama aktivitas
fisik. Memperbesar hati; episode kadar gula darah rendah
(hypoglycemia) kalau berpuasa, sering kali tanpa gejala.
Penyakit Tarui Otot skeletal, Kejang otot selama aktivitas
fisik; perusakan sel darah merah (tipe VII) sel darah merah
(hemolysis).
2. Galactosemia Galactosemia (kadar galactose darah tinggi)
disebabkan dengan kekurangan salah satu enzim yang diperlukan untuk
memetabolisme galactose, gula yang ada dalam lactose (gula susu).
Metabolite menjadi banyak menjadi racun pada hati dan ginjal dan
juga merusak lensa mata, menyebabkan katarak. Bayi baru lahir
dengan galactosemia nampak normal pada mulanya tetapi dalam
beberapa hari atau minggu kehilangan selera makannya, muntah,
menjadi kuning, mengalami diare, dan berhenti bertambah besar
secara normal. Fungsi sel darah putih terpengaruh, dan infeksi
serius bisa timbul. Jika pengobatan lambat, anak yang terkena tetap
pendek dan mengalami keterbelakangan mental atau mungkin mati.
Galactosemia dapat diketahui dengan pemeriksaan darah. Tes ini
dilakukan sebagai tes skrining rutin pada bayi baru lahir terutama
bila seorang anggota keluarga diketahui mempunyai gangguan ini.
Galactosemia diobati dengan cara menghilangkan secara menyeluruh
susu dan produk susu - sumber galactose dari makanan anak yang
terkena. Galactose juga ada di beberapa buah-buahan, sayur, dan
produk laut, seperti rumput laut. Dokter tidak yakin apakah jumlah
yang sedikit di dalam makanan ini menyebabkan masalah dalam jangka
panjang. Orang yang mempunyai gangguan harus membatasi pemasukan
galactose sepanjang hidup. Jika galactosemia dikenali sejak lahir
dan diobati dengan baik, masalah hati dan ginjal tidak berkembang,
dan perkembangan jiwa normal. Tetapi, dengan pengobatan yang tepat
pun, anak dengan galactosemia sering mempunyai kuosien kecerdasan
lebih rendah (IQ) daripada saudara kandung mereka, dan mereka
sering mempunyai masalah bicara. Anak perempuan sering mempunyai
indung telur yang tidak berfungsi, dan hanya sedikit yang dapat
menjadi hamil secara alami. Namun untuk anak laki-laki, , mempunyai
fungsi testicular normal. 3. Intoleransi Fruktosa Turunan
Pada gangguan ini, badan kehilangan enzim yang mencerna
fruktosa, gula yang ada di gula meja (sucrose) dan banyak
buah-buahan. Akibatnya, sebuah hasil sampingan fruktosa menumpuk di
badan, menghalangi pembentukan glikogen dan konversinya ke glukosa
untuk digunakan sebagai tenaga. Menggunakan sedikit saja fruktosa
atau sucrose menyebabkan kadar gula darah rendah (hypoglycemia),
berkeringat, kebingungan, dan kadang-kadang pingsan dan koma. Anak
yang terus makan makanan berisi fruktosa mengalami kerusakan ginjal
dan hati, menghasilkan penyakit kuning, muntah, pemburukan jiwa,
pingsan, dan kematian. Gejala ronis termasuk tidak mau makan,
kegagalan untuk berkembang pesat, gangguan pencernaan, kegagalan
hati, dan kerusakan ginjal. Diagnosa dibuat kalau pemeriksaa kimia
sampel jaringan hati ditemukan enzim hilang. Pengobatan melibatkan
mengeluarkan fruktosa (umumnya ditemukan di buah-buahan manis),
sucrose, dan sorbitol (tiruan gula) dari diet. Serangan akut
dirawat denganmemberi glukosa dengan infus; serangan yang lebih
ringan hypoglycemia diobati dengan tablet glukosa, yang sebaiknya
dibawa oleh siapa saja yang mempunyai keturunan intolerasni
fruktosa. PENGECATAN GRAM Oleh: Shofyatul Yumna Triyana
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang
dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan
identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme
yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu
(pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal.
Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta,
dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi
suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan
tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun
1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan
menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma
sp. PERSIAPAN Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus
disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan
diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat
berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge
hidung, urin dan cairan serebrospinal. Spesimen yang akan dicat,
sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu.
Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau
dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides,
dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di
bawah mikroskop.
Pembuatan preparat
Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat : Ose atau kapas
lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus Bahan : Bahan yang akan
diperiksa.
Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat
yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai
sumber bahan. a.1. Bahan langsung dari penderita Bahan disentrifuge
terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang
berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan
ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas
obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu
spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala
api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah
kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan
sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat.
a.2. Bahan dari biakan cair Ambil gelas obyek yang bersih dan
steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api
spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah
diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada
gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat
yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan
cara seperti pembuatan preparat langsung. a.3. Bahan dari media
pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril,
bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus.
Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan
ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek
sehingga membentuk diameter 1 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai
homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana
membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita.
Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :
Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah
dipakai. Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di
sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung)
ose dengan tangan. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.
Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat
Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi
yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah
sebagai berikut : Cat Gram A Cat ini terdiri atas : Kristal violet
: 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat : 0,8 gram
Akuades : 80 ml Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal
violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua
mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. Cat Gram
B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram Kalium Yodida : 2 gram
Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan
cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi
cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat
Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih
kuat). Cat Gram C Cat ini terdiri atas : Aseton : 50 ml Etil
alkohol 95 % : 50 ml
Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan
cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :
Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan
terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak
dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut
bakteri Gram positif. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak
tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri
dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian
dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. Cat Gram D Cat Gram D
terdiri atas : Safranin : 0,25 gram Etil alkohol 95 % : 10 ml
Akuades : 90 ml Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat
sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna
mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna
yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan
terjadi 2 kemungkinan : Bakteri Gram positif akan tetap berwarna
ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu
lagi mengikat cat Gram D. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah,
karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan
mampu mengikat cat Gram D.
Dasar teori cat Gram Berdasarkan sifat terhadap cat Gram,
bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif
dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar
perbedaan ini yaitu : Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar
lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif.
Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori
pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap
mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram
positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat
pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori
mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu
dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu. Teori
permeabilitas dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya
lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif
mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan
yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan
kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.
Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis,
hanya 1 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak.
Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan
terlepasnya kompleks kristal yodium. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum
melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan.
Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk
mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu
jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu. Alat dan bahan yang
diperlukan adalah : Alat : Rak pengecatan Kran/sumber air yang
mengalir Bahan : Cat Gram A, B, C dan D Preparat yang telah siap
untuk dicat Skema cara pengecatan Gram : Preparat yang telah siap
dicat, digenangi dengan cat Gram A selama 1 3 menit
Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir
Preparat digenangi cat Gram B selama 0,5 1 menit
Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir
Preparat ditetesi dengan cat Gram C sampai warna cat tepat
dilunturkan.
Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir
Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1 2 menit
Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara
Preparat siap diamati dibawah mikroskop
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM Kelebihan : Pengecatan
Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi
antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab
infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal
ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang
berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang
morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik.
Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci
intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan
presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Kekurangan :
Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni
lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil
mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur
sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut.
Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan
untuk diperiksa secara mikroskopis. Pustaka acuan : Nirwati, Hera,
_______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum
Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Strohl, William A, Rouse,H,
Fish
materi referensi:http://72.14.235.132/search?q=cache:n6ND
http://www.google.co.id/search?hl=id&cli