Chapter 1 Molecular Biology for Clinicians

1

Prophase

Dengan mulainya pembelahan, kromosom berkondensasi, dan dua kromatid menjadi

terlihat. Membran inti menghilang. Sentriol adalah sebuah organela di luar nucleus yang

membentuk spindle-spindel untuk pembelahan sel; sentriol menduplikasi dirinya sendiri,

dan dua sentriol bermigrasi ke kutub-kutub sel berlawanan.

Metaphase

Kromosom bermigrasi ke tengah sel, membentuk sebuah garis designated the equatorial

plate. Kromosom-kromosom sekarang terkondensasi secara maksimal. Spindel,

mikrotubula-mikrotubula protein yang berradiasi dari sentriol-sentriol dan melekat pada

sentromer, dibentuk.

Anaphase

Pembelahan terjadi pada plana longitudinal dari sentromer. Dua kromatid baru bergerak

ke sisi-sisi sel yang berlawanan ditarik oleh kontraksi spindel-spindel.

Telophase

Pembelahan sitoplasma mulai pada plana equatorial, berakhir dengan pembentukan dua

membrane sel komplit. Dua kelompok kromosom dikitari oleh membrane-membran inti

yang membentuk nuklei (inti-inti) baru. Setiap strand DNA berperan sebagai suatu

template (cetakan), dan isi DNA dari sel berlipat ganda.

Meiosis

Meiosis adalah pembelahan sel yang membentuk gamet-gamet, masing-masing dengan

jumlah kromosom haploid. Meiosis memiliki dua tujuan: reduksi jumlah kromosom dan

rekombinasi untuk mentransmisikan informasi genetik. Pada meiosis I, kromosom-

kromosom homolog berpasangan dan berpisah. Meiosis II adalah serupa dengan mitosis

karena kromosom-kromosom yang sudah terbagi akan berpisah dan mengalami segregasi

menjadi sel-sel baru.

Pembelahan Meiosis Pertama (Meiosis I)

2

Prophase

Lepotene: Kondensasi kromosom-kromosom.

Zygotene: Proses berpasangan kromosom-kromosom yang homolog (sinapsis)

Pachytene: Setiap pasangan kromosom menebal untuk membentuk empat strand.

Ini adalah stadium dimana crossing over atau rekombinasi dapat

terjadi (pertukaran DNA dari segmen-segmen homolog antara dua dari

empat strands). Chiasmata adalah tempat-tempat kontak dimana terjadi

crossover (saling silang) (dan dapat divisualisasi). Gerakan blok-blok

DNA ini adalah suatu metode untuk menciptakan keanekaragaman

genetika. Di sisi lain, penyakit-penyakit genetic dapat diakibatkan oleh

insersi sekuensi selama gametogenesis. Rekombinasi transposisi,

dengan menggunakan enzim-enzim yang mengenali sekuensi asam

nukleat spesifik, memungkinkan insersi suatu elemen genetic ke dalam

region apapun dari suatu kromosom. Ini adalah sebuah metode yang

digunakan oleh virus-virus (seperti human immunodeficiency virus)

untuk metransformasi sel-sel pejamu.

Diplotene: Separasi longitudinal tiap kromosom.

Metaphase, Anaphase, dan Telophase Meiosis I

Membran inti menghilang, dan kromosom-kromosom bergerak ke pusat sel. Satu

anggota dari tiap pasangan bergerak ke masing-masing kutub, dan sel-sel kemudian

terbagi. Meiosis I seringkali dirujuk sebagai pembelahan reduksi karena tiap produk

baru sekarang memiliki jumlah kromosom haploid. Adalah selama pembelahan

meiosis pertama terjadi pewarisan ala Mendel. Saling silang yang terjadi sebelum

metaphase menghasilkan kombinasi-kombinasi material genetik yang baru, baik itu

disukai atau tidak.

Pembelahan Meiosis Kedua (Meiosis II)

Pembelahan kedua mengikuti yang pertama tanpa replikasi DNA. Pada oosit, meiosis II

terjadi setelah fertilisasi. Hasil akhirnya adalah produksi empat sel-sel haploid.

3

Struktur dan Fungsi DNA

DNA adalah material gen yang bertanggung jawab untuk koding pesan genetik yang

ditransmisikan melalui protein-protein spesifik. Oleh karena itu, ini adalah molekul

kehidupan yang paling penting dan mekanisme fundamental untuk evolusi. Gen-gen

adalah segmen-segmen DNA yang memberi kode untuk protein-protein spesifik,

bersama dengan flanking dan intervening sequences yang memiliki fungsi pengontrolan

dan pengaturan. Tiap molekul DNA memiliki tulang punggung deoksiribosa, kelompok-

kelompok pengulang identik gula deoksiribosa yang dihubungkan melalui ikatan-ikatan

fosfodiester. Tiap deoksiribosa dilekatkan secara berurutan (memberi individualitas dan

spesifisitas) pada satu dari empat asam-asam nukleat, basa-basa nuklear (inti):

Sebuah purine – adenine atau guanine

Sebuah pyrimidine – thymine atau cytosine.

Sebuah nukleotida adalah blok bangunan dasar dari DNA. Ia terdiri atas tiga komponen

utama: gula deoksiribosa, sebuah grup fosfat, dan suatu asam basa nukleat. Hubungan-

hubungan gula-fosfat adalah asimetrik; fosfor dihubungkan ke 5-karbon dari satu gula

dan ke 3-karbon dari gula berikut. Sehingga, satu ujung adalah ujung 5’ (5 prime) dan

yang lainnya ujung 3’ (3 prime). Dengan konvensi, DNA dan sekuensi-sekuensi asam

intinya ditulis dari kiri ke kanan, dari ujung 5’ ke ujung 3’, arah proses transkripsi. Ujung

5’ menuju ke pembentukan ujung amino dari protein; ujung 3’ membentuk ujung

karboksi dari protein.

DNA terdiri atas dua strand deoksiribosa yang tergulung berputar satu sama lain searah

jarum jam dalam bentuk heliks ganda, dengan asam-asam nukleat pada sisi dalam dan

basa-basa nuclear dipasang-pasangkan oleh ikatan hydrogen, adenine dengan thymine

dan cytosine dengan guanine. RNA berbeda dari DNA dalam hal ini adalah single

stranded, its sugar moiety adalah ribose, dan ia menggantikan uracil untuk thyminen.

Bagaimana bisa DNA sebuah sel, yang ukuran-ukuran regangnya hampir dua meter

panjangnya, muat di dalam sebuah sel? Watson dan Crick menjelaskan hal ini ketika

mereka mengajukan sebuah heliks yang memiliki dua strands yang ter coiled secara

ketat, yakni heliks ganda. Seperti halnya sentimeter sebagai ukuran panjang, demikian

pula the base pair (bp) adalah unit ukuran untuk DNA. The base pair adalah adenine-

4

guanine atau cytosine-thymine, asam nukleat dari satu rantai yang berpasangan dengan

asam nukleat yang menghadap dari rantai lainnya. Oleh karena itu, sebuah fragmen DNA

diukur dengan jumlah base pairs, misalnya sebuah fragmen 4.800 bp (suatu fragmen 4,8

kb). Diperkirakan bahwa kita memiliki 3,2 miliar bp DNA, yang mana hanya sebagian

kecilnya yang sebenarnya memberi kode untuk protein-protein.

Proses replikasi DNA mulai dengan pemisahan heliks DNA yang berstrand ganda,

dimulai pada langkah-langkah multiple oleh kerja enzim. Dengan DNA orisinil unwinds

ke dalam strand-strand cetakan, DNA polymerase mengkatalisis sintesis strand-strand

duplikat baru, yang membentuk kembali sebuah heliks ganda dengan setiap strand-strand

orisinil (ini disebut replikasi). oleh karena itu, tiap molekul anak mengandung satu dari

strand orangtuanya. Diperkirakan bahwa molekul DNA orisinil hadir dalam zygote yang

difertilisasi harus dikopi sekitar 1015 kali selama perjalanan kehidupan manusia.

Kecepatan dan akurasi adalah penting. Dengan mengkombinasi presisi dengan sistem-

sistem koreksi kekeliruan, maka kekeliruan yang mempengaruhi fungsi proteinnya gen

adalah dengan mengejutkan jarang.

Homeobox adalah suatu sekuensi DNA, yang sangat dikonservasi sepanjang evolusi,

yang mengkode serangkaian 60 asam-asam amino, yang disebut homeodomain. Produk-

produk protein homeodomain berfungsi sebagai faktor-faktor transkripsi dengan

berikatan pada DNA. Homeobox mempengaruhi fungsi-fungsi jaringan spesifik yang

kritis bagi pertumbuhan dan perkembangan embrio.

Genom Manusia

Genom untuk tiap spesies terdiri atas set komplit sekuensi-sekuensi DNA pada semua

kromosom. Terdapat 3,2 miliar base pairs pada setiap genom manusia haploid; dalam

DNA heliks double-stranded, terdapat enam miliar nukletida, dan terdapat sekitar 30.000

sampai 35.000 gen, unit fungsional terkecil dari informasi yang diwariskan. Gen-gen

berjumlah hanya sekitar 2% dari DNA manusia. Meskipun secara sekilas sangat

kompleks, bahasa genetic seluruhnya dituliskan dengan hanya empat huruf: A, C, G, dan

T (U pada RNA). Lagipula, bahasanya terbatas hanya pada kata-kata 3 huruf, codons.

Akhirnya, pesan genetic keseluruhan difragmentasi ke dalam 23 pasang kromosom.

Dengan empat nukleotida, grup-grup pembaca dari tiga, terdapat 64 kombinasi yang

mungkin. Secara esensial semua organisme hidup menggunakan kode ini. Genom hanya

5

berubah dengan kombinasi-kombinasi baru yang diwarisi dari orangtua atau dengan

mutasi.

Struktur dan Fungsi Gen

Pengaturan linear banyak gen membentuk sebuah kromosom. Sebuah gen tersusun atas

sebuah segmen DNA yang mengandung exons yang dipisahkan oleh introns, codons

koding dan nonkoding dari nukleotida, berturut-turut. Pola intron-exon cenderung

dipertahankan selama evolusi. Gen-gen alfa- dan beta-globin diyakini muncul 500 juta

tahun lalu, dengan introns pada lokasi yang sama seperti saat ini.

Exon

Segmen sebuah gen yang menghasilkan sebuah produk messenger RNA yang memberi

kode untuk satu protein spesifik.

Intron

Segmen sebuah gen yang tidak direpresentasi dalam RNA matur, dan karenanya,

nonkoding untuk protein.

Codon

Sebuah sekuensi dari tiga basa dalam RNA atau DNA yang memberi kode untuk sebuah

asam amino spesifik; the triplet codon.

Dengan beberapa pengecualian, diyakini dahulu bahwa satu gen menghasilkan hanya

satu protein. Namun, melalui mekanisme yang dikenal dengan alternative splicing,

30.000 sampai 35.000 gen-gen manusia dapat memproduksi lebih dari 100.000 protein.

Sebagaimana yang dicatat di atas, introns tidak ditranslasi menjadi produk-produk

protein. Hanya sekuensi-sekuensi DNA di dalam exons (bagian yang “exits” nukleus)

ditranskripsikan ke dalam messenger RNA dan kemudian ditranslasi menjadi protein-

protein. Namun demikian variasi-variasi (alternative splicing) dapat menghasilkan

protein-protein terkait.

Gen-gen juga mencakup sekuensi-sekuensi flanking yang penting untuk transkripsi gen.

Area yang akan menginisiasi aksi DNA (misalnya ikatan DNA ke kompleks hormon-

reseptor) disebut suatu region enhancer. Area actual dimana transkripsi mulai adalah

6

region promoter. Hanya sedikit sekuensi-sekuensi nukleotida yang relative pendek

adalah promoter, seperti sekuensi T-A-T-A-A, atau kotak TATA, dan sekuensi C-C-A-

A-T, atau kotak CAT. Lokasi-lokasi promoter (lokasi-lokasi ikatan untuk RNA

polymerase dan banyak kofaktor) adalah biasanya di dekat titik awal dari region koding

gen. Lokasi-lokasi enhancer adalah lebih besar daripada lokasi-lokasi promoter dan dapat

berlokasi di mana saja, bahkan jauh dari gen nya, namun biasanya berada di ujung

flanking 5’. Pada ujung 3’, sebuah sekuensi koding biasanya ada untuk ekor polyadenine

(poly-A) yang umum untuk kebanyakan molekul-molekul messenger RNA.

Lokasi-lokasi enhancer mengikat protein-protein (protein-protein pengatur) yang

berperan sebagai signal-signal untuk meregulasi ekspresi gen dengan cara baik

meningkatkan atau merepresi pengikatan RNA polymerase dalam region promoter. Ini

adalah satu metode menciptakan fungsi-fungsi seluler yang unik. sebagai contoh, sebuah

jaringan target hormon dapat berespons terhadap hormonnya karena ia mengandung

sebuah protein reseptor khusus yang, pada pengikatan ke hormon, akan berikatan pada

sebuah lokasi enhancer DNA. Protein-protein spesifik (disebut faktor-faktor transkripsi)

berikatan ke lokasi-lokasi enhancer dan mengaktivasi transkripsi. Regulasi transkripsi

gen biasanya melibatkan sekuensi-sekuensi DNA pada region upstream flanking 5’ dari

sebuah gen.

Tiga codon (UAG, UAA, UGA) disebut stop codons, karena mereka mengkhususkan

sebuah pemberhentian bagi translasi RNA menjadi protein (seperti sebuah titik pada

akhir satu kalimat). Sebaliknya, sebuah open reading frame adalah suatu serial panjang

dari base pairs antara dua stop codons; karenanya, sebuah open reading frame memberi

kode sekuensi asam amino produk protein. Menemukan dan mengidentifikasi suatu open

reading frame adalah satu langkah penting dalam menganalisa sekuensi-sekuensi DNA

karena sekuensi yang demikian panjang biasanya hanya ditemukan pada sebuah gen

yang aktif.

Ekspresi gen terdiri atas langkah-langkah berikut: transkripsi DNA ke RNA, pemrosesan

RNA untuk menghasilkan messenger RNA yang fungsional dengan cara splicing out

introns, translasi messenger RNA pada sebuah ribosome ke sebuah rantai peptide, dan

pemrosesan structural protein ke bentuk fungsional.

Transkripsi

7

Transkripsi adalah sintesis messenger RNA yang ber strand tunggal dari sebuah gen

(double-stranded DNA). Sekuensi asam amino proteinnya diberi kode dalam DNA leh

codons; asam amino tunggal diberi kode oleh tiap codon, sebuah triplet dari tiga basa

asam nukleat. RNA polymerase membangung messenger RNA dengan cara membaca

strand DNA (strand “antisense”) yang bersifat komplementer pada RNA; sehingga, RNA

adalah sebuah kopi yang tepat dari strand DNA lainnya (strand “sense”), yang juga

disebut strand komplementer dari molekul DNA (ingat, perbedaanp-perbedaan penting

adalah bahwa thymine pada DNA digantikan oleh uracil, dan ribose menggantikan

deoxyribose pada RNA).

Komplementaritas molekuler adalah suatu konsep yang sulit namun juga sederhana

untuk dipahami. Aspek sederhananya adalah konsep satu hal menjadi seperti yang lain.

Bagian sulitnya adalah keharusan untuk memahami dan memvisualisasi bahwa molekul

komplementer tidaklah identik dengan cetakannya, namun lebih seperti tempat dimana

cetakan masuk ke dalam, dan molekul komplementer pergi keluar. Sehingga, strand-

strand heliks ganda tidaklah identik. Setiap strand DNA memiliki struktur komplementer,

dalam arti, satu cetakan positif dan satu cetakan negative, masing-masing menspesifikasi

yang lainya. Oleh karena itu, setiap strand berperan sebagai suatu cetakan bagi DNA

komplementernya (dalam proses replikasi) atau RNA komplementer (dalam proses

transkripsi). Sehingga, messenger RNA disintesis dari cetakan negative, strand

“antisense”, sehingga ia akan memiliki struktur yang sama seperti cetakan positif, yakni

strand “sense”. Para ahli biologi molekuler harus berpikir dalam tiga dimensi!

Transkripsi diawali pada lokasi start upstream, regio flanking yang tidak ditranslasi 5’

dimana dua strands dari heliks ganda menjadi berpisah. Proses ini terus berlanjut kea rah

bawah, dengan mengkopi salah satu dari strand hingga sebuah codon spesifik dicapai,

yang memberi satu pesan berhenti. Sintesis RNA terus dengan tambahan satu rantai

panjang adenines, ekor poly-A; inilah regio yang tidak ditranslasi 3’ yang diyakini

menstabilkan RNA dengan cara mencegah degradasi. Setelah transkripsi dari sebuah gen,

RNA bergerak ke dalam sitoplasma dimana regio-regio intron dieksisi, dan exons

bergabung bersama (RNA splicing) untuk menghasilkan sebuah molekul RNA matur

yang komplit. Mulai dan akhir dari setiap exon dan intron memiliki sekuensi-sekuensi

yang, ketika dikopi ke RNA, memberi signal sebuah enzim untuk mengeluarkan bagian-

bagian yang intervening. Hampir semua introns mulai dengan GU dan berakhir dengan

8

AG (GT dan AG pada intron DNA). Intron-intron memiliki panjang yang bervariasi;

sebuah intron tunggal dapat lebih panjang daripada produk RNA akhir. Molekul RNA

matur memiliki sebuah tambahan pada satu ujung (“capping,” dengan penambahan

sebuah nukleotida termodifikasi, 7-metil guanosine) untuk memproteksi terhadap

ribonuklease (RNases) dan pada ujung lainnya, sebuah ekor polyadenine (the poly-A tail)

ditambahkan (selain dari faktor stabilisasi, mungkin sebuah signal untuk mengarahkan

exit dari nukleus). Kedua ujung adalah tidak ditranslasi dalam ribosomes.

Faktor-faktor Transkripsi. Faktor-faktor transkripsi adalah protein-protein yang terikat

pada elemen-elemen regulator dalam DNA (enhancers dan promoters) dan karenanya

mempengaruhi ekspresi gen. Reseptor-reseptor hormon steroid adalah faktor-faktor

transkripsi. Transkripsi gen dan pembentukan messenger RNA dapat distimulasi ataupun

diinhibisi melalui interaksi-interaksi langsung dengan DNA. Faktor-faktor transkripsi

dapat lebih lanjut berinteraksi dengan faktor-faktor lain (koaktivator dan korepresor, juga

disebut protein-protein adapter) untuk menghasilkan efek-efek kooperatif. Aktivitas

protein-protein ini juga dapat dipengaruhi oleh fosforilasi yang dicetuskan oleh signal-

signal dari reseptor-reseptor permukaan sel (seringkali faktor-faktor pertumbuhan).

Sebuah konsep penting adalah untuk melihat hasil akhir dari aktivitas hormonal dan

ekspresi gen sebagai suatu refleksi dari cellular context, kondisi dan aktivitas faktor-

faktor transkripsi sebagaimana yang dipengaruhi oleh protein-protein adapter intraseluler

spesifik. Ini menjelaskan bagaimana agen-agen serupa (dan faktor-faktor transkripsi

serupa, misalnya reseptor estrogen) dapat memiliki kerja yang berbeda pada jaringan-

jaringan yang berbeda.

Translasi

Messenger RNA berjalan dari kromosom pada mana ia disintesis ke sebuah ribosome

dalam sitoplasma, dimana ia mengarahkan perakitan asam-asam amino menjadi protein

(translasi). Setiap sel memiliki karakteristik namun dinamis dan selalu mengganti

proteome, kumpulan protein-protein yang unik bagi sel tersebut. Asam-asam amino

dibawa ke dalam proses oleh molekul-molekul RNA transfer khusus. Sekuensi spesifik

dari tiga basa pada satu ujung dari transfer RNA adalah komplementer bagi codon yang

melakukan koding bagi asam amino spesifik itu. Pengikatan area ini ke codon messenger

RNA menempatkan asam amino spesifik tersebut yang di ujung lain menjadi sekuensi

9

yang sesuai bagi protein nya. Asam-asam amino ditempatkan satu per satu ketika

molekul-molekul transfer RNA membaca cetakan RNA, mulai pada ujung asam amino

(ujung 5’) dan berakhir pada ujung carboxy (ujung 3’). Proses ini mulai pada triplet

AUG pertama dan berlanjut hingga sebuah stop codon (UAA, UAG, atau UGA) dicapai,

yang mana di tempat tersebut messenger RNA menjatuhkan ribosome dan berdegenerasi.

Sekuensi asam-asam amino linear khusus dispesifikasi oleh koding genetik; pada

gilirannya, sekuensi ini menentukan bentuk 3-dimensi dari protein, struktur berlipat yang

perlu untuk fungsi.

Ekspresi akhir sebuah gen dapat saja tidak berakhir dengan proses translasi. Pemrosesan

protein lanjut (pascatranslasi) terjadi, seperti glycosylation (gonadotropins) atau

proteolytic cleavage (konversi pro-opiomelanocortin ke ACTH). Ini dirujuk sebagai

modifikasi “epigenetika”.

Mekanisme-mekanisme yang menghasilkan protein-protein dari gen-gen adalah serupa

sepanjang dunia biologis. Ini berarti bahwa pengetahuan penting mengenai fungsi

manusia dapat diperoleh dengan mempelajari organisme-organisme sederhana, dan

mikroba-mikroba dapat direkayasa untuk menghasilkan protein-protein manusia.

Mutasi-mutasi

Banyak gen ada dalam beragam bentuk, disebut allele. Perubahan dalam sekuensi DNA

yang menghasilkan perubahan dalam struktur atau fungsi protein yang berbahaya

membangun sebuah mutasi. Substitusi merujuk pada perubahan dalam asam basa nukleat

tunggal. Sebuah substitusi dalam sebuah codon dapat menghasilkan inkorporasi asam

amino yang salah ke dalam sebuah protein, menimbulkan perubahan atau kehilangan

fungsi. Insersi atau penghilangan asam-asam amino ke produk akhir protein dapat

dihasilkan dari splicing RNA yang tidak tepat. Karena kelebihan yan banyak dalam kode

genetic (banyak triplet codons memberi kode untuk asam amino yang sama, dan hanya

ada 20 asam amino), maka tidak semua substitusi menghasilkan suatu efek. Sebuah

contoh klinis dari substitusi basa tunggal (mutasi titik) adalah mutasi sickle, dimana

thymine disubstitusi untuk adenine pada gen beta-globin. Jika regio-regio DNA homolog

menjadi tidak selaras, maka dapat terjadi saling silang yang tidak sama, mengakibatkan

penghilangan dan penyisipan (tambahan). Sebuah “nonsense mutation” merujuk pada

suatu substitusi basa tunggal yang menghasilkan sebuah stop codon, truncating produk

10

protein. Penghilangan dan penyisipan dapat melibatkan basa-basa tunggal, hingga

seluruh exons, atau gen-gen atau beberapa gen. Rekombinasi atau pertukaran material

genetic biasanya terjadi dalam meiosis. Bahkan sebuah perubahan pada junksi dari suatu

regio koding dan nonkoding dapat menghasilkan messenger RNA yang abnormal.

Abnormalitas Kromosom

Abnormalitas Numerik

Abnormalitas numeric biasanya sehubungan dengan nondisjunction, sebuah kegagalan

pemisahan pada anaphase, baik saat pembelahan mitosis ataupun meiosis. Aneuploidy

adalah jumlah kromosom yang tidak merupakan multipel tepat dari jumlah haploid,

misalnya monosomi (45,X Turner-syndrome) atau trisomi (trisomi 13 Patau syndrome,

trisomi 18 Edwards syndrome, trisomi 21 Down syndrome, 47,XXY Klinefelter

syndrome). Mosaicism mengindikasikan satu atau lebih garis-garis sel dengan kariotipe

yang berbeda, biasanya muncul dari nondisjunction saat mitosis awal (kegagalan dari dua

kromosom yang berpasangan untuk berpisah). Polyploidy, multipel jumlah kromosom

haploid, adalah suatu penyebab signifikan akan keguguran spontan.

Abnormalitas Struktural

Abnormalitas structural biasanya sehubungan dengan pemecahan kromosom yang

diinduksi oleh radiasi, obat-obat atau virus. Abnormalitas hasilnya tergantung pada

pengaturan kembali bagian-bagian yang pecah. Karenanya, pada suatu translocation

terdapat saling tukar material antara dua atau lebih kromosom yang nonhomolog. Sebuah

translokasi yang seimbang dikaitkan dengan tidak mendapatkan ataupun kehilangan

material genetic, dan individu demikian adalah seorang pembawa translokasi

(translocation carrier).

Defek-defek Gen Tunggal

Defek-defek gen tunggal dikarenakan oleh mutasi-mutasi pada gen-gen khusus. Mutasi-

mutasi ini ditransmisikan sesuai dengan pewarisan ala Mendel: dominan otosom, resesif

otosom, resesif terkait-X, dan jarang dominan terkait-X. Selain itu, gangguan-gangguan

gen tunggal dapat ditransmisikan dengan cara pewarisan gen mitokondrial, imprinting

maternal atau paternal, disomy (mewariskan kedua pasangan dari suatu kromosom dari

11

satu induk), dan pengulangan yang berlebihan (sebuah fenomena dimana lebih dari

pengulangan biasa dari tiga base pairs terjadi).

Dominansi Otosomal. Transmisi tidak terkait dengan jenis kelamin satu individu, dan

anak-anak homozigot maupun heterozigot terkena (hanya satu allele perlu untuk

abnormal). Dengan dua orangtua yang heterozigot, tiap anak memiliki risiko 75%

terkena. Dengan satu orangtua yang heterozigot, setiap anak memiliki risiko 50% untuk

terkena. Efeknya adalah sesuai dengan beragam ekspresi. Contoh-contoh kondisi

dominan otosom mencakup penyakit Huntington, neurofibromatosis, dan sindroma

Marfan. Efek dari gen dominan yang abnormal dipengaruhi oleh penetrance, derejat gen

dominan tersebut diekspresikan. Penetrance yang komplit, berlawanan dengan

penetrance tidak komplit, berarti bahwa gen ini selalu diekspresikan dan selalu

menghasilkan fenotipe yang dapat dikenali.

Resesif Otosomal. Kondisi-kondisi ini secara fenotipik diekspresikan hanya pada

homozigot (kedua allele harus abnormal). Dengan orangtua yang heterozigot, setiap anak

memiliki 25% risiko terkena dan 50% peluang menjadi carrier. Contoh-contoh kondisi

resesif otosomal adalah kistik fibrosis, penyakit sickle cell, dan hyperplasia adrenal

sehubungan dengan defisiensi pada 21-hydroxylase.

Pewarisan Resesif Terkait-X. Seorang ayah yang terkena dapat mentransmisikan

kondisi ini hanya pada anak perempuan. Hanya wanita yang homozigot yang terkena

ketika kondisinya resesif. Tiap anak laki-laki dari seorang carrier wanita memiliki 50%

peluang menjadi terkena dan tiap anak perempuan 50% peluang menjadi carrier.

Kebutaan warna merah-hijau dan hemofilia A adalah contohnya.

Imprinting Genomik

Imprinting genomic mengindikasikan pengaruh-pengaruh yang menetap pada fungsi

genom oleh kontribusi-kontribusi orangtua laki-laki dan perempuan. Sebagai contoh,

perkembangan plasenta dikontrol kebanyakan oleh gen-gen yang diturunkan secara

paternal. Sehingga, mola hidatidiform memiliki kariotipe normal, namun semua

kromosomnya adalah diturunkan dari ayahnya. Struktur-struktur plasenta tidak ada

dalam teratoma ovarium, tumor-tumor yang mengandung hanya kromosom yang

diturunkan secara maternal. Eksperimen-eksperimen pada alam dan eksperimen hewan

12

mengindikasikan bahwa kontribusi maternal pada genome adalah lebih penting untuk

perkembangan embrionik. Pada kondisi-kondisi resesif otosomal tertentu, ekspres,

keparahan, dan usia awitan dipengaruhi oleh jenis kelamin orangtua yang memberikan

gen atau kromosom mutan.

Teknik-teknik Biologi Molekuler

Sebuah enzim yang memecah ikatan-ikatan fosfodiester dan memotong molekul DNA

menjadi fragmen-fragmen adalah sebuah endonuklease; sebuah restriction enzyme

(restriction endonuclease) hanya memotong pada lokasi-lokasi dengan sekuensi asam

nukleat khusus. Enzim-enzim restriksi ditemukan pada bakteri dimana mereka

membentuk sebuah mekanisme pertahanan untuk memotong (dan karenanya

menginaktivasi) DNA asing apapun (dari virus-virus yang menginvasi) yang diintroduksi

ke dalam sel bakteri. Sebagai bagian dari mekanisme proteksi ini, bakteri juga

mengandung methylases yang memetilasi lokasi-lokasi rekognisi pada DNA asli,

mengarahkan aksi enzim restriksi ke DNA asing yang tidak dimetilasi (nonmethylated

foreign DNA). Bakteri yang berbeda memiliki enzim-enzim restriksi yang berbeda

dengan lokasi-lokasi aksi spesifik. Enzim-enzim restriksi tersedia yang memotong DNA

menjadi bagian-bagian (fragmen-fragmen restriksi), berkisar dari banyak fragmen kecil

hingga beberapa potongan besar, tergantung pada jumlah nukleotida pada sekuensi

rekognisi. Mereka dinamakan untuk organisme dan strain dariman mereka berasal.

Kombinasi fragmen-fragmen restriksi, penggabungan dua potongan DNA, menghasilkan

recombinant DNA.

DNA polymerase adalah suatu enzim yang membawa nukleotida-nukleotida tunggal ke

dalam sebuah molekul DNA. Sebuah DNA polymerase dapat membentuk DNA hanya

pada adanya sebuah cetakan DNA; DNA yang disintesis akan menjadi komplementer

bagi cetakan. RNA polymerase dapat membuat RNA juga hanya pada adanya cetakan

DNA.

Desoxyribonuclease (DNAase) dapat mengeluarkan nukleotida. Dengan

mengkombinasikan penanganan DNAase dengan aksi DNA polymerase, nukleotida-

nukleotida yang di radiolabeled dapat diintroduksi ke dalam molekul DNA,

menghasilkan suatu DNA probe. Sebuah DNA probe dapat dibandingkan dengan

antibodi yang digunakan dalam immunoassays. Antibody ini adalah khusus dan

13

mengenali hormon terhadap mana ia dibentuk. DNA probe secara khusus mendeteksi

sekuensi DNA.

Reverse transcriptase adalah DNA polymerase yang dependen RNA. Ini disebut reverse

transcriptase karena aliran informasi adalah dari RNA ke DNA, kebalikan dari arah

aliran biasa. Enzim ini memungkinkan pengkopian secara esensial molekul RNA apapun

menjadi single-stranded DNA; DNA demikian disebut complementary DNA karena ia

adalah gambar cermin dari messenger RNA. Probe-probe complementary DNA dibatasi

oleh pembacaan mereka hanya exons (ingat bahwa introns dieksisi dari RNA), dan

makanya probe-probe ini hanya membaca area-area besar.

DNA dan RNA adalah molekul-molekul bermuatan, karenanya akan bermigrasi dalam

bidang elektris. Fragmen-fragmen dapat dianalisa dengan elektroforesis gel (agarose atau

polyacrylamide), fragmen-fragmen terbesar yang memigrasikan yang paling lambat.

Dengan konvensi, gel-gel dibaca dari atas ke bawah, dengan fragmen-fragmen terkecil di

bawah.

Southern Blot Analysis

DNA pertama didenaturasi untuk memisahkan dua strand, dicerna oleh enzim-enzim

restriksi untuk menghasilkan fragmen-fragmen yang lebih kecil yang dimuat ke dalam

suatu gel elektroforesis. The southern blot method, dinamakan sesuai penemunya E.M.

Southern, menentukan ukuran-ukuran fragmen. Fragmen-fragmen dipisahkan oleh

elektroforesis. Gel elektroforesis ditempatkan di atas sebuah lembaran tebal kertas

penyaring dengan ujungnya dicelup di dalam larutan garam tinggi. Sebuah membrane

khusus (nitroselulosa) ditempatkan di atas gel, dan di atas ini ditempatkan tumpukan

handuk kertas yang dikompresi oleh sebuah beban. Larutan garam naik oleh aksi wick ke

dalam kertas penyaring; ia bergerak dengan aksi kapiler melalui gel, membawa DNA

dengannya. DNA dibawa ke membrane nitrsoselulosa pada mana ia terikat. Larutan

garam tetap bergerak dan diserap oleh handuk kertas. Membrane nitroselulosa lalu

menciptakan sebuah replica dari pola elektroforesis orisinil. DNA difiksasi ke membrane

baik dengan pembakaran suhu tinggi atau dengan sinar ultraviolet. Kemudian probe-

probe berlabel khusus dapat diintroduksi untuk hybridization. Hybridization berarti

bahwa sebuah probe khusus anneals to sekuensi komplementernya. Fragmen-fragmen

dengan sekuensi ini kemudian diidentifikasi oleh otoradiografi. Probe-probe fluoresen

14

dapat digunakan yang dapat dideteksi setelah aktivasi oleh sebuah sinar laser,

memungkinkan penilaian kualitatif dan kuantitatif oleh sebuah computer.

Northern blotting merujuk pada pemrosesan RNA, Northern karena RNA adalah gambar

lawan dari DNA. RNA yang diekstraksi dipisahkan oleh elektroforesis dan ditransfer ke

sebuah membran selulosa seperti pada Southern blotting untuk hibridisasi dengan probe

(complementary DNA). Northern blotting akan digunakan, sebagai contoh, untuk

menentukan apakah stimulsi hormon dari sebuah protein spesifik dalam suatu jaringan

dimediasi oleh messenger RNA, yakni ekspresi gen.

Elektroforesis untuk memisahkan protein disebut Western blotting, dan antibodi-antibodi

digunakan untuk proses identifikasi hibridisasi. Seperti Northern blotting, Western

blotting mengetes ekspresi gen, tidak hanya adanya sebuah gen. Istilah Northern dan

Western merepresentasikan witticisms yang sengaja (kejadian langka dalam ilmu

pengetahuan) sebagai respons terhadap Southern blotting. Hibridisasi tanpa

elektroforesis dengan menempatkan satu tetes ekstrak sel secara langsung di atas kertas

penyaring disebut dot or slot blotting.

Ketika dua strand komplementer DNA melakukan reasosiasi, maka prosesnya disebut

hibridisasi. Hibridisasi memungkinkan suatu area khusus DNA untuk dipelajari dengan

menggunakan sebuah probe DNA yang ber radiolabel yang spesifik (sebuah sekuensi

komplementer). Membran nitroselulosa yang diproduksi Southern blotting pertama

diperlakukan untuk memblok lokasi-lokasi ikatan nonspesifik. Membrannya kemudian

diberi perlakuan (dihibridisasi) dengan probe yang berlabel. Lokasi probe ikatan

kemudian diidentifikasi oleh otoradiografi (untuk probes yang ber radiolabel) atau oleh

metode colorimetric. Sehingga, sekuensi probe menentukan sekuensi pada tempat ikatan.

Kapanpun dua produk adalah komplementer, maka terjadi hibridisasi. Oleh karena itu,

DNA komplementer dapat dihibridisasi ke messenger RNA cetakannya.

Hibridisasi in situ adalah teknik dimana probe-probe DNA atau RNA berlabel

ditempatkan secara langsung pada sebuah slide jaringan atau sel-sel. Dapat digunakan

sepotong DNA yang dikloning yang diberi label dengan sebuah penanda fluoresen;

metodenya disebut FISH (fluorescence in situ hybridization). Regio yang

berkorespondensi dengan DNA yang dikloning menyala di bawah penyinaran fluoresen

15

kecuali bila regionya telah dihilangkan dari salah satu kromosom. Beberapa sindrom

microdeletion telah ditemukan dengan teknik FISH., misalnya sindrom Prader-Willi.

..... Technology

Metode ini mendeteksi ekspresi gen, mengetes ribuan gen secara simultan. DNA kloning

komplementer dihibridisasi dengan DNA komplementer berlabel yang disiapkan dari

jaringan yang akan dipelajari. Jika jaringan itu mengekspresikan sebuah gen, maka signal

berlabel mudah diobservasi. Produksi chips gen spesifik memungkinkan teknik ini

mencari mutasi-mutasi dan polimorfisme. The microarray gene chip adalah array fisik

DNA yang secara simultan dapat mengidentifikasi ribuan produk-produk mRNA yang

unik pada sampel-sampel heterogen. Proses yang sangat otomatis ini dapat

mengindikasikan ekspresi yang berbeda gengen sebagai respons akan beragam stimuli

atau kondisi.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik untuk mengamplifikasi (relatif cepat)

fragmen-fragmen kecil atau area-area DNA ke dalam kuantitas yang cukup besar untuk

dianalisis dengan elektroforesis dan metode-metode blotting. Teknik ini menghasilkan

jumlah kopian yang besar sekali akan sekuensi DNA khusus tanpa resorting ke kloning.

Sekuensi yang akan diamplifikasi harus diketahui. Petanda-petanda khusus (sekuensi-

sekuensi DNA pendek yang disintesis berkoresponding dengan tiap ujung dari sekuensi

yang akan dipelajari) diseleksi yang akan delineate regio DNA yang akan diamplifikasi.

Sekuensi-sekuensi flanking ini disebut primers. Sampel DNA, the primers, dan kelebihan

nukleotida tunggal bebas diinkubasi dengan DNA polymerase.

Langkah pertama melibatkan pemisahan DNA menjadi strand-strand tunggalnya dengan

cara denaturasi dengan panas (92oC); kemudian suhu diturunkan (40oC), yang

menyebabkan the primers melekat (anneal) pada regio-regio komplementer mereka pada

DNA. Suhu dinaikkan hingga 62oC, dan DNA polymerase lalu mensintesis sebuah strand

baru yang mulai dan berakhir pada the primers, membentuk double-stranded DNA yang

baru. Mengulangi siklusnya banyak kali (dengan mengubah suhu reaksi)

mengamplifikasi jumlah DNA yang tersedia untuk dipelajari (lebih dari 1 juta kali lipat);

kenaikannya terjadi secara eksponensial. Sehingga, DNA bisa dianalisa dari sebuah sel

16

tunggal, dan gen-gen dapat divisualisasi dengan blotting tanpa probe-probe yang

berlabel.

Karena prosesnya membutuhkan pemanasan dan pendinginan yang berganti-ganti, maka

DNA polymerase yang resisten terhadap panas adalah keuntungan dimana replenishment

periodic tidak diperlukan. Masalah ini diatasi dengan penemuan DNA polymerase (Taq

polymerase) dalam sebuah mikroorganisme (Thermus aquaticus) yang adalah sebuah

thermophile (mikroba air-panas) dan ditemukan di sebuah out-of-the-way Yellowstone

National Park hot spring called Mushroom Pool. Polymerase bersuhu tinggi ini

memungkinkan otomasi prosesnya.

Teknik polymerase chain reaction telah dibuat mungkin untuk meneliti DNA dalam

jumlah yang sangat sedikit dari jaringan atau cairan tubuh apapun. Sindroma Down dapat

didiagnosis dari sedikit sel fetus yang diperoleh dari darah ibu. Hal yang mengesankan

adalah amplifikasi jumlah kecil DNA yang terdegradasi dari spesies yang punah dan

langka diawetkan di museum. DNA dari fosil-fosil telah diamplifikasi dan dibuat

sekuensi (misalnya dari tanaman magnolia berumur 18 juta tahun). Metode ini juga

memungkinkan untuk mengidentifikasi sebuah gen melalui ekspresi messenger RNA

nya. RNA adalah cetakan untuk amplifikasi dengan pertama-tama mengkonversinya

menjadi DNA komplementer. Polymerase chain reaction digunakan untuk mendeteksi

mikroba, memberi hasil dalam beberapa jam bahkan dengan adanya obat-obat

antimikroba. Metode ini dapat mendeteksi bakteri yang tidak bisa diisolasi dengan teknik

kultur.

Kloning DNA

Kloning berarti mengisolasi sebuah gen dan membuat kopiannya. Sebuah perpustakaan

DNA adalah koleksi molekul-molekul DNA yang berasal dari metode kloning.

Perpustakaan DNA komplementer adalah DNA counterpart dari semua messenger RNA

yang diisolasi dari sel atau jaringan tertentu. DNA komplementer telah diproduksi untuk

lebih dari 70% gen manusia dan tikus. Dengan memulai dengan messenger RNA,

pencarian akan gen yang dimaksud dapat difokuskan (bukannya mencari keseluruhan

genome). Perpustakaan demikian dibuat dengan menggunakan reverse transcriptase.

Molekul-molekul DNA kemudian dapat diinsersikan ke dalam vector yang sesuai

(dijelaskan di bawah) dan mereplikasi molekul-molekul yang dapat diproduksi. Dengan

17

menggunakan probes, DNA komplementer dapat diseleksi yang sesuai dengan gen yang

dimaksud (ingat bahwa DNA komplementer hanya mencakup exons dari sebuah gen).

Kloning DNA berarti produksi banyak kopian identik dari fragmen DNA yang

dispesifikasi. Kloning juga dapat dilakukan dengan menggunakan polymerase chain

reaction. Sebagaimana yang diindikasikan di atas, kloning DNA komplementer berfokus

pada DNA counterpart dari messenger RNA; kloning DNA genomic, dengan

menggunakan endonuklease restriksi, kopia DNA dalam gen. Kloning juga dapat

digunakan untuk membuat kopian probes yang beragam atau fragmen-fragmen DNA

yang tidak diketahui.

Jika sekuensi asam amino tidak diketahui, kita dapat bekerja ke belakang. Dengan

mengetahui produk protein spesifik, antibody-antibodi dapat diproduksi melawan

protein. Ketika DNA komplementer diinsersikan ke dalam vektor-vektor tertentu,

produksi protein dapat diidentifikasi dengan antibodi-antibodi; sehingga fragmen DNA

akan terisolasi.

Sebuah vektor adalah sebuah entitas dimana DNA asing dapat diinsersikan. Vektor

ditambah DNA asing diinsersikan ke dalam sel pejamu; sel pejamu menghasilkan baik

vektor maupun DNA asing. Vektor-vektor pertama adalah plasmid bacterial, molekul-

molekul DNA sirkuler (minikromosom) yang koeksis di dalam sitoplasma dengan DNA

kromosom bacterial. Hal yang paling penting dicatat, mereka membawa gen-gen yang

memberi kode untuk resistensi antibiotika. Hal ini memampukan sel-sel bakteri yang

mengandung plasmid yang akan diseleksi oleh terapi antibiotika yang tepat. Vektor-

vektor plasmid juga telah dikembangkan yang memungkinkan seleksi oleh warna.

Beragam strain bakteri telah dikembangkan, masing-masing untuk penggunaan

khususnya.

Gangguan DNA plasmid dengan enzim-enzim restriksi, yang disertai dengan inkorporasi

DNA asing dengan DNA ligase, menghasilkan molekul-molekul DNA plasmid (DNA

rekombinan yang mengandung DNA asing) yang dapat direplikasi. Vektor-vektor

plasmid dapat menginkorporasi fragmen-fragmen DNA asing hingga 10 kb ukurannya.

Pencernaan plasmid-plasmid yang pulih dengan enzim-enzim restriksi melepaskan

fragmen DNA yang diinginkan, yang kemudian dapat dipulihkan dengan elektroforesis.

18

Vektor lain ada. Bakteriofag (atau phages) adalah virus-virus yang menginfeksi dan

bereplikasi di dalam bakteri. Vektor-vektor phage dapat menginkorporasi sisipan DNA

yang lebih besar, hingga 20 kb. Kloning DNA dengan vektor phage mengikuti rancangan

dasar yang sama seperti plasmid. Fragmen-fragmen DNA asing yang lebih besar

dikloning dengan vektor cosmid, yang secara artificial diproduksi kombinasi vektor-

vektor phage dan plasmid. Fragmen-fragmen yang sangat besar, hingga 1.000 kb, dapat

dikloning dengan menggunakan kromosom artificial ragi. Metode ini dapat bekerja

dengan keseluruhan gen.

Langkah-langkah Dasar untuk Kloning

1. Pilih sumber DNA: baik itu DNA genomic atau DNA komplementer

2. Fragmentasi DNA nya dengan endonuklease restriksi.

3. Sisipkan fragmen-fragmen ke dalam vektor.

4. Introduksi vektor ke dalam bakteri

5. Kumpulkan DNA yang dikloning yang terpropagasi dalam bakteri untuk

membentuk sebuah perpustakaan

6. Skrining perpustakaan untuk sekuensi yang diinginkan. Metode-metode yang

mungkin mencakup penggunaan probes nukleotida komplementer untuk fragmen-

fragmen yang menghibridisasi atau deteksi protein spesifik yang dihasilkan

dengan antibodi terhadap proteinnya atau dengan cara assaying fungsi proteinnya.

Model-model Hewan Knockout

Model-model hewan untuk fungsi sebuah gen memakai metode “knocking out” sebuah

gen spesifik. Pada sebuah demonstrasi yang sederhana namun penting, dapat ditentukan

apakah sebuah gen spesifik dan protein-proteinnya adalah esensial untuk kehidupan, atau

untuk sebuah fungsi (seperti kehamilan).

Identifikasi Gen

Untuk mengkloning sebuah gen keseluruhan yang produk proteinnya telah diketahui,

maka sebuah perpustakaan DNA komplementer dihasilkan. Fragmen DNA spesifik

19

diidentifikasi dengan cara menghubungkannya dengan protein. Setelah teridentifikasi,

gen total dapat diskrining dengan menggunakan DNA komplementer yang

teridentifikasi, mengidentifikasi introns dan exons. Strategi lainnya adalah untuk

mensintesis suatu probe oligonukleotida, mendasarkan sekuensinya pada sekuensi asam

amino yang telah diketahui dalam produk protein (dari sekuensi peptide, sekuensi DNA

yang memberi kode untuk protein itu dapat diprediksi). Metode ini dapat digunakan

dengan hanya potongan peptide yang relatif kecil. Dengan semakin banyaknya gen yang

dikloning, frekuensi codon untuk asam-asam amino tertentu ditentukan. DNA

komplementer dapat dikloning tanpa memproduksi suatu perpustakaan dengan

menggunakan polymerase chain reaction untuk mengamplifikasi DNA komplementer

yang dibuat dari messenger RNA oleh reverse transcriptase. Sekuensi-sekuensi tumpang

tindih dari genom dapat dikloning, dengan menggunakan sepotong DNA dari tiap produk

yang berhasil, untuk bekerja pada sebuah kromosom dengan cara yang sistematik untuk

mencari sebuah gen; ini disebut chromosome walking.

Seluruh proses sekuensi dapat dikerjakan dengan computer, bahkan mencari open

reading fames. Setelah diidentifikasi sekuensi fragmen DNA, maka komputer dapat

menggunakan database DNA dan protein untuk memprediksi sekuensi, lokasi rekognisi,

translasi protein, dan homologi dengan sekuensi yang dikenal. Ilmuwan kemudian dapat

menyeleksi ukuran-ukuran fragmen restriksi untuk kloning. Setelah gen dianalisa, harus

dibandingkan dengan gen dalam keadaan penyakit. Jika mutasi berukuran besar, ini

dapat dideteksi dengan Southern blotting. Perubahan minor membutuhkan perbandingan

dalam sekuensi-sekuensi DNA, yang mungkin dengan menggunakan amplifikasi rantai

polymerase untuk menghasilkan sekuensi gen spesifik pada jumlah yang siap dipelajari.

Sebuah gen dapat dilokalisasi ke kromosom spesifik ketika produk proteinnya tidak

diketahui dengan studi-studi yang melibatkan pengaturan kembali kromosom dan

analisis hubungan. Penyakit-penyakit spesifik dikaitkan dengan perubahan-perubahan

kariotipik. Sehingga, kromosom spesifik dapat ditargetkan untuk lokalisasi gen. Analisis

hubungan menggunakan polimorfisme panjang fragmen restriksi.

Polimorfisme DNA

Southern blotting menunjukkan pola-pola spesifik dari bands yang merefleksikan

berbagai panjang fragmen-fragmen DNA yang diproduksi oleh kerja enzim restriksi.

20

Sebuah lokasi yang spesifik dapat menunjukkan sebuah mutasi dengan memiliki suatu

pola yang berbeda (panjang yang berbeda dari fragmen DNA pada Southern blotting

sehubungan dengan perbedaan sekuensi). Perbedaan-perbedaan dalam sekuensi DNA ini

disebut polimorfisme panjang fragmen restriksi (polimorfisme nukleotida-tunggal), atau

hanya polimorfisme, biasanya suatu variasi jinak. Ini adalah variasi-variasi umum;

genom manusia mengandung sekitar 10 juta polimorfisme, dan lebih dari 3 juta telah

diidentifikasi. Sebuah polimorfisme dapat berperan sebagai penanda genetic bagi gen

yang penting secara medis. Suatu polimorfisme diatur oleh regulasi pewarisan ala

Mendel, dan jika ternyata suatu polimorfisme teridentifikasi pada seorang pasien dengan

penyakit spesifik, maka transmisi penyakitnya dapat dipelajari. Polimorfisme, yang

dikaitkan dengan penyakit by chance, dapat digunakan untuk mempelajari pewarisan

suatu penyakit ketika gen-gen nya tidak diketahui. Polimorfisme adalah seperti sebuah

bendera yang menandai area-area kromosom spesifik. Metode studi ini membutuhkan

DNA dari sekurang-kurangnya satu individu yang terkena dan jumlah anggota keluarga

yang cukup untuk melacak polimorfisme, baik dengan Southern blotting (untuk

sekuensi-sekuensi panjang) atau dengan polymerase chain reaction (terbaik untuk

sekuensi-sekuensi pendek). Korelasi penanda-penanda genetik (polimorfisme) dan

fenotipe juga memakai haplotypes (serupa dengan suatu polimorfisme namun sekuensi

nukleotida yang lebih panjang, bahkan satu set dari beberapa polimorfisme).

Minisatellites adalah satu bentuk polimorfisme. Gen-gen berkonsentrasi pada area-area

acak sepanjang kromosom yang dipisahkan oleh sekuensi-sekuensi panjang DNA

nonkoding. Minisatellites adalah area-area nonkoding DNA yang berulang dalam jumlah

yang bervariasi, yang disebut tandem repeat sequences, didistribusikan sepanjang setiap

kromosom manusia. Area-area ini dapat diikuti oleh probes DNA, dengan menyediakan

“fingerprint” bagi individu-individu spesifik. Keunikan ini diaplikasikan dalam

kedokteran forensic. Microsatellites, sebagaimana arti namanya, adalah lebih kecil dari

minisatellites. Biasanya, microsatellites terdiri atas pengulangan hanya dua nukleotida.

Polimorfisme DNA sekarang berjumlah ribuan dan memungkinkan pemetaan genetic

dengan presisi yang hebat.

Proyek Genom Manusia

21

Semua gen manusia secara kolektif dikenal dengan genom. Dimulai pada tahun 1990,

tujuan dari Human Genome Project internasional adalah untuk mensekuensi 3,2 miliar

base pairs genom manusia, satu tujuan yang dicapai dalam bentuk draft pada tahun 2001

dan 99% sekuensi actual pada tahun 2003, lebih dari dua tahun lebih cepat daripada

jadwal, 50 tahun setelah publikasi Watson dan Crick. Jumlah gen (30.000 sampai

35.000) adalah lebih kecil daripada estimasi sebelumnya. Kurang dari 2% genom

manusia memberi kode untuk protein; oleh karena itu, sisanya adalah sumber daya yang

kaya untuk ahli sejarah evolusi dan sebuah target untuk menginduksi perubahan

genetika. Jumlah gen pada kromosom spesifik bervariasi; kromosom yang dipengaruhi

oleh trisomi, kromosom 13, 18, dan 21, memiliki gen paling sedikit. Sekuensi DNA dari

genom manusia tersedia untuk diunduh:

www.ncbi.nlm.nih/gov/genome/guide/human

Peta kaitan genetik dapat berperan sebagai suatu fondasi bagi pencarian lokasi penyakit

dan untuk mengintegrasi sekuensi genetic dengan fungsi-fungsi biologis. Segera, kita

akan mampu memiliki CD pribadi yang mengandung cetak biru genetik komplit

individual.

Departemen Energi Amerika Serikat memelihara sebuah Web site yang memberikan

informasi dasar dan links yang berguna ke situs-situs lainnya mengenai proyek genom

manusia:

http://www.ornl.gov/techresources/human_genome/publicat/publictions.html

lokasi-lokasi kromosom dari gen-gen yang bertanggung jawab untuk produksi hormon

dengan cepat dipetakan. Dari sekuensi DNA yang dikloning, sekuensi-sekuensi asam

amino dapat diprediksi. Setiap produk protein dari sebuah gen mencerminkan target

diagnostic atau terapeutik yang potensial. Dan tentu saja, gangguan-gangguan yang

diturunkan akan menjadi subjek karakterisasi dan, akhirnya, terapi gen. Namun

demikian, bahkan setelah satu gen telah teridentifikasi dan dipetakan secara genetis,

karakterisasi penuh masih merupakan tugas yang sulit dan memakan waktu. Pemahaman

penuh akan gangguan-gangguan yang melibatkan interaksi-interaksi gen-gen multipel

akan menjadi bahkan lebih rumit.

22

Namun kemajuan molekuler adalah tidak terelakkan. Masa depan akan melihat

kedokteran pencegahan dengan prediksi. Dengan mengetahui konstitusi genetic individu,

maka skrining yang sesuai dan intensif dapat diarahkan bagi kondisi-kondisi yang

berpredisposisi. Pengetahuan macam ini akan juga membutuhkan pertimbangan sosial

dan politik. Bukan hal yang jauh untuk melihat perkawinan dan kehamilan dihindari

karena pertemuan predisposisi genetic yang buruk. Masyarakat sedang mengembangkan

pedoman mengenai penggunaan informasi ini: oleh individu, oleh para pemilik usaha,

oleh organisasi kesehatan, dan oleh pemerintah. Kemajuan ilmiah harus bersesuaian

dengan pendidikan public dan professional untuk secara tepat mengelola pengetahuan

ini.

Genomics dan Proteomics

Genomics merujuk pada seluruh proses yang terlibat dalam Human Genome Project,

deskripsi komplit dari sekuensi genetic, dan ini kemudian mengindikasikan studi

ekspresi gen, khususnya dengan menggunakan teknik microarray dengan gene chips.

Namun, genomics tidak akan menceritakan keseluruhan kisah. Produk-produk protein

dari ekspresi gen diubah dalam proses translasi dan juga oleh modifikasi-modifikasi

pascatranslasi seperti glycosylation, methylation, dan phosphorylation. Oleh karena itu,

kisah lengkapnya, membutuhkan proteomics, studi produk-produk akhir fungsional

secara biologis, protein-protein dari suatu sel atau suatu jaringan. Baik genomics maupun

proteomics dibutuhkan untuk memahami fisiologi, mendiagnosis penyakit, dan untuk

desainobat-obat baru. Identifikasi protein membutuhkan pemisahan protein-protein

dengan elektroforesis, pencernaan protein-protein besar menjadi protein-protein yang

lebih kecil, pengukuran kandungan asam amino oleh spektrofotometri massa, dan

identifikasi khusus protein-protein dengan perbandingan dengan databases

terkomputerisasi. Profil-profil massa protein sel-sel normal dan abnormal kemudian

dapat dibandingkan.

... Aplikasi

Tantangan bagi kedokteran modern adalah untuk memahami banyaknya koleksi data

yang dihasilkan oleh proyek genom. Dengan memahami fungsi gen dan protein akan

menjadi gambaran pengakselerasi kemajuan manusia.

23

Diagnosis molekuler kelainan-kelainan genetic membutuhkan hanya sampel DNA yang

kecil, yang didapat dari sel apapun yang berinti, seperti sel-sel darah putih atau sel-sel

epitel. Polymerase chain reaction yang dilaksanakan oleh mesin otomatis

memungkinkan diagnosis DNA yang cepat dengan material yang diamplifikasi dari

sebuah sel tunggal. Ini adalah keunggulan yang penting dalam hal analisis genetika pra

natal dan dalam hal diagnosis dan pemilihan jenis kelamin sebelum implantasi. PCR

memungkinkan untuk melaksanakan diagnosis DNA dari sebuah sel tunggal yang

dikeluarkan dari embrio-embrio yang difertilisasi secara in vitro.

Diagnosis molekuler terbatas oleh prevalensi perubahan genetic heterogen. Dengan kata

lain, banyak gangguan melibatkan mutasi-mutasi yang berbeda pada orang-orang yang

berbeda. Sebaliknya, beberapa (seperti penyakit sickle cell) selalu melibatkan perubahan

yang sama. Dengan kistik fibrosis, 70% pasien (keturunan Eropa utara) memiliki

penghilangan 3-basa yang sama, sedangkan sisanya 30% memiliki koleksi mutasi yang

sangat heterogen. Diagnosis molekuler selanjutnya ditantang oleh kebutuhan tidak hanya

untuk menemukan perubahan yang tersamar pada suatu gen namun juga untuk

membedakan perubahan-perubahan penting dari variasi-variasi yang jinak

(polimorfisme). Metode-metode berbasis-PCR ingenious telah dikembangkan untuk

skrining dan deteksi mutasi yang cepat. Makna penting mutasi-mutasi yang terdeteksi

membutuhkan segregasi mutasi dengan suatu penyakit yang teridentifikasi dalam sebuah

keluarga.

Sekurang-kurangnya satu jenis defisiensi hormon pertumbuhan diwariskan dalam pola

resesif-otosomal. Kloning DNA hormon pertumbuhan yang komplementer terhadap

messenger RNA nya memungkinkan lokalisasi gen hormon pertumbuhan. Gen hormon

pertumbuhan adalah dalam sebuah cluster yang juga mencakup gen untuk laktogen

plasenta manusia. Cluster gen-gen ini mengandung beragam unit DNA yang homolog

dan tunduk pada rekombinasi, yang mengakibatkan penghilangan pada satu kromosom

dan duplikasi pada lainnya. mekanisme serupa bekerja untuk produk-produk protein lain

yang diatur oleh gen-gen dalam cluster, seperti globin.

Produksi komersial protein-protein dari gen-gen yang dikloning yang diinsersikan ke

dalam bakteri cepat meningkat. Produksi insulin (pertama) dan hormon pertumbuhan

adalah contoh-contoh yang baik. Glikosilasi tidak terjadi pada sistem bacterial, dan

24

kareanya produksi komersial glikoprotein-glikiprotein rekombinan membutuhkan jalur

sel mamalia untuk prosesnya. Ini telah dicapai, dan gonadotropin-gonadotropin

rekombinan saat ini tersedia. Gen untuk hormon pelepas-gonadotropin pada lengan

pendek kromosom 8 telah diisolasi dan dikloning. Teknologi molekuler adalah penting

dalam karakterisasi inhibin, hormon folikuler ovarium yang menginhibisi sekresi follicle

stimulating hormone (FSH). Gen inhibin telah disekuensi dan ditemukan homolog

dengan gen untuk hormon antimullerian. Subunit-alfa yang umum untuk gonadotropin,

hormon penstimulasi-tiroid, dan human chorionic gonadotropin (hCG) telah dilacak ke

sebuah gen yang telah diisolasi, disekuensi, dan dilokalisasi pada kromosom 6.

Insersi suatu gen asing ke dalam embrio menghasilkan hewan yang transgenik. Gen

asing yang diinsersikan akan ada dalam banyak jaringan, dan jika hewan ini fertile, ia

akan diwariskan. Terdapat banyak aplikasi untuk hewan-hewan transgenic. Hewan-

hewan transgenik memberikan model-model hewan untuk penyakit-penyakit yang

diwariskan dan tumor-tumor ganas serta memberikan suatu cara untuk melaksanakan

eskperimen dalam terapi gen. Transfer gen-gen baru atau yang berubah adalah suatu

metode penting untuk mempelajari fungsi gen. Tanaman-tanaman transgenic bahkan

dapat dikembangkan untuk menghasilkan obat-obat baru, dan introduksi gen-gen yang

conferring resistensi terhadap insekta mungkin memecahkan masalah kontaminasi

insektisida.

Genom manusia mengandung banyak gen dengan potensi menyebabkan kanker. Gen-gen

lain memiliki kemampuan untuk memblok pertumbuhan keganasan. Kanker adalah

penyakit genetika yang pada mana tumor-tumor dapat dikatakan sebagai klonal; semua

sel terkait secara genetika. Oncogenes, ditemukan dalam virus-virus tumor, adalah gen-

gen yang mentransformasi sel-sel dari pertumbuhan normal ke abnormal dengan cara

melakukan koding protein-protein yang terlibat dalam transduksi signal, secara spesifik

transmisi pesan-pesan pengatur-pertumbuhan. Terdapat banyak oncogen dan banyak

jalur aksi yang berbeda-beda, yang semuanya menghasilkan status proliferative. Mutasi-

mutasi yang mengaktivasi gen-gen ini mendorong pada aktivitas protein yang

independen akan signal-signal yang datang atau pada aktivitas di tempat salah di waktu

yang salah. Garis dasarnya adalah dimulainya pertumbuhan yang persisten (oleh

oncogene yang berubah).

25

Terdapat pula antioncogene pada sel-sel normal, gen-gen yang mensupresi pertumbuhan

yang harus diinaktivasi sebelum tumor dapat bertumbuh. Kerentanan terhadap kanker

yang diwariskan dapat juga dihasilkan oleh mutasi pada gen-gen supresor tumor.

Meskipun aktivasi sebuah oncogene adalah efek yang dominan, mutasi-mutasi supresor

tumor adalah resesif dan dapat dibawa dan ditransmisikan, namun tidak aktif selama

pasang-pasangan terjadi dengan suatu antioncogene normal.

Oleh karena itu, kanker adalah suatu penyakit genetika, namun regulasi pertumbuhan

normal melibatkan suatu sistem kompleks yang memakan waktu lama untuk diatasi.

Selama periode waktu ini, teknologi DNA rekombinan mungkin dapat mencapai

diagnosis yang cukup dini untuk menghasilkan penyembuhan. Dengan mengetahui

oncogene spesifik yang terlibat dalam suatu tumor tertentu juga menawarkan

kemungkinan terapeutik. Sebagai contoh, sebuah antimetabolit dapat dilekatkan ke

antibodi untuk sebuah oncogene, yang menargetkan sel-sel kanker.

Biologi molekuler sedang mengalami perubahan baik diagnosis maupun terapi. DNA

virus dan bakteri dapat diidentifikasi. Proses PCR otomatis dapat menghasilkan pola-

pola elektroforesis yang dapat dibaca secara otomatis. Denga teknik ini, sebuah molekul

DNA human papillomavirus tunggal dapat dideteksi di antara 10.000 atau lebih sel-sel

manusia. Beberapa ratus tes genetika saat ini digunakan di klinis.

Produksi protein endogen yang salah dapat dikoreksi dengan cara menggantikan

mekanisme yang problematic. Terdapat dua strategi: sel-sel asing yang memproduksi

protein yang hilang dapat diintroduksi, atau gen yang salah dapat digantikan (atau lebih

akurat, menambahkan DNA terkoreksi komplementer). Oleh sebab itu, gangguan-

gangguan gen tunggal resesif berpotensi untuk terapi gen, dan juga penyakit-penyakit

yang didapat seperti kanker dan infeksi. Terapi gen secara luas didefinisikan sebagai the

enlistment mesin seluler pasien sendiri untuk menghasilkan bahan terapeutik. Sebuah gen

yang dimasukkan ke dalam sel dapat menggantikan gen yang rusak atau hilang ataupun

menghasilkan protein dengan efek yang diharapkan. Namun, ini adalah bidang ilmu yang

masih dalam tahap bayi.

Pedoman khusus untuk terapi gen telah dikembangkan yang membutuhkan beberapa

tingkat kajian ulang. Satu kelas terapi manusia adalah penggunaan vektor-vektor

retrovirus untuk mentransfer gen-gen penanda ke dalam sel-sel manusia yang dikultur

26

yang dikembalikan ke pasien asalnya. Sebagai contoh, ini memungkinkan pelacakan

limfosit-limfosit yang menginfiltrasi tumor, hepatosit-hepatosit donor, atau sel-sel T

killer yang spesifik untuk human immunodeficiency virus. Gen-gen yang ditransfer ini

dapat juga di crafted untuk menyediakan fungsi pada pasien-pasien dengan gangguan-

gangguan yang diwariskan gen-tunggal. Kelas terapi lainya melibatkan transfer gen yang

memberi kode untuk faktor-faktor yang menghancurkan sel-sel tumor, seperti tumor

necrosis factor atau interleukin. Vektor-vektor retrovirus adalah virus-virus yang telah

diubah sehingga tidak ada protein virus yang dapat dibuat oleh sel-sel yang diinfeksi oleh

vektor. Oleh karenanya, replikasi dan penyebaran virus dicegah, namun transfer gen ke

dalam sel-sel yang bereplikasi dapat terjadi. Metode-metode transfer lainnya yang

sedang dikembangkan mencakup penggunaan vektor-vektor adenovirus dan secara

khusus DNA plasmid yang ditargetkan.