BAHAN DAN METODE · BAHAN DAN METODE . Waktu dan Tempat ... Perlakuan kontrol dan ... persamaan yang diperoleh dari kurva standar asam galakturonat. Kemudian

17

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat

Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong. Penelitian dilakukan dari bulan Maret

2011 – Januari 2012

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian antara lain spektrofotometer UV-Vis

(Shimadzu UV-Pharmaspec 1700), laminar air flow (Sander Lab Type K.5025),

autoklaf (Everlight Model: TA-630), inkubator bergoyang (Thermolyne ROSI

1000TM), penangas air (CV Klaten Engineriing Type F.St.02.2007), vortex (Mixer

Fisher Scientific), sentrifuge (Centrifuge 5415 R dan SORVALL RC 26 PLUS),

hot plate (IKA RH BASIC 2), pH meter (HM-30 G TOA), neraca analitik (Perciso

303 A, dan Sartorius TE 15025), pipet mikro, dan berbagai peralatan gelas yang

umum digunakan dalam laboratorium.

Bahan yang digunakan yaitu isolat Trichoderma spp. koleksi BTCC

(Biotechnology Culture Collection, LIPI), media Potato Dextrosa Agar (PDA),

media Pectin Screening Agar Medium (PSAM), media produksi Trichoderma sp.

yang mengandung substrat pektin (Khairnar et al. 2009), reagen DNS (Asam

dinitrosalisilat) (Phutela et al. 2005), asam galakturonat, daun teh segar dari

perkebunan teh Gunung Mas, PTPN VII Jawa Barat, bahan-bahan kimia terkait

analisis TF, TR, HPS dan TLC (Takeo & Ozawa 1976).

Metode Penelitian

Peremajaan Isolat Trichoderma spp. Peremajaan Trichoderma sp.

dilakukan pada media PDA. Isolat tersebut diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu

ruang.

Uji Kualitatif Isolat Trichoderma sp. Penghasil Enzim Pektinase.

Empat puluh empat isolat koleksi BTCC digunakan sebagai kandidat penghasil

enzim pektinase. Isolat yang akan diseleksi ditumbuhkan pada medium PSAM

dan diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang (Khairnar et al. 2009). Pemilihan

18

awal isolat potensial dilakukan secara kualitatif, berdasarkan kemampuan isolat

mendegradasi pektin. Zona hambat yang terbentuk disekitar koloni ditentukan

dengan Kalium Iodida-Iodin (5,0 g KI dan 1,0 g Iodin dalam 330 mL akuades

steril). Jarak diameter zona bening digunakan untuk menghitung indeks

pektinolitik (IP). Isolat penghasil enzim pektinase tertinggi adalah yang memiliki

nilai indeks pektinolitik terbesar. Isolat ini akan digunakan untuk uji selanjutnya.

Rumus untuk menghitung indeks pektinolitik adalah sebagai berikut:

( ) ( )

( )

Penentuan Waktu Produksi Tertinggi Enzim Pektinase. Isolat

potensial penghasil enzim pektinase kemudian ditentukan waktu produksi

tertinggi dengan menumbuhkan isolat pada medium pertumbuhan yang

mengandung substrat pektin. 1 ose isolat dikultur dalam 20 mL media cair yang

mengandung substrat pektin 1%. Kultur diinkubasi pada suhu 30 0C dengan

kecepatan agitasi 150 rpm. Inokulum tersebut lalu dituang ke dalam 180 mL

media produksi. Pengambilan sampel dilakukan setiap 24 jam selama 11 hari

waktu inkubasi dilakukan.

Supernatan yang dihasilkan kemudian diuji aktivitas enzim pektinase

dengan menggunakan metode Miller tahun 1959 yang dimodifikasi oleh Phutela

et al. (2005). Larutan sampel disentrifugasi pada suhu 4 0C dengan kecepatan

10000 x g selama 10 menit. Sebanyak 0,5 mL substrat (pektin 1%) yang

dilarutkan dalam 0,1 M bufer sitrat pH 5.8, kemudian ditambah dengan 0,5 mL

enzim pektinase, dikocok kuat dengan vortex, selanjutnya diinkubasi selama 30

menit pada suhu ruang. Setelah itu, ditambah dengan 1,5 mL DNS, didihkan

selama 15 menit dan absorbansi diukur pada λ 575 nm. Perlakuan kontrol dan

blanko dilakukan secara bersamaan dengan metode dan tahapan yang sama. Pada

kontrol, enzim yang akan direaksikan dengan substrat telah diinaktivasi terlebih

dahulu dengan memanaskan enzim selama 15 menit dalam air mendidih. Pada

blanko, larutan enzim diganti dengan bufer untuk direaksikan dengan substrat.

Aktivitas enzim diukur pada setiap pengambilan sampel yang dilakukan sehingga

dapat diketahui waktu optimum produksi enzim pektinase.

19

Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam

persamaan yang diperoleh dari kurva standar asam galakturonat. Kemudian

aktivitas pektinase dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut (Phutela et al.

2005).

( ) ( )

Keterangan: Xs = jumlah gula tereduksi sampel

Xk = jumlah gula tereduksi kontrol

P = pengenceran

t = waktu inkubasi

BM = berat molekul asam galakturonat

Aktivitas pektinase dinyatakan dalam U mL-1

. Satu unit merupakan jumlah

enzim yang dibutuhkan untuk memecah 1 µmol pektin menjadi asam galakturonat

permenit pada kondisi pengujian.

Produksi Enzim Pektinase. Produksi enzim pektinase dilakukan

berdasarkan prosedur dan waktu inkubasi yang telah diketahui aktivitas pektinase

tertinggi pada kurva aktivitas pektinase yang dihasilkan. Media produksi

diinkubasi pada suhu ruang di inkubator bergoyang dengan kecepatan agitasi 150

rpm, kemudian enzim pektinase dipanen pada waktu produksi tertinggi yang telah

didapatkan sebelumnya.

Kultur sel pada media produksi yang mengandung enzim pektinase

disentrifugasi pada kecepatan 10.000 x g selama 15 menit untuk memisahkan

larutan enzim dengan pelet. Supernatan hasil sentrifugasi kemudian disimpan

pada suhu 10 0C sebagai enzim ekstrak kasar.

Optimasi Suhu dan pH. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim

dilakukan dengan mereaksikan 0,5 mL enzim dengan 0,5 mL substrat di mana

substrat dibuat dengan mencampurkan 0,5 g pektin dalam bufer sitrat pH 5,8.

Enzim yang telah dicampurkan dengan substrat kemudian diinkubasi pada

tingkatan suhu antara 30 0C sampai dengan 60

0C dengan selang 10

0C selama 30

20

menit waktu inkubasi. Aktivitas enzim pektinase diukur sesuai dengan prosedur

pengujian sebelumnya.

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan menambahkan 0,5 mL

enzim yang direaksikan dengan 0,5 mL substrat. Substrat dibuat dengan

mencampurkan 0,5 g pektin ke dalam bufer dengan berbagai tingkatan pH 4-8,

antara lain yaitu 0,02 M bufer sitrat (4, 5, 6), dan 0,02 M bufer fosfat (7,8).

Masing-masing enzim diinkubasi pada suhu optimum selama 30 menit. Aktivitas

enzim pektinase diukur sesuai dengan prosedur pengujian sebelumnya.

Pemanfaatan Ekstrak Kasar Pektinase dalam Fermentasi Teh. Teh

yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari perkebunan teh di Jawa Barat.

Sampel yang digunakan adalah sampel daun teh segar yang baru dipetik pada hari

yang sama. Hal ini bertujuan untuk mengontrol proses fermentasi. Jika daun teh

sudah tidak segar, kemungkinan proses oksidasi telah terjadi.

Sebanyak 750 g daun teh segar dilayukan pada suhu ruang selama 2-3 jam.

Selain pada suhu ruang, perlakuan pelayuan dengan bantuan matahari juga dapat

dilakukan selama 60 menit dengan kontrol optimal untuk menghindari daun

menjadi kering dan berwarna kecoklatan. Standar daun yang telah mengalami

pelayuan cukup ditandai seperti daun terasa lemas, mudah digulung tetapi tidak

hancur, serta baunya masih segar. Sebanyak 15 g daun yang telah layu kemudian

dicacah dan ditempatkan pada wadah bersih dan steril. Pada tahapan ini

ditambahkan ekstrak kasar enzim pektinase sesuai dengan perlakuan yaitu 0,086

UmL-1

, 0,1723 UmL-1

, dan 0,258 UmL-1

dengan cara disemprotkan secara merata

diatas permukaan daun teh yang telah dicacah. Fermentasi dilakukan selama 60

menit pada suhu ruang. Semua perlakuan fermentasi diulang sebanyak 3 kali.

Untuk kontrol perlakuan, fermentasi daun teh tidak ditambahkan ekstrak kasar

pektinase.

Analisis Parameter Kualitas Teh Hitam: Theaflavin (TF), Tearubigin

(TR), Highly Polymerized Substance (HPS), dan Total Liquor Colour (TLC).

Daun teh hitam yang telah dikeringkan kemudian di analisis parameter

komponennya dengan metode ekstraksi pelarut (Takeo & Ozawa 1976).

Komponen katekin di dalam teh hitam yang diuji adalah teaflavin dan tearubigin,

21

sedangkan nilai total liquor color dan highly polimerized substance mewakili

tampilan warna dari minuman teh yang dihasilkan.

Sebanyak 4 g daun teh hitam kering direbus bersama 200 mL air hingga

mendidih. Larutan kemudian disaring dan hasil saringannya disebut ekstrak teh

hitam. Satu mL ekstrak teh hitam yang dilarutkan dengan 9 mL air adalah nilai

TLC yang dibaca dengan UV Spektrofotometer pada panjang gelombang 460 nm

(A). Untuk nilai TF, TR, dan HPS sebanyak 25 mL ekstrak teh hitam dilarutkan

dengan 25 mL pelarut polar Isobuthyl Methyl Ketone (IBMK). Proses selanjutnya

dilanjutkan dengan ekstraksi menggunakan etanol 45%, Na2HPO4 2,5% serta n-

butanol. Hasil masing-masing diukur pada panjang gelombang 380 nm (B, C, D,

E). Skema ekstraksi daun teh untuk menentukan parameter teh hitam disajikan

lengkap di Lampiran 5.

Parameter TF, TR, HPS, dan TLC dihitung berdasarkan nilai absorbansi

sebagai berikut:

TF (%) : 4,313 x C

TR (%) : 13,643 x (B+D-C)

HPS (%) : 13,643 x E

TLC (%) : 10 x A