Cara Pengawetan Fungi

7/22/2019 Cara Pengawetan Fungi

http://slidepdf.com/reader/full/cara-pengawetan-fungi 1/43

Cara Pengawetan dan Penyimpanan

Biakan Fungi

Marlia Singgih Wibowo

School of Pharmacy

Institut Teknologi Bandung



Outline

• Prinsip Umum

• Teknik Pengawetan (Preservation)

• Keuntungan dan Kerugian

• Pemilihan Metode



Prinsip Umum

Tujuan utamamemelihara biakan

suatu fungus adalah

untuk menjaga galur

fungus tersebut di

dalam suatu media

tanpa terjadi nya

perubahan morfologi,fisiologi, atau genetik



Prinsip Umum

• Organisme dapat

berasal dari

berbagai sumber

• Contoh :

Penicillium

digitatum



Prinsip Umum

• Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat

dengan mengurangi kecepatan metabolismeatau bahkan dapat menunda metabolismemikroorganisme

• Pengawetan yang baik bila digunakan biakan

yang sehat dan kondisi pertumbuhan yangoptimum

• Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dankondisi yang berbeda-beda

• Beberapa diantaranya memiliki spesifisitastertentu sebagai syarat pertumbuhannya



Prinsip Umum

• UmumnyaMikroorganisme

tumbuh baik dalam

media yang dibuat

mendekati kondisilingkungan tempat

asalnya

• Contoh : tanah,bagian tanaman atau

komponen air, dll.



Pertumbuhan

Mikroorganisme• Media pertumbuhan dapat bervariasi.

Misalnya Raper & Thom (1949)

menggunakan Czapek's Agar, Steep Agarand Malt Extract Agar untuk pertumbuhanPenicillia dan Aspergilli

• Pitt (1980) menganjurkan penggunaan

recommends Czapek Yeast Autolysate (CYA)dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia

• Standarisasi of formula media pentingdilakukan

• Media akan mempengaruhi morfologi danwarna koloni, karena kandungan media akanmempengaruhi pembentukan senyawa

tertentu atau menginduksi sifat tertentu darimikroorganisme



Pertumbuhan

Pengaruh Media terhadap morfologi koloni



Kontaminasi pada

kultur

fungi

• Biakan Fungi sering terkontaminasi olehTyroglyphus or Tarsonemus

• Di alam banyak terdapat pada tanah, danhampir semua bahan organik

• Terbawa ke laboratorium dari bahan

tanaman, produk yang sudah kadaluarsa,pada sepatu, serangga atau biakanmikroorganisme lain.

• Cepat berkembang biak dalam keadaan

lembab dan suhu ruang• Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat di

simpan



Pencegahan

Kontaminasi• Melakukan pekerjaan sesuai prosedur • Menjaga kebersihan dan kesehatan diri• Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium• Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur



Metode pencegahan kontaminasi

Hygiene

• Bersihkan seluruh permukaan dan hindari

biakan dari udara luar dan debu• Cuci peralatan dengan desinfektan yang

sesuai.

Fumigation• Digunakan selang waktu tertentu untuk ruanglaboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harusdilakukan oleh yang berwenang

Mechanical and chemical barriers• Universal bottles, kapas lemak, tube

bersumbat



Metode pencegahan

kontaminasi

• Tempat penyimpanan yang aman

• Lemari pendingin 4-8°C• Lemari penyimpanan “deep freeze” (< -

20°C)

• Menutup kultur dengan minyak mineral

• Simpan dengan silica gel

• Freeze-dry

• Simpan di ultra-low temperatures case



Pengawetan dan

Penyimpanan

• Continuous culture

Pada media padat atau cair

Refrigeration

Di bawah lapisan minyak mineralDi dalam air

• Pengeringan

• Freeze drying

• Cryopreservation



Pengawetan dan Penyimpanan

• Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan

sebagai seed stock

• Simpan satu biakan sebagai cadangan

• Setelah pengawetan, viability, purity, dan

identitas harus di cek ulang dan dibandingkan

dengan data aslinya atau referensi

• Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan

biokimia harus diuji

• Semua pengamatan harus dicatat dan

disimpan untuk referensi di masa yad.



Metode

Pengawetan

mikroorganismePenumbuhan pada agar miring

• Metode yang paling mudah dan murah

• Disimpan di dalam lemari pendingin

dapat membantu mengurangi frekuensi

sub-kultur



Metode pengawetan mikroorganisme

Kerugian metode sub-kultur pd agar

• Kemungkinan terjadi variasi genetikakibat pemindahan berulang, hilangnya

sifat patogenitas atau karakteristik

fisiologi dan morfologi lainnya• Kemungkinan kontaminasi besar

• Memerlukan pengawasan yang ketat

supaya biakan tidak tertukar atau

terkontaminasi



Pengawetan dan Penyimpanan

Keuntungan metode sub-kultur pada agar :

• Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktucukup lama dibawah pengawasan ahlinya.

• Metodenya cukup murah dan tidakmemerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah

koleksi yang sedikit, metode ini cukupmenguntungkan

• Penumbuhan mudah karena tidak perluwaktu adaptasi yang lama.

• Periode pemindahan : 2 – 4 minggu atau2 – 4 bulan



Di bawah minyak mineral

Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles laludituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegahdehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme danpertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen



Pengawetan dengan Minyak mineral

• Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell &Weston (1947)

• Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10mm minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinalparaffin dengan specific gravity 0.830-0.890).

• Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada121°C selama 15 menit

• Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengancara mengambil sejumlah koloni dengan jarum

biakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin.• Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengah

kadangkala memberikan hasil yang lebih baiksehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudahmelalui slope



Pengawetan dalam Minyak mineral

Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral :• Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara

• Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval

• Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisiyang tidak nyaman dapat mengarah padamutasi



Pengawetan dalam Minyak mineral

Keuntungan :

• Peralatan murah dan pengerjaan mudah• Beberapa mikroorganisme hanya dapat

disimpan di dalam minyak mineral

• Namun penyimpanan di bawah minyak mineraldisarankan untuk laboratorium yang memiliki

keterbatasan sumbar daya dan fasilitas



Penyimpanan dalam air

Potongan agar atau suspensi spora dapat disimpan dalam air



Penyimpanan dalam airCara :

1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dariujung pertumbuhan koloni jamur

2. Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril

di dalam botol McCartney dan tutup erat , laludisimpan pada suhu 20-25°C.

3. Peremajaan dilakukan dengan mengambilpotongan agar tsb, tempatkan terbalik pada

medium pertumbuhan yang sesuai



Penyimpanan dalam air

• Jangka waktu penyimpanan dapat

mencapai 2-3 tahun , misalnya untukspesies of Phytophthora dan Pythium

tanpa adanya perubahan fisik

(Onions & Smith, 1984).



Penyimpanan dalam

air

• Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939,1967) yang menyimpan fungi yang patogen

thp manusia• Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogentanaman tanpa kehilangan patogenitasnya.

• Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan

penyimpanan dalam air bisa mencapai 10years

• Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogena.l. Oomycota, Ascomycota, Basidiomycotadan mitotic fungi selama 7 tahun.

• Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales,Pyrenomycetes, Hymenomycetes,

Gasteromycetes dan Hyphomycetes





Response of cells to freezing. Slow cool:

cells can maintaing osmostic equilibrium by water efflux; thus cells shrink and only extracellular ice

forms. Rapid cool: cells cannot lose water rapidly enough to maintain osmotic equilibrium; thus cells shrink slightly and contain a few large ice

crystals.

Very

rapid

cool:

cells contain

a

large

number

of

small

ice

crystals.

SLOW

COOL

RAPID

COOL

VERY

RAPID

COOL

-2OC

-5OC

< -

10OC

What happens to a cell

when it freezes?



Penyimpanan dalam

Silica

Gel

• Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun

• C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungilebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins

(1962), semua galur terbukti stabil.



Penyimpanan dalam Silica Gel

Cara :

1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dansterilkan dengan dry heat (180°C selama 3 jam).

2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal- 20°C).

3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yang

telah didinginkan.4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica geldan goyangkan agar tercampur homogen.

5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada25°C sampai silica gel crystals mengering dan siap untukdipisahkan.

6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4°C dalam wadahkedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsilembab.



Penyimpanan dalam Silica gel

• Banyak fungi yang tahan lama denganmetode ini (Perkins, 1962; Ogata, 1962;

Onions, 1977; Smith & Onions, 1983).• Spora yang berdinding tipis cenderung tidak

dapat bertahan.

• Keberhasilannya tergantung biakan yangsehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dariperbedaan biakan dari setiap isolat.

• Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freeze-

drying tidak tersedia, walaupun ada bbrpfungi yang tidak dapat bertahan lama dgncara ini.



Penyimpanan dalam Silica Gel

Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa

kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai



Penyimpanan dalam

Silica

Gel

Kekurangan cara silica gel :

• Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidaksesuai untuk Pythium, Phytophthora dan

beberapa Oomycota, juga beberapa fungi

bermiselium yang memiliki spora yangkompleks.

• Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukup

besar setelah beberapa kali peremajaan.



Penyimpanan

dalam

Silica

Gel

Keuntungan cara silica gel :

• Murah dan sederhana• Menghasilkan biakan yang stabil untuk

banyak sporulating fungi termasukBasidiomycota.

• Kontaminasi dari bakteri dapat dihindarikarena kondisi yang kering

• Peremajaan inokulum dapat dilakukan

dengan mengmbil beberapa butir dari satubotol, walaupun disarankan tetapmemisahkan biakan stock dari biakan kerja.



Penyimpanan

dalam

tanah

• Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15 min)

sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi sporadalam air steril

• Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantungpada laju pertumbuhan fungi



Penyimpanan dalam

tanah

• Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971)

• Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria, Aspergillus, Circinella dan Penicillium.

• Patogenitas Septoria dari sereal setelah 20 bulantetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan jugaPseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke &Fokkema, 1979).

• Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolatFusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F.acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971).

• Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakanuntuk Fusarium dibandingkan di dalam minyakkarena adanya perubahan (variasi) terjadi dalamminyak.



Penyimpanan dalam

tanah

Keuntungan :

• Biakan dapat bertahan sampai 10tahun.

• Peremajaan berulang dapat dilakukan

dari sampel yang sama, walaupun

sebaiknya stok harus ditempatkan

terpisah.• Biaya murah dan alat sederhana



Penyimpanan dalam

tanah

Kerugian :

• Kemungkinan terjadi variasi genetik

• Beberapa fungi tidak dapat tahan di

desikasi• Kemungkinan kontaminasi lebih besar



Oomycota• Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair

dengan kecepatan pendinginan 10°C min-1,walaupun beberapa galur tidak dapat disimpandengan cara ini.

• Di bawah minyak mineral dapat disimpan

sampai 6 bulan• Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40tahun (laporan dari CABI-UK)

• Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu di

transfer setiap 2 tahun



Zygomycota

• Nitrogen cair sangat disarankan untuk

penyimpanan Mucor , Rhizopus dan genuslainnya

• Dapat pula dengan cara freeze-dried

• Tidak semua genus tahan proses dehidrasi,terutama dengan silica gel, misalnyaCoemansia, Martensiomyces, Condiobolus,Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites.

Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis danCoemansia yang dapat di freeze dried.



Basidiomycota

• Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi

demikian hanya dapat disimpan dengan caratransfer regular pada agar dengan atau tanpaminyak, atau disimpan di nitrogen cair.

• Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang

tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukarditumbuhkan kembali

• Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang

tumbuh di alam, dapat di freeze-dried



Fungi Deuteromycota

• Fungi yang ber konidia reltif mudah di

simpan• Freeze-drying adalah teknik yang paling

tepat.

• Aspergillus, Penicillium and Paecilomycesdapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai2 tahun pada agar miring pada -18°C.



Ragi

• Ragi (single celled vegetative yeasts)

dapat disimpan dengan cara freeze-drying.

• Kebanyakan spesies dapat tahan

disimpan dalam silica gel namun sukar ditumbuhkan kembali

• Liquid nitrogen adalah cara yang paling

baik.



Rangkumane o os a y ongev y

Cryopreservationbelow –130

oC

High Excellent >10 000years

Freeze-drying High Little change

reported

4-40 years

Silica gel Low Little changereported

5-20 years

Water Low Variation linkedto storage time

2-7 years

Soil Low Variationcommon 5-20 years

Oil Low Changeexpected withtime

1-50 years

Growth 18-22 oC Low-Medium Change

expected with

time

2 weeks to6 months

Growth 4-7 oC Medium Change

expected withtime

6-12months

Cara Pengawetan Fungi

Documents