Home > Documents > Cara Pengawetan Fungi

Cara Pengawetan Fungi

Date post: 10-Feb-2018
Category:
Author: yulis-adriana
View: 217 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
Embed Size (px)
of 43 /43
Cara Pengawetan dan Penyimpanan Biakan Fungi Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung
Transcript
  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    1/43

    CaraPengawetandanPenyimpanan

    BiakanFungi

    Marlia Singgih Wibowo

    School of Pharmacy

    Institut Teknologi Bandung

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    2/43

    Outline

    Prinsip Umum

    Teknik Pengawetan (Preservation)

    Keuntungan dan Kerugian

    Pemilihan Metode

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    3/43

    PrinsipUmum

    Tujuan utamamemelihara biakan

    suatu fungus adalah

    untuk menjaga galur

    fungus tersebut di

    dalam suatu media

    tanpa terjadi nya

    perubahan morfologi,fisiologi, atau genetik

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    4/43

    PrinsipUmum

    Organisme dapat

    berasal dari

    berbagai sumber

    Contoh :

    Penicillium

    digitatum

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    5/43

    PrinsipUmum

    Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat

    dengan mengurangi kecepatan metabolismeatau bahkan dapat menunda metabolismemikroorganisme

    Pengawetan yang baik bila digunakan biakan

    yang sehat dan kondisi pertumbuhan yangoptimum

    Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dankondisi yang berbeda-beda

    Beberapa diantaranya memiliki spesifisitastertentu sebagai syarat pertumbuhannya

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    6/43

    PrinsipUmum

    UmumnyaMikroorganisme

    tumbuh baik dalam

    media yang dibuat

    mendekati kondisilingkungan tempat

    asalnya

    Contoh : tanah,bagian tanaman atau

    komponen air, dll.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    7/43

    Pertumbuhan

    Mikroorganisme Media pertumbuhan dapat bervariasi.

    Misalnya Raper & Thom (1949)

    menggunakan Czapek's Agar, Steep Agarand Malt Extract Agar untuk pertumbuhanPenicillia danAspergilli

    Pitt (1980) menganjurkan penggunaan

    recommends Czapek Yeast Autolysate (CYA)dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia

    Standarisasi of formula media pentingdilakukan

    Media akan mempengaruhi morfologi danwarna koloni, karena kandungan media akanmempengaruhi pembentukan senyawa

    tertentu atau menginduksi sifat tertentu darimikroorganisme

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    8/43

    Pertumbuhan

    Pengaruh Media terhadap morfologi koloni

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    9/43

    Kontaminasipada

    kultur

    fungi

    Biakan Fungi sering terkontaminasi olehTyroglyphus orTarsonemus

    Di alam banyak terdapat pada tanah, danhampir semua bahan organik

    Terbawa ke laboratorium dari bahan

    tanaman, produk yang sudah kadaluarsa,pada sepatu, serangga atau biakanmikroorganisme lain.

    Cepat berkembang biak dalam keadaan

    lembab dan suhu ruang Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat di

    simpan

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    10/43

    Pencegahan

    Kontaminasi Melakukan pekerjaan sesuai prosedur Menjaga kebersihan dan kesehatan diri Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    11/43

    Metodepencegahankontaminasi

    Hygiene

    Bersihkan seluruh permukaan dan hindari

    biakan dari udara luar dan debu Cuci peralatan dengan desinfektan yang

    sesuai.

    Fumigation Digunakan selang waktu tertentu untuk ruanglaboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harusdilakukan oleh yang berwenang

    Mechanical and chemical barriers Universal bottles, kapas lemak, tube

    bersumbat

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    12/43

    Metodepencegahan

    kontaminasi

    Tempat penyimpanan yang aman

    Lemari pendingin 4-8C Lemari penyimpanan deep freeze (< -

    20C)

    Menutup kultur dengan minyak mineral

    Simpan dengan silica gel

    Freeze-dry

    Simpan di ultra-low temperatures case

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    13/43

    Pengawetandan

    Penyimpanan

    Continuous culture

    Pada media padat atau cair

    Refrigeration

    Di bawah lapisan minyak mineralDi dalam air

    Pengeringan

    Freeze drying

    Cryopreservation

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    14/43

    PengawetandanPenyimpanan

    Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan

    sebagai seed stock

    Simpan satu biakan sebagai cadangan

    Setelah pengawetan, viability, purity, dan

    identitas harus di cek ulang dan dibandingkan

    dengan data aslinya atau referensi

    Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan

    biokimia harus diuji

    Semua pengamatan harus dicatat dan

    disimpan untuk referensi di masa yad.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    15/43

    Metode

    Pengawetan

    mikroorganismePenumbuhan pada agar miring

    Metode yang paling mudah dan murah

    Disimpan di dalam lemari pendingin

    dapat membantu mengurangi frekuensi

    sub-kultur

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    16/43

    Metodepengawetanmikroorganisme

    Kerugian metode sub-kultur pd agar

    Kemungkinan terjadi variasi genetikakibat pemindahan berulang, hilangnya

    sifat patogenitas atau karakteristik

    fisiologi dan morfologi lainnya Kemungkinan kontaminasi besar

    Memerlukan pengawasan yang ketat

    supaya biakan tidak tertukar atau

    terkontaminasi

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    17/43

    PengawetandanPenyimpanan

    Keuntungan metode sub-kultur pada agar :

    Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktucukup lama dibawah pengawasan ahlinya.

    Metodenya cukup murah dan tidakmemerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah

    koleksi yang sedikit, metode ini cukupmenguntungkan

    Penumbuhan mudah karena tidak perluwaktu adaptasi yang lama.

    Periode pemindahan : 2 4 minggu atau2 4 bulan

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    18/43

    Dibawahminyakmineral

    Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles laludituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegahdehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme danpertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    19/43

    PengawetandenganMinyakmineral

    Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell &Weston (1947)

    Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10mm minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinalparaffin dengan specific gravity 0.830-0.890).

    Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada121C selama 15 menit

    Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengancara mengambil sejumlah koloni dengan jarum

    biakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin. Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengah

    kadangkala memberikan hasil yang lebih baiksehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudahmelalui slope

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    20/43

    PengawetandalamMinyakmineral

    Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral : Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara

    Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval

    Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisiyang tidak nyaman dapat mengarah padamutasi

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    21/43

    PengawetandalamMinyakmineral

    Keuntungan :

    Peralatan murah dan pengerjaan mudah Beberapa mikroorganisme hanya dapat

    disimpan di dalam minyak mineral

    Namun penyimpanan di bawah minyak mineraldisarankan untuk laboratorium yang memiliki

    keterbatasan sumbar daya dan fasilitas

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    22/43

    PenyimpanandalamairPotongan agar atau suspensi spora dapat disimpan dalam air

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    23/43

    PenyimpanandalamairCara :

    1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dariujung pertumbuhan koloni jamur

    2. Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril

    di dalam botol McCartney dan tutup erat , laludisimpan pada suhu 20-25C.

    3. Peremajaan dilakukan dengan mengambilpotongan agar tsb, tempatkan terbalik pada

    medium pertumbuhan yang sesuai

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    24/43

    Penyimpanandalamair Jangka waktu penyimpanan dapat

    mencapai 2-3 tahun , misalnya untukspesies of Phytophthora dan Pythium

    tanpa adanya perubahan fisik

    (Onions & Smith, 1984).

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    25/43

    Penyimpanandalam

    air

    Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939,1967) yang menyimpan fungi yang patogen

    thp manusia Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogentanaman tanpa kehilangan patogenitasnya.

    Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan

    penyimpanan dalam air bisa mencapai 10years

    Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogena.l. Oomycota,Ascomycota, Basidiomycotadan mitotic fungi selama 7 tahun.

    Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales,Pyrenomycetes, Hymenomycetes,

    Gasteromycetes dan Hyphomycetes

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    26/43

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    27/43

    Responseofcellstofreezing. Slowcool:cellscanmaintaingosmosticequilibriumbywaterefflux;thuscellsshrinkandonlyextracellulariceforms. Rapidcool:cellscannotlosewaterrapidlyenoughtomaintainosmoticequilibrium;thuscellsshrinkslightlyandcontainafewlargeice

    crystals.

    Very

    rapid

    cool:

    cellscontain

    a

    large

    number

    of

    small

    ice

    crystals.

    SLOW

    COOL

    RAPID

    COOL

    VERY

    RAPID

    COOL

    -2OC

    -5OC

    < -

    10OC

    What happens to a cell

    when it freezes?

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    28/43

    Penyimpanandalam

    Silica

    Gel

    Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun

    C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungilebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins

    (1962), semua galur terbukti stabil.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    29/43

    PenyimpanandalamSilicaGel

    Cara :

    1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dansterilkan dengan dry heat (180C selama 3 jam).

    2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal- 20C).

    3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yang

    telah didinginkan.4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica geldan goyangkan agar tercampur homogen.

    5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada25C sampai silica gel crystals mengering dan siap untukdipisahkan.

    6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4C dalam wadahkedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsilembab.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    30/43

    PenyimpanandalamSilicagel

    Banyak fungi yang tahan lama denganmetode ini (Perkins, 1962; Ogata, 1962;

    Onions, 1977; Smith & Onions, 1983). Spora yang berdinding tipis cenderung tidak

    dapat bertahan.

    Keberhasilannya tergantung biakan yangsehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dariperbedaan biakan dari setiap isolat.

    Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freeze-

    drying tidak tersedia, walaupun ada bbrpfungi yang tidak dapat bertahan lama dgncara ini.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    31/43

    PenyimpanandalamSilicaGel

    Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa

    kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    32/43

    Penyimpanandalam

    Silica

    Gel

    Kekurangan cara silica gel :

    Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidaksesuai untuk Pythium, Phytophthora dan

    beberapa Oomycota, juga beberapa fungi

    bermiselium yang memiliki spora yangkompleks.

    Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukup

    besar setelah beberapa kali peremajaan.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    33/43

    Penyimpanan

    dalam

    Silica

    Gel

    Keuntungan cara silica gel :

    Murah dan sederhana Menghasilkan biakan yang stabil untuk

    banyak sporulating fungi termasukBasidiomycota.

    Kontaminasi dari bakteri dapat dihindarikarena kondisi yang kering

    Peremajaan inokulum dapat dilakukan

    dengan mengmbil beberapa butir dari satubotol, walaupun disarankan tetapmemisahkan biakan stock dari biakan kerja.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    34/43

    Penyimpanan

    dalam

    tanah

    Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15 min)

    sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi sporadalam air steril

    Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantungpada laju pertumbuhan fungi

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    35/43

    Penyimpanandalam

    tanah

    Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971)

    Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria,Aspergillus, Circinella danPenicillium.

    Patogenitas Septoria dari sereal setelah 20 bulantetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan jugaPseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke &Fokkema, 1979).

    Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolatFusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F.acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971).

    Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakanuntuk Fusarium dibandingkan di dalam minyakkarena adanya perubahan (variasi) terjadi dalamminyak.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    36/43

    Penyimpanandalam

    tanah

    Keuntungan :

    Biakan dapat bertahan sampai 10tahun.

    Peremajaan berulang dapat dilakukan

    dari sampel yang sama, walaupun

    sebaiknya stok harus ditempatkan

    terpisah. Biaya murah dan alat sederhana

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    37/43

    Penyimpanandalam

    tanah

    Kerugian :

    Kemungkinan terjadi variasi genetik

    Beberapa fungi tidak dapat tahan di

    desikasi Kemungkinan kontaminasi lebih besar

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    38/43

    Oomycota Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair

    dengan kecepatan pendinginan 10C min-1,walaupun beberapa galur tidak dapat disimpandengan cara ini.

    Di bawah minyak mineral dapat disimpan

    sampai 6 bulan Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40tahun (laporan dari CABI-UK)

    Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu di

    transfer setiap 2 tahun

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    39/43

    Zygomycota

    Nitrogen cair sangat disarankan untuk

    penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genuslainnya

    Dapat pula dengan cara freeze-dried

    Tidak semua genus tahan proses dehidrasi,terutama dengan silica gel, misalnyaCoemansia, Martensiomyces, Condiobolus,Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites.

    Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis danCoemansia yang dapat di freeze dried.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    40/43

    Basidiomycota

    Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi

    demikian hanya dapat disimpan dengan caratransfer regular pada agar dengan atau tanpaminyak, atau disimpan di nitrogen cair.

    Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang

    tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukarditumbuhkan kembali

    Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang

    tumbuh di alam, dapat di freeze-dried

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    41/43

    FungiDeuteromycota

    Fungi yang ber konidia reltif mudah di

    simpan Freeze-drying adalah teknik yang paling

    tepat.

    Aspergillus, Penicillium and Paecilomycesdapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai2 tahun pada agar miring pada -18C.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    42/43

    Ragi

    Ragi (single celled vegetative yeasts)

    dapat disimpan dengan cara freeze-drying.

    Kebanyakan spesies dapat tahan

    disimpan dalam silica gel namun sukarditumbuhkan kembali

    Liquid nitrogen adalah cara yang paling

    baik.

  • 7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

    43/43

    Rangkumane o os a y ongev y

    Cryopreservationbelow 130

    oC

    High Excellent >10 000years

    Freeze-drying High Little change

    reported

    4-40 years

    Silica gel Low Little changereported

    5-20 years

    Water Low Variation linkedto storage time

    2-7 years

    Soil Low Variationcommon 5-20 years

    Oil Low Changeexpected withtime

    1-50 years

    Growth 18-22oC Low-Medium Change

    expected with

    time

    2 weeks to6 months

    Growth 4-7oC Medium Change

    expected withtime

    6-12months


Recommended