BAB IV Cara Kerja

BAB IV

METODE KERJA PRAKTEK

4.1 Pelaksanaan Kerja Praktek

4.1.1 Tempat Kerja Praktek

Gambar 4.1. Lokasi Kerja Praktek dan Pengambilan Sampel (Kiri :

BLPMHP Mataram, Kanan : Pasar Kebon Roek, Ampenan).

Kerja praktek ini dilaksanakan di Balai Laboratorium Pengujian

Mutu Hasil Perikanan (BLPMHP) Dinas Perikanan dan Kelautan Provinsi

Nusa Tenggara Barat. Sedangkan pengambilan sampel dilakukan di pasar

Kebon Roek, Ampenan.

4.1.2 Waktu Pelaksanaan Kerja Praktek

Kerja praktek ini dilaksanakan mulai tanggal 9 Juli 2012 sampai

dengan 9 Agustus 2012.

36

4.2 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi

yang meliputi ; Preparasi Sampel, Angka Lempeng Total (ALT), uji

Coliform, dan uji Escherichia coli serta Uji Biokimia adalah sebagai

berikut :

4.2.1 Preparasi sampel

a)Alat :

- Pisau

- Gunting

- Telenan

- Plastik Sampel

- Timbangan Analitik

- Pinset

- Bunsen

b)Bahan :

- Sampel Ikan Kakap Merah

- Alkohol 70%

- Tissue

4.2.2 Penentuan ALT (Angka Lempeng Total)

a)Alat :

- Tabung Duran (Botol Pengencer)

- Cawan Petri

- Gelas Ukur 500 ml

- Gelas Ukur 250 ml

- Gelas Kimia 200 ml

37

- Gelas Kimia 500 ml

- Labu Alas Bundar 1000 ml

- Ceret 2000 ml

- Pipet Volume 10 ml

- Mikropipet

- Tip

- Tabung Reaksi

- Rak Tabung Reaksi

- Vortex Mixer

- Colony Counter

- Stopwatch

- Stomacher

- Autoclave

- Inkubator

- Bunsen

- Kapas

- Kertas jagung

- Karet Gelang

b)Bahan :

- Media BFP (Butterfield’s Phosphate Buffered)

- Sampel Ikan Kakap(yang telah dipreparasi)

- Media PCA (Plate Count Agar)

- Aquadest

- Kertas Label

4.2.3 uji Coliform dan uji Escherichia coli

a)Alat :

- Tabng Reaksi

- Rak Tabng Reaksi

38

- Mikropipet

- Tip

- Pipet Volume

- Waterbath

- Inkubator

- Cawan Petri

- Tabung Durham

- Timbangan Analitik

- Gelas Ukur

- Gelas Kimia

- Erlenmeyer

- Autoklaf

- Hot Plate

- Stirerr

- Jarum Inokulasi

- Bunsen

- Sendok

- PH Meter

b)Bahan :

- Sampael Ikan Yang sudah diencerkan

- Media LTB

- Media BGLB

- Media LEMB

- Aquadest

- Alkohol

- Karet Gelang

- Kertas Jagung

- Kertas Label

39

- Tissu

4.2.4 uji Biokimia

a)Alat :

- Tabung Reaksi

- Rak Tabung Reaksi

- Autoklaf

- Inkubator

- Pipet Volume

- Hot Plate

- Erlenmeyer

- Gelas Kimia

- Timbangan Analitik

- Jarum Inokulasi

b)Bahan :

- Media PCA Miring

- Media Tryptone Broth

- Media Simmon Citrate

- Indikator Methyl - Red

- Reagen α-Napthol

- Reagen KOH

- Aquadest

4.3 PROSEDUR KERJA

Berdasarkan data BLPMHP Dirjen Perikanan bahwa setiap prosedur kerja

yang dilakukan harus berdasarkan pada Standar Nasional Indonesia (SNI) yaitu

40

01-2332.3-2006. Berikut prosedur kerja yang dilakukan untuk pengujian

mikrobiologi :

4.3.1 Preparasi Sampel

a. Sterilisasi alat yang akan digunakan untuk preparasi menggunakan alkohol.

b. Nyalakan bunsen, dan siapkan pisau, telenan dan pinset. Kemudian

letakkan ikan yang akan dipreparasi diatas telenan. Ikan dipotong dan diambil

daging ikan dari bagian kepala, perut, ekor, dan sedikit isi dalamnya.

c. Disiapkan plastik sampel kemudian diberi kode (Ikan Kakap Merah).

d. Dimasukkan sampel ikan yang telah dipreparasi kedalam plastik sampel,

kemudian ditimbang sebanyak 25 gram.

4.3.2 Penentuan Angka Lempeng Total (ALT) sesuai dengan SNI 01-2332.3-

2006

a. Homogenkan 25 gr contoh (sampel) dalam plastik steril dengan

menambahkan larutan Butterfield’s Phosphate Buffered (BFP) sebanyak

225 ml. Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan stomacher

selama 90 detik, nyatakan sebagai pengenceran 10-1.

b. Siapkan pipet steril atau mikropipet serta 5 buah tabung pengencer berisi 9

ml larutan BFP dan beri kode pengenceran 10-2,10-3, 10-4,10-5 dan 1 tabung

lainnya untuk blangko.

c. Dengan menggunakan pipet steril ambil 1 ml homogenate contoh dari

pengenceran 10-1 kemudian masukkan pada tabung berisi larutan BFP 9

41

ml dan homogenkan dengan menggunakan Vortex mixer, untuk

mendapatkan pengenceran 10-2 . Demikian pula untuk pengenceran 10-3

ambil 1 ml dari pengenceran 10-2 kemudian masukkan pada 9 ml larutan

BFP, begitu seterusnya sampai mendapatkan pengenceran 10-5.

d. Siapkan 9 buah petri disk steril beri kode contoh dan beri kode

pengenceran, masing – masing dilakukan secara duplo dan 1 buah untuk

blanko.

e. Ambil 1 ml larutan 10-1 dan masukkan pada tabung pengencer 10-2,

homogenkan dengan Vortex Mixer. Kemudian dengan pipet baru,ambil 1

ml dari larutan 10-2 masukkan ke petri disk steril yang berkode sampel

pengenceran 10-2 2 buah (duplo), masing – masing 1 ml. Dengan cara

yang sama dilakukan pula untuk pengenceran 10-3,10-4 dan 10-5. Untuk

blangko, 1 ml Larutan BFP dimasukkan pula dalam petri disk.

f. Siapkan PCA hangat – hangat kuku dengan suhu 40-45ᵒ C. Tuang masing

– masing ± 12-15 ml dalam petri disk berisi larutan contoh termasuk juga

pada petri disk blanko. Putar ke kanan dan ke kiri agar merata keseluruh

permukaan. Dinginkan selama ± 30 menit.

g. Inkubasi pada suhu 35ᵒ C selama 48 jam ± 2 hari dengan posisi petri disk

terbalik. Kemudian dihitung koloni yang ada pada cawan petri dengan

Colony Counter atau Electric Bactery Colony Counter dan dicatat pada

lembar kerja.

42

h. Dilanjutkan dengan perhitungan jumlah ALT dan jumlah koloni dengan

menggunakan rumus (analisis data).

4.3.3 Penentuan Coliform & Escherichia coli sesuai dengan SNI 01-2332-

2006.

Uji Coliform dan Escherichia coli terdiri dari uji pendugaan dan uji

penegasan. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut :

1. Uji Pendugaan Coliform

a. Homogenkan 25 gr contoh (sampel) dalam plastik steril dengan

menambahkan larutan Butterfield’s Phosphate Buffered (BFP) sebanyak

225 ml. Kemudian dihomogenkan dengan menggnakan stomacher selama

90 detik,nyatakan sebagai pengenceran 10-1.

b. Tulis kode sampel dan pengenceran pada tiap tabung berisi LTB dan

tabung durham yang akan digunakan, yaitu tiga tabung LTB sebagai

pengenceran 10-1 , tiga tabung LTB sebagai pngenceran 10-2 dan tiga

tabung LTB sebagai pengenceran 10-3.

c. Selanjutnya sampel ikan yang telah dihomogenisasi (sebagai pengenceran

10-1) diambil 1ml menggunakan mikropipet kemudian masukkan pada

tabung berisi larutan BFP 9 ml, untuk mendapatkan pengenceran 10 -2,

kemudian masukkan masing – masing 1ml contoh ke dalam tabung LTB

sesuai dengan pengencerannya dan homogenkan dengan menggunkan

43

vortex mixer. Demikian pula untuk pengenceran 10-3, ambil 1 ml dari

pengenceran 10-2 kemudian masukkan pada 9 ml larutan BFP dan 1 ml ke

masing – masing tabung LTB.

d. inkubasi tabung – tabung tersebut selama 48 jam, pada suhu 35º C. Baca

hasil inkubasinya. Lakukan uji penegasan Coliform dan uji pendugaan

Escherichia Coli untuk tabung – tabung positif.

Hasil : Positif : Terbentuknya gas pada tabung Durham.

Negatif: Tidak terbentuk gas pada tabung durham.

2. Uji Penegasan Coliform

a. Siapkan tabung yang berisi 9 ml BGLB dan tabung durham sesuai dengan

jumlah tabung LTB yang positif. Tulis kode dan pengenceran pada tabung

BGLB sesuai dengan tabung LTB yang positif.

b. Ambil dengan ose steril dari tabung LTB yang positif dan inokulasikan

pada tabung BGLB sesuai dengan kode dan pengenceran. Inkubasi tabung

BGLB pada inkubator selama 48 jam pada suhu 35º C. Baca hasil yang

positif kemudian tentukan nilainya sesuai pada tabel APM.

Hasil : Positif : Terbentuknya gas pada tabung durham

Negatif: Tidak terbentuknya gas pada tabung durham.

44

3. Uji Pendugaan Escherichia coli

a. Siapkan tabung yang berisi 9 ml EC Broth dan tabung durham sesuai

dengan jumlah tabung LTB yang Positif. Tulis kode dan pengenceran pada

tabung EC Broth sesuai dengan tabung LTB yag positif.

b. Diambil biakan dengan ose steril dari tabung LTB yang positif dan

pindahkan pada tabung EC Broth sesuai dengan kode dan pengenceran.

Inkubasi pada Waterbath dengan suhu 45,5 º C selama 48 jam. Baca hasil

inkubasinya, lakukan uji berikutnya untuk hasil yang positif.

Hasil : Positif : Terbentuknya gas pada tabung Durham.

Negatif : Tidak terbentuk gas pada tabung Durham.

4. Uji Penegasan Escherichia coli

a. Siapkan cawan petri steril yang telah diisi media LEMB agar sebanyak

tabung EC Broth yang positif. Tulis kode dan pengenceran pada LEMB

agar sesuai dengan tabung EC Broth yang positif.

b. Ambil dengan ose steril dari tabung EC Broth positif dan pindahkan

dengan cara di strike pada cawan petri yang telah berisi LEMB agar sesuai

dengan kode dan pengenceran. Inkubasi pada inkubator dengan suhu 35º C

selama 24 jam.

45

c. Diperhatikan koloni tersangka yang berwarna hitam atau gelap yang bagian

pusat koloni dengan atau tanpa metalik kehijauan. Jika tidak terdapat

koloni tersangka berarti pengujian telah selesai. Tapi jika ada, maka

dilanjutkan dengan uji IMVIC biokimia.

4.3.4 Uji Biokimia Dengan Reaksi IMViC

1. PERSIAPAN MEDIA PCA

Siapkan PCA miring pada tabung. Tulis kode dan pengenceran pada

PCA miring sesuai dengan LEMB agar yang positif (+). Ambil dengan

jarum ose satu koloni tunggal tersangka pada media LEMB agar,tanam

pada media PCA miring dengan cara menggoreskan pada permukaan

agar miringtersebut. Inkubasi pada incubator dengan suhu 35º C

selama 24 jam.

2. UJI INDOL

Siapkan tabung berisi 5 ml Tryptone Broth. Tulis kode dari

pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media Trypton Broth.

Ambil dengan ose steril dari media PCA miring dan tanam pada media

Tryptone Broth.

Inkubasi selama 24 jam dengan suhu 35º C.

Tambahkan 4 tetes reagen Kovac’s pada media Tryptone Broth yang

telah diinkubasi.

46

Hasil : Positif : Terbentuk cincin merah pada permukaan media.

Negatif: Tidak Terbentuk cincin merah pada permukaan media.

3. UJI VOGES PRESKUER

Siapkan tabung berisi 5 ml MR – VP Broth. Tulis kode dan

pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media MR – VP Broth`.

Ambil dengan ose steril dari media PCA miring dan tanam pada media

MR – VP Broth.

Inkubasi selama 48 jam dengan suhu 35ºC.

Tambahkan reagen α- Napthol 0,6 ml. Kemudian tambahkan reagen

KOH 40% 5 ml ke dalam media MR – VP Broth yang telah diinkubasi.

Hasil : Positif : Terbentuk warna merah pada media.

Negati : Tidak berubah / berwarana kuning kehijauan.

4. UJI METHYL RED

Siapkan tabung berisi 5 ml MR – VP Broth. Tulis kode dan

pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media MR – VP Broth.

Ambil dengan ose steril dari media PCA miring dan tanam pada media

MR – VP Broth.

Inkubasi selama 96 jam dengan suhu 35ºc

Tambahkan indicator Methal – Red kedalam media MR – VP Broth

yang telah di inkubasi

47

Hasil : Positif :Terbentuk warna merah pada media.

Negatif :Terbentuk warna kuning pada media.

5. UJI CITRATE

Siapkan tabung berisi Simmon Citrat agar miring.Tulis kode dan

pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media Simmon Citrat

Agar.

Ambil dengan Ose Steril dari media PCA miring dan tanam.Pada

media Simmon Citrate dengan cara menggoreskan pada sisi miring

media tersebut.

Inkubasi selama 96 jam dengan suhu 35ºC

Hasil : Positif :Media berubah jadi biru

Negatif :Media berwarna tetap ( hijau )

Hasil Escherichia coli pada IMVIC adalah :

Uji Indol : Positif / Negatif

Uji Voges Preskuer : Negatif

Uji Methyl Red : Positif

Uji Citrate : Negatif

48

4.4 Analisis Data

Analisa data untuk uji penegasan Coliform menggunakan kombinasi

tabung-tabung positif dari tiga seri pengenceran pada media BGLB kemudian

dicocokkan dengan Tabel MPN/APM. Sedangkan analisis data untuk pendugaan

Escherichia coli dilakukan dengan mencocokkan kombinasi tabung-tabung

positif dari tiga seri pengenceran pada media EC-Broth dengan Tabel MPN atau

APM (Angka Paling Memungkinkan). Untuk uji penegasan Escherichia coli

ditentukan berdasarkan hasil uji IMViC yang dicocokkan juga dengan tabel

APM.

4.1 Analisis Data ALT

Berdasarkan tabel perhitungan ALT dapat ditentukan dengan

rumus sebagai berikut :

Keterangan :

N : Jumlah koloni produk dinyatakan dalam koloni ml atau per gram

ΣC: Jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung

n1 : Jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung

n2 : Jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung

d : pengenceran pertama yang dihitung

Standar ALT untuk produk perikanan yaitu 5 x 105 koloni/gram

49