ANALISIS EKSPRESI GEN AGAMOUS2 SQUAMOSA1 DAN … · ANALISIS EKSPRESI GEN AGAMOUS2, SQUAMOSA1, DAN EGAD1 ORGAN REPRODUKTIF DAN VEGETATIF . Elaeis guineensis . Jacq. ... terjadinya

ANALISIS EKSPRESI GEN AGAMOUS2, SQUAMOSA1, DAN

EGAD1 ORGAN REPRODUKTIF DAN VEGETATIF

Elaeis guineensis Jacq

DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

ABSTRAK

DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT. Analisis Ekspresi Gen

AGAMOUS2, SQUAMOSA1 dan EGAD1 Organ Reproduktif dan Vegetatitif

Elaeis guineensis Jacq. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan ASMINI

BUDIANI.

Salah satu kendala perbanyakan kelapa sawit melalui kultur jaringan

adalah abnormalitas. Salah satu gen yang ekspresinya dilaporkan sejalan dengan

terjadinya abnormalitas pada kelapa sawit adalah EGAD1, gen yang terkait

dengan sistem ketahanan. Abnormalitas juga dipengaruhi oleh gen-gen

pembungaan, antara lain AG dan SQUA. Penelitian bertujuan menganalisis tingkat

ekspresi gen AG2, SQUA1, dan EGAD1 organ reproduktif dan vegetatif tanaman

kelapa sawit normal dan abnormal. Isolasi RNA dilakukan dari bunga dan daun

kelapa sawit abnormal dan normal. Ekspresi gen AG2, SQUA1 dan EGAD1

diamati dengan metode RT-PCR, selanjutnya kuantitas ekspresi gen dianalisis

dengan perangkat lunak UnScan gel IT. Ekspresi gen AG2 tidak ditemukan pada

daun kelapa sawit abnormal maupun normal. Ekspresi gen SQUA1 dan EGAD1

daun kelapa sawit normal lebih tinggi dibandingkan dengan daun kelapa sawit

abnormal. Kuantitas ekspresi SQUA1 dan EGAD1 berturut-turut pada daun kelapa

sawit normal sebesar 80.20 ng/mL dan 15.96 ng/mL. Ekspresi AG2, SQUA1, dan

EGAD1 bunga abnormal lebih tinggi dibandingkan bunga normal. Nilai kuantitas

AG2, SQUA1, dan EGAD1 bunga abnormal berturut-turut 174.20 ng/mL, 120.72

ng/mL, dan 130.55 ng/mL.

ABSTRACT

DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT. An Analysis of the AGAMOUS2,

SQUAMOSA1 and EGAD1 Expression on Reproductive and Vegetative Organs of

Elaeis guineensis Jacq. Under the direction of I MADE ARTIKA and ASMINI

BUDIANI.

One of the major problems encountered in micropropagation of oil palm

through tissue culture is mantled abnormality. One of genes reported to involve in

the mantled is EGAD1, a gene coding for putative plant defensin. Abnormality

also influenced by floral genes, for example AG2 and SQUA1. This experiment

aimed to analyze of the AG2, SQUA1 and EGAD1 expression on reproductive

and vegetative organs of abnormal and normal oil palm. RNA was isolated from

flower and leaf of abnormal and normal oil palm. The AG2, SQUA1 and EGAD1

expression observed by RT-PCR method. To further confirm the result, UnScan

gel IT software was also utilized. Expression of AG2 not found in abnormal and

normal oil palm leaf. SQUA1 and EGAD1 expression in normal oil palm leaf

higher than abnormal. Expression quantity of SQUA1 and EGAD1 in normal oil

palm leaf is 80.20 ng/mL and 15.96 ng/mL. In contrast, expression of AG2,

SQUA1, dan EGAD1 in abnormal oil palm flower higher than normal. AG2,

SQUA1, dan EGAD1 quantity in abnormal oil palm flower is 174.20 ng/mL,

120.72 ng/mL, dan 130.55 ng/mL.

ANALISIS EKSPRESI GEN AGAMOUS2, SQUAMOSA1, DAN

EGAD1 ORGAN REPRODUKTIF DAN VEGETATIF

Elaeis guineensis Jacq

DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

Judul Skripsi : Analisis Ekspresi Gen AGAMOUS2, SQUAMOSA1, dan

EGAD1 Organ Reproduktif dan Vegetatif Elaeis guineensis

Jacq

Nama : Donald John Calvien Hutabarat

NIM : G84052119

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr.Ir. I Made Artika, M.App.Sc Dr. Asmini Budiani, M.Si

Ketua Anggota

Diketahui

Dr.Ir. I Made Artika, M.App. Sc

Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Tri Tunggal karena atas

segala berkat dan kasih-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini.

Penelitian yang bertema analisis ekspresi gen AGAMOUS2, SQUAMOSA1 dan

EGAD1 organ reproduktif dan vegetatitif Elaeis guineensis Jacq ini dilaksanakan

di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) Bogor.

Selesainya penelitian ini tidak lepas dari dukungan beberapa pihak. Oleh

karena itu, ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada Dr.Ir. I Made Artika,

M.App. Sc dan Dr. Asmini Budiani, M.Si selaku pembimbing yang telah memberi

masukan dan arahan. Penulis menyampaikan terima kasih Bapak, Mama, dan

Kakak yang telah memeberi bimbingan moril maupun material. Tidak lepas juga

kepada Martungtung yang tetap sabar dan setia membantu dalam terlaksananya

penelitian serta pembuatan skripsi ini. Penulis berterimakasih kepada Mba‟ Arlyn

Esti, dan teman-teman Biokimia 42 yang membantu dalam penelitian ini. Penulis

juga berterimakasih kepada semua pihak yang telah membantu dan mendukung

penulis dalam mencari literatur dan beberapa referensi lainnya.

Penulis sadar penelitian ini masih terdapat kekurangan oleh karena itu,

penulis terbuka untuk segala saran dan kritik yang membangun guna perbaikan.

Penulis berharap agar penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Bogor, Agustus 2010

Donald John Calvien Hutabarat

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Berastagi pada tanggal 4 Pebruari 1987 dari ayah

Marsuan Hutabarat dan ibu K. Magda R br Marbun. Penulis merupakan anak

ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri I Berastagi

dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan

Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor dari Departemen Biokimia,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam serta Supporting Course (SC)

sebagai pendukung mata kuliah.

Penulis melaksanakan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium

Mikrobiologi-Recorvery Balai Pengkajian Bioteknologi-BPPT di Kawasan

PUSPIPTEK Serpong, Tangerang selama periode Juli sampai Agustus 2008

dengan judul Pengaruh Media dan Lama Proses Fermentasi Terhadap Produksi

Antibiotika oleh Aktinomiset Endofit BioMCCAE-00048. Selain itu penulis

pernah aktif di beberapa organisasi kemahasiswaan, antara lain Comminity of

Research and Education in Biochemistry (CREBs) periode 2007/2008,

Persekutuan Mahasiswa Kristen IPB (PMK IPB) sebagai anggota komisi

kesenian, dan Ikatan Mahasiswa Karo (IMKA) Bunga Ncole. Pengalaman lain

pengurus yaitu sebagai Sie Logstran pada acara LKIP, Pesta Sains Nasional 2007.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL...................................................................................................

DAFTAR GAMBAR...........................................................................................

DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................\

PENDAHULUAN......................................................................................................

TINJAUAN PUSTAKA.............................................................................................

Kelapa Sawit..................................................................................................

Mantled..........................................................................................................

Gen-Gen Pembungaan Tanaman...................................................................

EGAD1...........................................................................................................

Isolasi RNA....................................................................................................

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)....................

BAHAN DAN METODE....................................................................................

Alat dan Bahan..........................................................................................

Metode Penelitian...........................................................................................

HASIL DAN PEMBAHASAN...........................................................................

RNA Total Bunga dan Daun Kelapa Sawit...............................................

Konsentrasi dan Kemurnian RNA Total......................................................

Kualitas RNA Total Hasil Isolasi................................................................

Sintesis cDNA dan Amplifikasi Gen..........................................................

Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1 pada Daun Kelapa Sawit....

Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1 pada Bunga Kelapa Sawit.......

SIMPULAN DAN SARAN.....................................................................................

DAFTAR PUSTAKA...............................................................................................

LAMPIRAN............................................................................................................

ix

ix

ix

1

1

1

2

2

3

3

4

4

4

4

6

6

6

7

7

8

9

10

11

13

DAFTAR TABEL Halaman

1 Konsentrasi dan kemurnian RNA total.............................................................

2 Konsentrasi dan kemurnian cDNA total.........................................................

3 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi EGAD1 dan SQUA1...............................

4 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi EGAD1, AG2, dan SQUA1........................

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Model gen ABC untuk proses pembentukan organ bunga...................................

2 Perbedaan tingkat ekspresi mRNA dari gen EGAD1.......................................

3 Tandan bunga kelapa sawit..............................................................................

4 RNA daun dan bunga kelapa sawit................................................................

5 Elektroforegram hasil RT-PCR pada daun kelapa sawit......................................

6 Elektroforegram hasil RT-PCR pada bunga kelapa sawit..................................

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Diagram alir penelitian.......................................................................................

2 Pembuatan bufer ekstraksi..............................................................................

3 Prosedur elektroforesis gel agarosa.....................................................................

4 Komposisi mix untuk sintesis cDNA.................................................................

5 Komposisi mix untuk amplifikasi dengan PCR (cDNA 600ng)........................

6 Susunan nukleotida primer dan kondisi PCR....................................................

6

8

9

10

14

15

16

17

17

17

2

3

5

7

8

10

“And whatever things you ask in prayer, believing, you will receive.”

Matthew 21: 22

PENDAHULUAN

Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.)

merupakan komoditas penting penyumbang

devisa negara terbesar dari sektor pertanian.

Pada tahun 2006, total devisa yang dihasilkan dari produk berbasis kelapa sawit mencapai 7

miliar dollar AS (Suwito 2007). Ekspor CPO

dan produk turunannya selama Agustus 2009

naik tajam 49% menjadi 1,62 juta ton

dibandingkan dengan Juli yang 1,09 juta ton

(Anonim 2009).

Untuk memenuhi permintaan minyak

sawit yang terus meningkat dilakukan usaha

peningkatan produksi, salah satunya melalui

penggunaan bibit unggul. Aplikasi teknik

kultur jaringan untuk menghasilkan bibit unggul klonal diharapkan dapat mendukung

usaha peningkatan produksi kelapa sawit.

Asmono et al (2004) melaporkan bahwa

produksi kelapa sawit klonal meningkat

menjadi 8.5 ton CPO/ha/tahun dari 7.8

tons/ha/tahun. Sedangkan Agrocom di

Malaysia melaporkan bahwa setelah 7 tahun

ditanam, tanaman kelapa sawit klonal

menghasilkan tandan buah segar dan minyak

masing-masing 40% dan 50% lebih tinggi

dibandingkan tanaman asal biji. Namun dalam

aplikasinya, pada beberapa perkebunan ternyata dideteksi terjadinya abnormalitas

pembungaan dan pembuahan pada tanaman

kelapa sawit hasil kultur jaringan dengan

persentase yang bervariasi (5-100%), sehingga

produksinya justru menurun.

Mantled merupakan sebuah contoh dari

abnormalitas yang terbentuk dalam kultur

jaringan kelapa sawit. Berbagai hasil

penelitian menunjukkan bahwa karakter

mantled bersifat epigenetik (Rival et al 1998;

Matthes et al 2001). Fenomena terjadinya bunga mantled juga berhubungan dengan

metilasi DNA (Kaeppler & Phillips 1993;

Jaligot et al 2000; Matthes et al 2001).

Salah satu gen yang ekspresinya

dilaporkan sejalan dengan terjadinya variasi

somaklonal pada kelapa sawit adalah EGAD1,

gen penyandi protein yang terkait dengan

sistem ketahanan (Tregear et al 2002). Hasil

penelitian menunjukkan bahwa akumulasi

transkrip EGAD1 pada infloresen abnormal

jauh lebih kuat dibandingkan dengan

infloresen yang normal. Perbedaan tersebut juga terjadi pada tingkat kalus. Kalus dan

tunas pucuk yang dikulturkan dari tanaman

abnormal hasil kultur jaringan

mengakumulasikan mRNA EGAD1 jauh lebih

tinggi dibandingkan dengan kalus dan tunas

pucuk yang ditumbuhkan dari tanaman asal

biji maupun dari tanaman normal asal kultur

jaringan.

Tregear et al (2002) menyebutkan bahwa

abnormalitas tanaman kelapa sawit hasil

kultur jaringan mirip dengan mutan tipe B

pada Arabidopsis thaliana maupun

Antirrhinum majus (Coen & Mayerowitz

1991). Mutan semacam ini terjadi pada gen

AP3 dan PI. Sementara itu, AP1 Arabidopsis

merupakan regulator dari gen pembungaan

tipe B AP3 dan PI (Ng & Yanofsky 2001). Di dalam alur genetika pembungaan tanaman

Arabidopsis, penginduksi ekspresi gen AP1

adalah faktor transkripsi dari gen LFY (Pineiro

& Coupland 1998). Menurut Santoso et al

(2004) ekspresi AP1 pada tanaman kakao

terkait erat dengan perkembangan organ

pembungaan. Gen SQUAMOSA (SQUA)

adalah suatu anggota dari suatu keluarga

MADS-box yang homolog dengan gen AP1.

Gen AGAMOUS (AG) diketahui berperan

dalam menentukan identitas organ bunga. Gen ini pada buah kakao diekspresikan secara

diferensial sejalan dengan perkembangannya.

Penelitian ini bertujuan menganalisis

tingkat ekspresi gen AGAMOUS2 (AG2),

SQUAMOSA1 (SQUA1) dan EGAD1 dari

organ reproduktif dan vegetatif tanaman

kelapa sawit normal dan abnormal. Hasil

penelitian ini akan digunakan untuk

mengembangkan teknologi molekuler deteksi

dini abnormalitas kelapa sawit hasil kultur

jaringan. Hipotesis yang diajukan yaitu terdapat perbedaan ekspresi gen AG2, SQUA1

dan EGAD1 pada organ reproduktif dan

vegetatif antara tanaman kelapa sawit normal

dan abnormal.

Analisis tingkat ekspresi gen AG2,

SQUA1 dan EGAD1 diharapkan menambah

informasi ilmiah tentang kaitan antara

akumulasi transkrip gen-gen tersebut dengan

kejadian abnormalitas bunga kelapa sawit

sehingga dapat digunakan sebagai dasar untuk

mengembangkan teknologi molekuler deteksi

dini abnormalitas kelapa sawit hasil kultur jaringan.

TINJAUAN PUSTAKA

Kelapa Sawit

Kelapa sawit (Elaies guineensis Jacq.)

termasuk ordo monokotil, famili Arecaceae, subfamili Cocoieae dan genus Elaies (Pahan

2006). Tanaman kelapa sawit merupakan

tanaman asli Afrika (Corley 1976). Kata

„elaeis‟ berasal dari bahasa Yunani yaitu

Elaeion yang berarti minyak, sedangkan

2

„guineensis‟ berasal dari kata Guinea yaitu

nama pantai di Afrika dan „Jacq‟ adalah orang

yang pertama kali memberi nama Elaeis

guineensis pada kelapa sawit (Lubis 1992).

Tanaman kelapa sawit berakar serabut

yang sebagian besar berada dekat permukaan

tanah yaitu pada kedalaman 15-30 cm.

Batangnya tegak tidak bercabang, berdiameter

40-75cm, tinggi batang dalam pembudidayaan

tidak lebih 15-18 m. Kelapa sawit berdaun

majemuk dengan pelepah daun tersusun melingkari batang berbentuk spiral. Panjang

pelepah daun kelapa sawit mencapai 9 m

dengan helai daun mencapai 1.2 m berjumlah

100-160 pasang. Jumlah pelepah yang

dipertahankan dalam perkebunan kelapa sawit

adalah sekitar 30-50 pelepah (Harley 1971).

Abnormalitas

Perbanyakan kelapa sawit diperlukan

terutama untuk memenuhi kebutuhan kelapa

sawit yang tumbuh dan berkembang dengan cepat di Indonesia. Kultur jaringan digunakan

untuk multiplikasi genotipe unggul kelapa

sawit selama beberapa tahun. Namun

penggunaan secara massal proses ini ternyata

menimbulkan masalah baru yaitu munculnya

fenotipe abnormal (mantled) (Corley et al

1986) salah satu keragaman somaklonal dari

kelapa sawit yang disebut dengan mantled

fruit (buah bersayap).

Fenotipe bunga mantled ditunjukkan

dengan terbentuknya daun buah semu dari struktur stamen yang berasal baik dari bunga

jantan atapun dari bunga betina. Pada kasus

yang ekstrim akan menimbulkan bunga yang

steril sehingga tanaman gagal berbuah.

Pertama kali dilaporkan oleh Corley et al

(1986) kejadian ini hanya dideteksi sebanyak

5-10%. Namun, di Laboratorium Bakasawit

Malaysia kejadian bunga mantled meningkat

hingga 80% selama 3-4 tahun proses

regenerasi kultur (Eeuwens et al 2002).

Gen-gen Pembungaan Tanaman

Organ bunga dalam proses

perkembangannya membentuk susunan

lingkaran dari luar ke dalam dengan urutan

sebagai berikut: sepal, petal, stamen dan

karpel (Coen & Carpanter 1993). Hasil

penelitian pada tanaman Arabidopsis thaliana

menunjukkan bahwa perkembangan identitas

organ bunga dipengaruhi oleh ekspresi

beberapa gen pembungaan yaitu APETALA1 (AP1), APETALA2 (AP2), APETALA3 (AP3),

PISTILATA (PI) dan AGAMOUS (AG) (Taiz

dan Zeiger 2002). Berdasarkan aktifitasnya

gen-gen tersebut dikelompokkan menjadi 3

tipe atau kelompok gen yaitu tipe A, B, dan C

yang berpengaruh dalam perkembangan

identitas organ bunga, yang kemudian dikenal

sebegai model ABC (Taiz & Zeiger 2002).

Aktifitas tipe A disandikan oleh gen AP1

dan AP2 yang mengontrol perkembangan

identitas organ pada lingkaran pertama dan kedua yaitu pembentukan sepal dan petal.

Tipe B disandikan oleh gen AP3 dan PI yaitu

mengontrol perkembangan identitas organ

pada lingkaran kedua dan ketiga yaitu

pembentukan petala dan stamen. Tipe C

disandikan oleh gen AG yang mengontrol

perkembangan identitas organ pada lingkaran

ketiga dan keempat yaitu pembentukan

stamen dan karpel (Pinero & Coupland 1998;

Taiz & Zeiger 2002).

Berdasarkan hubungan antara masing-masing gen ABC tersebut diperoleh tiga

bentuk fenotipik bunga (Gambar 1): (B)

Apabila gen pembungaan yang bekerja hanya

gen A dan B saja, maka bunga yang terbentuk

hanya memiliki sepal dan petal sehingga

bunga tersebut tidak mempunyai kelamin

jantan maupun betina. (C) Sedangkan bila

hanya gen B dan C saja yang bekerja, maka

bunga yang terbentuk hanya memiliki stamen

dan karpel saja tidak memiliki sepal dan petal.

Gambar 1 Model gen ABC untuk proses pembentukan organ bunga (Taiz & Zeiger 2002).

3

(D) Apabila gen yang bekerja hanya gen A

dan C, maka bunga yang terbentuk hanya

memiliki sepal dan karpel saja sehingga

kehilangan petal dan stamen. (Coen &

Mayerowitz 1991; Taiz & Zeiger 2002).

Dengan semakin pesatnya kemajuan

penelitian gen pembungaan pada tanaman,

maka model gen ABC berkembang menjadi

model ABCDE, yang disebut dengan model

MADS-box (Pinyopich et al 2003). Tipe D

dibutuhkan untuk perkembangan bakal buah (ovule) (Colombo et al 1995; Theissen 2001;

Ditta et al 2004), dan tipe E dibutuhkan untuk

perkembangan seluruh organ bunga dari

tanaman (Pelaz et al 2000; Honma & Goto

2001). Tipe A terdiri gen SQUAMOSA

(SQUA) subfamili, tipe B terdiri kelas gen

GLOBOSA (GLO) dan DEFICIENS (DEF),

tipe C dan D AGAMOUS (AG), dan tipe E

terdiri dari gen AGAMOUS-like2 (AGL2).

Gen AG adalah keluarga gen MADS-box

yang diperlukan dalam pembentukan identitas organ bunga. Gen ini berperan dalam

pembentukan dan perkembangan stamen

(kepala dan benang sari) dan karpel (putik).

Tingkat ekspresi gen AG dapat ditekan oleh

gen lain seperti BELLRINGER (BELL)

sehingga pengaruh gen AG dalam

pembentukan meristem bunga dan inflorensia

menjadi terhambat (Bao et al 2004).

Mizukami & Ma (1997), melaporkan adanya

fungsi ektopik gen AG yang mempengaruhi

proses transisi SAM (shoot apical meristem) dari pertumbuhan vegetatif ke generatif. Gen

SQUA adalah suatu anggota dari suatu

keluarga MADS-box yang homolog dengan

gen AP1.

EGAD1

Tregear et al (2002) mengungkap salah

satu gen yang tingkat ekspresinya berasosiasi

dengan kejadian abnormalitas mantled. Gen

tersebut adalah gen EGAD1 yang mempunyai

Gambar 2 Perbedaan tingkat ekspresi mRNA

dari gen EGAD1 dibandingkan

dengan ekspresi rRNA pada

beberapa tahapan perkembangan

proses kultur in vitro (Tregear et al

2002).

tingkat homologi tinggi dengan gen defensin

(salah satu gen pertahanan) dari tumbuhan.

Tingkat ekspresi gen EGAD1 dengan kalus

normal lebih rendah dari kalus abnormal

(Gambar 2). Perbedaan tingkat ekspresi

tersebut diduga akibat proses kultur in vitro

yang secara langsung atau tidak langsung

menyebabkan terjadinya perubahan susunan

DNA pada promoter gen EGAD1.

Isolasi RNA

Ribonucleic Acid (RNA) merupakan

senyawa kimia pembawa informasi genetik

yang terdiri atas monomer ribonukeotida

monofosfat yang dihubungkan oleh ikatan

fosfodiester (Goodenough 1988). Dalam sel,

RNA memiliki beberapa bentuk, yaitu: rRNA

(ribosomal RNA), tRNA (transfer RNA), dan

mRNA (messenger RNA). rRNA merupakan

komponen utama penyusun ribosom yang

berperan dalam sintesis rantai protein, tRNA

berfungsi menterjemahkan kodon yang terdapat pada mRNA menjadi satu jenis asam

amino pada proses translasi, sedangkan

mRNA merupakan model cetakan dalam

proses penyusunan asam-asam amino pada

rantai polipeptida dan disandi oleh ruas khas.

Isolasi RNA dilakukan melalui

pemecahan dinding sel, pemisahan protein

dan DNA, dan pemurnian RNA. Untuk

menghilangkan protein dalam larutan

digunakan isoamil alkohol (mengikat protein)

dan kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Untuk

menghilangkan molekul DNA dari larutan,

digunakan DNAse yang berfungsi

mendegradasi molekul tersebut.

Untuk mengetahui kuantitas RNA

digunakan spektofometer. Penyerapan iradiasi

sinar UV secara maksimal oleh RNA dicapai

pada λ 260 nm. Apabila serapan λ ini bernilai

satu, maka konsentrasi molekul mRNA setara

dengan 40 μg/mL (Sambrook et al 1989).

Kualitas RNA dianalisis dengan

elektroforesis. RNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah elektroda yang

bermuatan positif.

Pengamatan hasil elektroforesis

dilakukan dengan bantuan EtBr (Ethidium

Bromide) di bawah sinar UV. Molekul RNA

yang tersisipi EtBr dapat berfluoresensi di

bawah cahaya UV. Jumlah molekul EtBr yang

dapat membentuk interkelasi dengan molekul

RNA sebanding dengan jumlah RNA,

sehingga intensitas pita-pita RNA yang

diamati dalam gel sebanding dengan kuantitas RNA.

4

Reverse Transcriptase Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada

target tertentu dengan cara mensintesis

molekul DNA baru yang berkomplemen

dengan molekul DNA tersebut dengan

bantuan enzim DNA polymerase dan

oligonukleotida sebagai primer dalam suatu

termocycler (Glick dan Pasternak 1994). Prinsip pelipatgandaan jumlah molekul

DNA pada target yang diinginkan melalui

teknik PCR adalah: (1) Denaturasi, sehingga

struktur DNA berubah dari untai ganda

menjadi rantai tunggal. Biasanya suhu yang

digunakan adalah 95ºC. (2) Penempelan

(annealing), yaitu penempelan primer pada

DNA yang diinginkan. Suhu yang digunakan

bergantung pada panjang dan komposisi

primer, dan (3) pemanjangan primer

(extension). Setelah primer menempel, enzim polimerase mulai mensintesis molekul DNA

baru yang dimulai dari ujung 3‟ dari masing-

masing primer. Dengan demikian, satu

molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya

menjadi dua molekul DNA. Setelah itu

diulang kembali proses denaturasi,

penempelan, pemanjangan dan seterusnya.

Proses tersebut disebut satu siklus. Jumlah

DNA hasil proses PCR adalah 2n (n = siklus).

Reverse Transcriptase Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR) merupakan kombinasi dari sintesis cDNA (complementary DNA) dan

PCR. Berbeda dengan PCR, template untuk

RT-PCR berupa RNA total atau RNA yang

mengandung poli (A)+. Primer yang

digunakan dapat berupa primer acak, oligo

(dT), atau sebuah primer spesifik. Sintesis

utas pertama cDNA dilakukan oleh enzim

reverse transcriptase menggunakan primer

oligo dT atau random heksamer. DNA

komplementer utas pertama menjadi template

dalam reaksi PCR tersebut yang menggunakan

primer spesifik dengan enzim polimerase. Reverse Transcriptase Polymerase Chain

Reaction dapat dilakukan melalui satu tahap

ataupun dua tahap. Pada RT-PCR dua tahap,

sintesis cDNA dilakukan pertama kali dalam

buffer RT, kemudian dilanjutkan dengan

proses PCR. Reverse Transcriptase

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) yang

menggunakan satu tahap, sintesis cDNA dan

PCR terjadi dalam satu tabung pada mesin

PCR. Metode RT-PCR dapat digunakan untuk

menganalisis elspresi gen tanpa perlu mengkonstruksi pustaka cDNA.

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah sentrifus

Beckman Coulter Allegra 64R, Eppendorf

sentrifuge 5417R, Beckman coulter-DU 530,

pH meter (Cyberscan 510), GeneAmp PCR System 2400, transluminator UV, autoklaf

(ALP KT-305), microwave (Kenmore), neraca

analitik (Scaltec), mikropipet (Biohit Proline

& Eppendorf), magnetic stirrer, tabung PCR,

tabung mikro (Axygen), tabung sentrifus, gelas

ukur, gelas piala, labu Erlenmeyer, mortar,

dan sudip.

Bahan penelitian yang digunakan adalah

daun serta bunga tanaman kelapa sawit

normal dan abnormal hasil penelitian BPBPI

yang ditanam di kebun kelapa sawit Balai Penelitian Karet Sembawa (BPKS)

Palembang. Bunga dan daun kelapa sawit

dipotong-potong kemudian disimpan pada

suhu -70ºC sampai digunakan. Bahan kimia

yang digunakan adalah N2 cair, PVPP

(polyvinyl poly pyrolidone), trizma base, LiCl,

EDTA, thiourena, aurinitrikarboksilat, 2-

merkaptoetanol, larutan fenol: kloroform:

isoamilalkohol (25:24:1), larutan kloroform:

isoamilalkohol (24:1), natrium asetat 3 M pH

5.2, etanol absolut, DEPC-ddH2O, LiCl 8 M,

etanol 70%-DEPC, etidium bromoda 1% (b/v), agarose, diethyl pyrocarbonate (DEPC),

tris borate EDTA (EDTA) 0.5x, DNA loading

buffer, Super ScriptTM First-Strand cDNA

Synthesis (Invitrogen), DNase, RNase dan

DFS-Taq DNA Polymerase (Invitrogen).

Metode Penelitian

Isolasi RNA

Sebanyak 1.5 g daun atau bunga kelapa

sawit (Gambar 3) digerus hingga halus dengan

penambahan PVPP dan N2 cair, kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang

berisi 10 mL buffer ekstraksi. Campuran

dikocok dan divorteks selama 2 menit.

Ekstraksi dilanjutkan dengan menambahkan

fenol: klorofrom: isoamilalkohol 25:24:1

(P:C:I) sebanyak 1 volume. Sampel

dihomogenkan kemudian disentrifus selama

15 menit pada suhu 4°C dan kecepatan 15.000

rpm (F0630 30º, Beckman Coulter Allegra

64R). Supernatan diekstraksi kembali dengan

P:C:I (25:24:1) dengan perlakuan yang sama.

Supernatan yang diperoleh kemudian ditambah klorofrom:isoamilalkohol 24:1 (C:I)

sebanyak 1 volume, dan disentrifus 15.000

5

rpm (F0630 30º, Beckman Coulter Allegra

64R), selama 15 menit dengan suhu 4°C.

Ekstraksi ini dilakukan dua kali.

Supernatan yang diproleh ditambah

1/30xV Na asetat dan 1/10xV etanol absolut,

dihomogenkan dan disimpan dalam es selama

30 menit, untuk memisahkan asam nukleat dari senyawa organik. Setelah itu, campuran

disentrifus selama 15 menit pada suhu 4°C

dan kecepatan 15.000 rpm (F0630 30º,

Beckman Coulter Allegra 64R). Supernatan

yang diproleh ditambah 1/30 v Na asetat dan 3

v etanol absolut dihomogenkan dan disimpan

pada suhu -70ºC selama semalam. Setelah itu

campuran disentrifusi selama 30 menit pada

suhu 4°C dan kecepatan 15.000 rpm (F0630

30º, Beckman Coulter Allegra 64R). Endapan

yang diperoleh dibilas dengan etanol 70% dan

dipindahkan dalam tabung mikro 2 mL kemudian disentrifus selama 3 menit pada

suhu 4°C dan kecepatan 8.000 rpm (FA-45-

24-11, Eppendorf sentrifuge 5417R),

kemudian dikering anginkan. Endapan

dilarutkan dalam 1000 µL DEPCddH2O dan

ditambahkan LiCl 8 M hingga konsentrasi

akhirnya 2 M kemudian diinkubasi selama

semalam pada suhu 4°C untuk

mengendapakan RNA.

RNA yang telah diendapkan disentrifus

selama 30 menit pada suhu 4ºC dan kecepatan 12.000 rpm (FA-45-24-11, Eppendorf

sentrifuge 5417R). Pelet yang diperoleh

dibilas dengan EtOH DEPC 70 % dan

dikeringkan. Supernatan dibuang dan pelet

dilarutkan dengan DEPCddH2O 50 μL.

Uji Kualitatif dan Kuantitatif RNA Total

Hasil Isolasi

Uji kualitatif dan kuantitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%

dan pengukuran absorbansi pada λ 260 nm,

280 nm dan 230 nm. Uji kuantitatif dilakukan

untuk mengetahui konsentrasi RNA.

Konsentrasi RNA diperoleh dari perbandingan

nilai absorbansi 1 pada panjang gelombang

260 nm sama dengan RNA yang memiliki

konsentrasi 40 µg/mL (Sambrook et al 1989)

sehingga konsentrasi RNA dapat ditentukan

dengan persamaan berikut:

[RNA] = A260 x 40 µg/mL x fp

[RNA] : konsentrasi RNA (µg/mL)

A260 : absorbansi pada λ 260nm

Fp : faktor pengenceran

Sedangkan uji kualitatif untuk

menganalisis kemurnian RNA ditentukan

berdasarkan perbandingan absorbansi pada λ

260 nm dengan λ 280 nm untuk kemurnian

RNA terhadap protein dan perbandingan

absorbansi pada λ 260 nm dengan λ 230 nm

yang menunjukkan kemurnian RNA terhadap polisakarida.

Gambar 3 Tandan bunga kelapa sawit A: tanda kelapa sawit abnormal; B: tanda kelapa sawit

normal yang telah dibuka selongsongnya dari phylotaxis ke-12.

A

B

6

Analisis Ekspresi Gen-Gen Target dengan

RT-PCR

Sintesis Utas Pertama Complementary

DNA (cDNA). Utas pertama cDNA disintesis

dengan menggunakan kit Super ScriptTM

First-Strand cDNA Synthesis. Total volume

reaksi yang digunakan sebanyak 20 µL. Ke

dalam tabung mikro steril dimasukkan 2 µg

RNA, 1 µL dNTPs 10 mM dan 1 µL oligo

(dT)12-18 10 pmol/µL serta MFW (molecular free water) steril hingga 10µL, kemudian

diinkubasi pada suhu 65ºC selama 5 menit.

Setelah itu, campuran segera dimasukkan ke

dalam es dan ditambah dengan 2µL buffer RT

10x, 4µL MgCl2 25mM, 2µL DTT 0.1M dan

1µL RNaseOUTTM Recombinant RNase

Inhibitor. Setelah itu campuran diinkubasi

pada suhu 42ºC selama 2 menit, dan

campuran reaksi ditambah dengan Super

ScriptTM II reverse Transcrptase, kemudian

diinkubasi selama 50 menit. Setelah reaksi selesai, inaktivasi enzim dilakukan dengan

inkubasi campuran pada suhu 70ºC selama 15

menit. RNaseH ditambah ke dalam campuran

reaksi untuk menghilangkan RNA,

dilanjutkan inkubasi pada 37ºC selama 20

menit dan terakhir suhu dikondisikan pada

10ºC.

Amplifikasi Fragmen Gen Target

dengan Primer Spesifik. Reaksi PCR

dilakukan dengan total volume 30 µl yang terdiri dari 600ng cDNA utas pertama (first

strand cDNA) sebagai cetakan, pasangan

primer EGAD1, AG2, dan SQUA1 masing-

masing dengan konsentrasi 10 mM sebanyak

1 µl, 3 µl buffer PCR 10x, 0.6 µl dNTPs 10

mM, 0.3 µl Taq DNA polymerase 5 unit/µl

dan NFW (nuclease free water) sampai

mencapai volume 30 µl. Program PCR terdiri

dari pre-denaturasi pada suhu 94ºC selama 30

detik dilanjutkan dengan siklus tertentu yang

terdiri dari denaturasi pada suhu 94ºC selama

30 detik, suhu annealing yang sesuai selama 45 detik, dan elongasi pada suhu 72ºC selama

1 menit 30 detik. Hasil PCR di cek dengan

elektroforesis pada gel agarosa 1.2 %. Primer

EF digunakan sebagai kontrol. Setiap primer

memiliki suhu anealing dan jumlah siklus

yang berbeda-beda (Lampiran 6).

Kuantifikasi Hasil RT-PCR. Hasil

elektroforesis dari PCR dianalisis kuantitas

ekspresi setiap gen menggunakan perangkat

lunak UnScan gel IT.

HASIL DAN PEMBAHASAN

RNA Total Bunga dan Daun Kelapa Sawit

Tahapan isolasi RNA total terdiri atas 3

tahap utama, yaitu pemecahan dinding sel,

ekstraksi dan permurnian RNA. Pemecahan

dinding sel berfungsi membebaskan

sitoplasma dan RNA dalam sel. Nitrogen cair

digunakan karena merupakan cara yang

efektif untuk membekukan jaringan sehingga

mudah dihancurkan, selain itu kondisi suhu

yang dingin dapat membuat RNAse inaktif (Wilkins dan Smart 1996). Penambahan PVPP

dan β-merkaptoetanol berfungsi menghambat

kerja enzim polifenol oksidase yang

menyebabkan terjadinya oksidasi senyawa

fenol pada sampel.

Tahap kedua, yaitu ekstraksi yang

meliputi penggunaan senyawa pengekstrak

dan pengendapan RNA. Pengekstrak P:C:I

(25:24:1) dan C:I (24:1) berfungsi

memisahkan lemak, protein, glukosa, dan

kontaminan DNA. Pengendapan RNA

dilakukan dengan penambahan Na-asetat dan etanol absolut. Tahap selanjutnya merupakan

pemurnian dengan penambahan LiCl 8M dan

pencucian dengan etanol 70%. Isolasi harus

dikerjakan secara hati-hati karena RNA sangat

sentitif terhadap panas dan keberadaan RNAse

dapat mendegradasi RNA.

Kosentrasi dan Kemurnian RNA Total

Hasil Isolasi Uji kuantitatif dengan spektrofotometer

UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dapat diamati pada Tabel 1. Konsentrasi

RNA hasil isolasi berdasarkan pengukuran

pada λ 260 nm, nilai 1 unit absorban

sebanding dengan μg/ml RNA (Wilson &

Walker 2000). Berdasarkan Sambrook et al

(1989) konsentrasi RNA didapat dari

perkalian nilai absorban dengan faktor

pengenceran dan 40 μg/ml.

Kosentrasi RNA total pada semua sampel

berkisar antara 344-884 ng/μL. Hasil

pengukuran kemurnian RNA menggunakan

spektrofotometer menunjukkan bahwa rasio serapan pada λ 260/280 umumnya lebih besar

dari 1.7 kecuali pada DA sebesar 1.420 ng/μL.

Perbandingan serapan pada λ 260/280

menunjukkan kemurnian RNA terhadap

kontaminan protein. Perbandingan 1.80

hingga 2.00 menunjukkan kemurnian yang

cukup baik dan sedikitnya kontaminan protein

dalam larutan ekstrak RNA (Boyer 1986).

Hal ini menunjukkan sedikitnya kontaminasi

7

Tabel 1 Konsentrasi dan kemurnian RNA

total hasil isolasi

Sampel Konsentrasi

(ng/μL)

Kemurnian

260/280 260/230

DA 344 1.464 1.258

DN 264 1.711 1.579

BA 884 1.871 1.763

BN 672 2.053 2.011 Ket : DA : Daun kelapa sawit abnormal

DN : Daun kelapa sawit normal

BA : Bunga abnormal

BN : Bunga normal

protein pada larutan RNA baik dari daun

maupun bunga kelapa sawit

Ditinjau dari rasio serapan pada λ

260/230 umumnya lebih besar dari 1.5 kecuali

DA sebasar 1.258 ng/μL. Perbandingan yang

diharapkan lebih besar atau sama dengan 1.80

(Luebbehesun 2004), maka diketahui RNA

yang diekstrak terkontaminasi polisakarida. Kemungkinan hal ini disebabkan tingginya

kandungan serat pada buah kelapa sawit.

Ketidakakuratan pengukuran konsentrasi

karena spektrofotmeter UV pada λ 260 nm

mengukur RNA dan DNA (Sambrook et al

1989) secara total sehingga kontaminan DNA

pun terbaca. Oleh karena itu diperlukan

konfirmasi lebih lanjut untuk mengetahui

konsentrasi RNA yang sebenarnya

menggunakan visualisasi dengan gel agarosa.

Kualitas RNA Total Hasil Isolasi

Analisis kualitatif RNA total diamati

menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%.

Gambar 4 menyajikan hasil elektroforesis

RNA total yang diisolasi dari daun dan bunga

kelapa sawit normal dan abnormal.

Penggunaan konsentrasi RNA dalam jumlah

yang sama (250 ng) untuk setiap sampel pada

elektroforesis gel agarosa bertujuan

mengetahui kesamaan kualitas intensitas

masing-masing sampel. Intensitas pita RNA

yang dihasilkan dapat mengkonfirmasi nilai konsentrasi hasil perhitungan dengan

spektrofotometer sehingga diketahui

konsentrasi RNA hasil isolasi yang

sebenarnya.

Sampel DA dan DN pada visualisasi

dengan gel agarosa memiliki intensitas setiap

Gambar 4 RNA daun dan bunga kelapa sawit

pita lebih tebal dibandingkan dengan intesitas

pita BA dan BN. Namun pengukuran

spektrofotometer (Tabel 1) DA dan DN

memiliki konsentrasi lebih rendah.

Perbedaan intensitas pita ini

menunjukkan konsentrasi RNA yang beragam

pada masing-masing sampel, hal ini perlu

diperhatikan karena akan mempengaruhi hasil

uji ekspresi. Intensitas pita yang dihasilkan

merupakan visualisasi dari jumlah konsentrasi

yang sama pada masing-masing sampel (250 ng). Penggunaan konsentrasi RNA pada uji

ekspresi dengan metode RT-PCR memerlukan

konsentrasi RNA yang sama karena akan

mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk.

Hasil elektroforegram RNA total

menunjukkan adanya 2 (dua) pita RNA yang

dominan pada RNA total yang diisolasi dari

daun maupun bunga kelapa sawit abnormal

dan normal yang kemungkinan adalah RNA

ribosomal (rRNA) 28S dan 18S (Gambar 4).

Hal ini menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi

sehingga sangat baik digunakan sebagai

cetakan untuk sintesis cDNA total. Selain itu

juga menunjukkan bahwa RNA yang diisolasi

tidak mengalami degradasi.

Berdasarkan Gambar 4 dan Tabel 1

tersebut diduga bahwa RNA hasil isolasi

dapat digunakan untuk analisis ekspresi

gennya dengan metode RT-PCR. Pada

penelitian ini digunakan RT-PCR melalui

pembentukan first strand cDNA terlebih dahulu baru kemudian diteruskan dengan

proses PCR.

Sintesis cDNA dan Amplifikasi Gen

EGAD1, AG2, dan SQUA1

Penelitian ini menggunakan kit Super

ScriptTM First-Strand cDNA Synthesis

(Invitrogen). Reaksi dimulai dengan

penambahan primer oligo(dT), primer ini akan

berpasangan dengan adenin pada mRNA (ekor

poli A). Komponen nukleotida (dNTPs)

dengan bantuan reverse transcrptase berpasangan dengan basa komplemennya

pada mRNA sehingga terbentuk utas pertama

cDNA. Proses selanjutnya mRNA dipisahkan

dari hibrid (mRNA-cDNA) dengan cara

mendegradasi mRNA menggunakan enzim

RNaseH.

Sebelum cDNA digunakan dalam PCR

terlebih dahulu diukur konsentrasinya (Tabel

2). Penggunaan konsentrasi cDNA pada uji

ekspresi dengan metode RT-PCR memerlukan

konsentrasi cDNA yang sama karena akan mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk.

28S

18S

8

Sebanyak 600ng cDNA diamplifikasi

menggunakan PCR. Teknik ini digunakan

untuk mendeteksi gen AG2, SQUA1, dan

EGAD1 bunga dan daun kelapa sawit normal

dan abnormal menggunakan primer spesifik

gen EGAD1, AG2, dan SQUA1 kelapa sawit

yang telah dirancang pada penelitian

sebelumnya. Primer EF digunakan sebagai

kontrol.

Elongation Factor (EF) adalah salah satu

house keeping enzim yang berfungsi pada proses sintesis protein. Oleh karena itu, gen

penyandi EF banyak digunakan sebagai

kontrol dalam reaksi RT-PCR untuk studi

ekspresi suatu gen. Enzim tersebut akan

terekspresi terus menerus (konstitutif) dalam

jumlah yang sama pada setiap sel karena EF

mampu meningkatkan kerja enzim polimerase

dan menekan penghentian proses transkripsi

(Lehninger 1992).

Tabel 2 Konsentrasi dan kemurnian cDNA

total dari organ reproduktif dan vegetatif kelapa sawit

Sampel Konsentrasi

(ng/μL)

Kemurnian

260/280 260/230

DA 459.54 1.506 1.661

DN 472.86 1.561 1.700

BA 546.12 1.473 1.643

BN 542.79 1.492 1.633

Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1

pada Daun Kelapa Sawit

Uji ekspresi pada penelitian ini dilakukan

menggunakan teknik RT-PCR. Sampel yang

diuji merupakan sampel daun kelapa sawit

abonormal dan normal. Molekul cDNA hasil

sintesis selanjutnya diamplifikasi dengan

primer AG2, SQUA1, dan EGAD1. Molekul

DNA hasil RT-PCR selanjutnya

dielektroforesis pada agarosa 2%.

Tingkat ekspresi setiap gen diamati

melalui perbedaan intesitas pita yang

dihasilkan oleh masing-masing sampel pada

agarosa. Intensitas berbanding lurus dengan

ekspresi gen. Intensitas pita hasil

elektroforesis dikuantifikasi dalam satuan

ng/mL menggunakan perangkat lunak UnScan gel IT. Perangkat lunak ini menbandingkan

piksel pita sampel dengan piksel standar

(marker yang telah diketahui konsentrasinya)

sehingga didapat konsentrasi pita sampel.

Pita DNA yang dihasilkan pada Gambar 5

merupakan elektroforegram hasil RT-PCR

pada daun kelapa sawit abnormal dan normal

menggunakan primer EF (sebagai kontrol),

EGAD1, dan SQUA1. Perbedaan intesitas pita

setiap gen pada setiap sampel menunjukkan

tingkat ekspresi yang berbeda. RT-PCR untuk AG2 pada daun yang diteliti tidak

menghasilkan amplikon baik dari kelapa sawit

abnormal maupun normal. Ini menguatkan

laporan Adam et al (2007) yang menyatakan

gen AG2 tidak terekspresi pada daun kelapa

sawit.

Secara visual tampak bahwa akumulasi

mRNA EGAD1 daun kelapa sawit abnormal

memiliki intensitas infloresen lebih rendah

dibandingkan dengan daun kelapa sawit

normal dengan ukuran sekitar 300 bp. Akumulasi transkrip mRNA EGAD1 pada DA

dan DN secara berurutan sebesar 5.82 ng/mL

dan 15.96 ng/mL (Tabel 3). Ini menguatkan

hasil penelitian Karunanandaa et al (1994)

Gambar 5 Elektroforegram hasil RT-PCR pada daun kelapa sawit abnormal dan normal (M :

Marker 1 kb plus DNA ladder; 1: kontrol EF; 2 : gen EGAD1; 3 : gen SQUA1; DA :

daun kelapa sawit abnormal ; DN : daun kelapa sawit normal).

500 bp

400 bp

300 bp

200 bp

9

yang menyebutkan bahwa gen EGAD1

terdapat pada keseluruhan jaringan tanaman.

Ekspresi SQUA1 pada daun kelapa sawit

memiliki pola yang sama dengan ekspresi

EGAD1. Dimana daun kelapa sawit abnormal

memiliki ekspresi yang lebih rendah

dibandingkan dengan ekspresi daun kelapa

sawit normal. Hal ini didukung hasil

kuantifikasi UnScan gel IT, kuantitas DA

sebesar 51.59 ng/mL dan DN sebesar 80.20

ng/mL (Tabel 3). Masiero et al (2002) dan Fornara et al (2004) menyatakan gen ini

diekspresikan pada daun tanaman. Adam et al

(2006) menyebutkan akumulasi mRNA

SQUA1 kelapa sawit terdapat pada daun

namun akumulasinya sangat rendah.

Nilai kuantitas didapatkan dari hasil

perbandingan nilai kuantitas gen dengan nilai

kuantitas EF. Pola nilai kuantitas melihat

kekonsistenan pola ekspresi setiap gen pada

daun kelapa sawit abnormal maupun daun

kelapa sawit normal. Hasil nilai kuantitas menunjukkan bahwa daun kelapa sawit

abnormal lebih rendah dibandingkan daun

kelapa sawit normal baik pada ekspresi

EGAD1 maupun SQUA1. Ini menunjukkan

ekspresi EGAD1 dan SQUA1 konsisten pada

daun kelapa sawit.

Tabel 3 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi

EGAD1 dan SQUA1 pada daun

kelapa sawit normal dan abnormal

dengan program UnScan gel IT

Sampel

Akumulasi

EGAD1

(ng/mL)

Akumulasi

EF (ng/mL)

Nilai

Kuantitas

(EGAD1/EF)

DA 5.82 68.03 0.08

DN 15.96 44.42 0.36

Sampel

Akumulasi

SQUA1

(ng/mL)

Akumulasi

EF (ng/mL)

Nilai

Kuantitas

(SQUA1/EF)

DA 51.59 68.03 0.76

DN 80.20 44.42 1.80

Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1

pada Bunga Kelapa Sawit

Analisis ekspresi EGAD1, AG2, dan

SQUA1 pada bunga kelapa sawit sama halnya

dengan analisis ekspresi pada daun kelapa

sawit. Elektroforegram (Gambar 6)

menunjukkan adanya ekspresi EGAD1, AG2,

dan SQUA1 pada bunga kelapa sawit

abnormal maupun normal. Kisaran ukuran

EGAD1, AG2, dan SQUA1 yang dihasilkan

secara berurutan sekitar 300 bp, 500 bp dan

400 bp.

Akumulasi transkrip mRNA EGAD1 pada

bunga abnormal memiliki intensitas infloresen

yang lebih tinggi dibandingkan bunga normal.

Hasil kuantifikasi EGAD1 yaitu BA memiliki

konsentrasi sebesar 130.55 ng/mL dan BN

sebesar 105.77 ng/mL (Tabel 4). Ini

menguatkan laporan Treager et al (2002) yang

menyatakan akumulasi transkrip mRNA

EGAD1 pada infloresen bunga abnormal lebih

tinggi dibandingkan dengan bunga normal.

Akumulasi transkrip EGAD1 bunga

abnormal dan normal berbeda-beda dapat

disebabkan interaksi dengan hormon tumbuh, yang dimulai dari tingkat kalus (Eeuwens et al

2002). Pada bunga kelapa sawit sebagai organ

reproduksi, tingkat ekspresi EGAD1 dapat

tergganggu oleh mikroorganisme. EGAD1

menyandi protein yang melindungi organ

reproduksi tanaman dari serangan

mikroorganisme (Karunanandaa et al 1994).

Berbeda dengan daun, AG2 terekspresi

pada bunga abnormal dan normal. Adam et al

(2007) menyebutkan AG2 terkspresi pada

bunga kelapa sawit. Akumulasi transkrip mRNA AG2 pada bunga abnormal memiliki

intensitas infloresen lebih tinggi dibandingkan

dengan bunga normal. Nilai kuantitas yang

didapatkan yaitu BA sebesar 174.20 ng/mL

dan BN sebesar 151.01 ng/mL (Tabel 4).

Hasil ini sesuai dengan hasil penelitian Riyadi

(2008) yang menyatakan ekspresi AG2 yang

dihasilkan organ reproduktif abnormal lebih

tinggi dibandingkan pada organ normal.

Adam et al (2007) menyebutkan gen AG2

pada kelapa sawit terlibat dalam kontrol indentitas organ bunga jantan dan bunga

betina. Jika akumulasi gen AG2 pada bunga

menjadi lebih tinggi akan terganggunya

kontrol identitas organ reproduktif terutama

kontrol bunga jantan sehingga menyebabkan

Tabel 4 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi

EGAD1, AG2, dan SQUA1 pada

bunga kelapa sawit normal dan

abnormal dengan program UnScan

gel IT

Sampel

Akumulasi

EGAD1

(ng/mL)

Akumulasi

EF (ng/mL)

Nilai

Kuantitas

(EGAD1/EF)

BA 130.55 145.79 0.89

BN 105.77 141.28 0.74

Sampel Akumulasi

AG2(ng/mL)

Akumulasi

EF (ng/mL)

Nilai

Kuantitas

(AG2/EF)

BA 174.20 145.79 1.20

BN 151.01 141.28 1.06

Sampel

Akumulasi

SQUA1

(ng/mL)

Akumulasi

EF (ng/mL)

Nilai

Kuantitas

(SQUA1/EF)

BA 120.72 145.79 0.80

BN 94.75 141.28 0.67

10

abnormalitas (Coen & Mayerowitz 1991 &

Taiz & Zeiger 2002). Dimana menurut Corley

et al (1986) abnormalitas berupa terbentuknya

rangkaian bunga jantan andromorphic dan

buah mantled sebagai akibat adanya kesalahan

fungsi dari organ-organ reproduksi.

Gen AG2 dan EGAD1, memiliki

hubungan pengaturan terhadap organ

reproduktif dari tumbuhan (Karunanandaa et

al 1994, Coen & Mayerowitz 1991, dan Taiz & Zeiger 2002). Dengan demikian adanya

gangguan mikroorganisme dapat juga

menyebabkan ekspresi AG2 terganggu.

Akumulasi transkrip mRNA SQUA1 pada

bunga kelapa sawit abnormal dan normal

menguatkan hasil penelitian Adam et al

(2006), yang menyebutkan SQUA1

terekspresi pada bunga kelapa sawit. Hasil

yang diperoleh intensitas infloresen bunga

abnormal lebih tinggi dibandingkan dengan

bunga normalnya. Kuantitas yang dimiliki

hasil oleh BA sebesar 120.72 ng/mL sedangkan kuantitas BN sebesar 94.75 ng/mL.

Adam et al (2007) gen SQUA1 pada

kelapa sawit banyak ditemukan pada stamen

dan petal. Gen SQUA1 merupakan gen tipe A

pada MADS-Box sehingga diduga jika gen ini

ekspresi berlebihan maka dapat terjadi bunga

fertil yaitu tidak memiliki bunga jantan

maupun betina.

Pola kuantitas ekspresi EGAD1, AG2, dan

SQUA1 bunga kelapa sawit memiliki pola

yang sama, yakni bunga abnormal memiliki tingkat ekspresi yang lebih tinggi

dibandingkan bunga normal. Pola ini sama

dengan nilai kuantitas (konsentrasi akumulasi

setiap gen dibandingkan dengan konsentrasi

akumulasi kontrol EF). Pola nilai kuantitas

dari EGAD1, AG2, dan SQUA1 yakni bunga

abnormal memiliki nilai kuantitas lebih tinggi

dibandingkan nilai kuantitas bunga normal.

Ini menyakinkan bahwa ekspresi dari gen

EGAD1, AG2, dan SQUA1 konsisten pada

bunga kelapa sawit.

Akumulasi transkrip gen EGAD1, AG2, dan SQUA1 yang berbeda antara bunga

abnormal dan bunga normal diduga terkait

dengan metilasi sekuen spesifik DNA

genomik. Mathhes et al (2001)

mengemukakan bahwa adanya korelasi antara

hipometilasi dan variasi somaklonal

pembungaan mantled pada kelapa sawit.

Hipometilasi menyebabkan struktur kromatin

menjadi longgar sehingga memudahkan

terjadinya transkrip. Dengan demikian

akumulasi transkripsi yang dihasilkan lebih

banyak dan ekspresi gen meningkat (Griffths et al 2000).

SIMPULAN DAN SARAN

Ekspresi gen EGAD1 dan SQUA1 pada

daun kelapa sawit abnormal lebih rendah

dibandingkan dengan daun kelapa sawit normal. Tidak ditemukan akumulasi mRNA

AG2 pada daun kelapa sawit abnormal dan

normal. Ekspresi gen EGAD1, AG2, dan

SQUA1 pada bunga abnormal lebih tinggi

dibandingkan dengan bunga normal.

Gambar 6 Elektroforegram hasil RT-PCR pada bunga kelapa sawit abnormal dan normal (M :

Marker 1 kb plus DNA ladder; 1: kontrol EF; 2 : gen EGAD1; 3 : gen AG2; 4 :gen

SQUA1; BA : bunga kelapa sawit abnormal; BN : bunga kelapa sawit normal).

500 bp

400 bp

300 bp

200 bp

11

Saran yang diajukan adalah perlu

dilakukannya analisis akumulasi gen EGAD1,

AG2, dan SQUA1 pada organ vegetatif dari

tanaman kelapa sawit muda dan pembibitan

untuk mengkonfirmasi kuantitas pola

ekspresinya.

DAFTAR PUSTAKA

Adam H et al. 2006. MADS Box Genes in Oil

Palm (Elaeis guineensis): Patterns in

the Evolution of the SQUAMOSA,

DEFECIENS, GLOBOSA,

AGAMOUS, and SEPALLATA

Subfamilies. J Mol Evol 62:15-31.

Adam H et al. 2007. Functional

characterization of MADS box genes involved in the determination of oil

palm flower structure. J Exp Bot

58:1245-1259.

[Anonim]. 2009. Volume Ekspor CPO RI

Naik Tajam Agustus [terhubung

berkala]. http://detiklagi.com [20 Jan

2010].

Bao X, Franks RG, Levin JZ & Liu Z. 2004.

Repression of AGAMOUS by

BELLRINGER in Floral and

Inflorescene Meristems. Plant Cell

16:1478-1489.

Chaidamsari T et al. 2006. Isolation and

characterization of an AGAMOUS

homologue from cocoa. Plant Sci

170:968-975.

Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple

and efficient method for isolating

RNA from pine trees. Plant Mol Biol

Rep 11:113-116.

Coen ES, Meyerowitz. 1991. The war of the

whorls: genetic interactions

controlling flower development. Nat 353:31-37.

Coen ES, Carpenter R. 1993. The

metamorphosis of flowers. Plant Cell

5:1175-1181.

Colombo L et al. 1995. The petunia MADS-

box gene FBP11 determines ovule

identity. Plant Cell 7:1859–1868.

Corley RHV, Gray BS. 1976. Growth and

Morphology. In. Corley RHV, JJ

Hordon, BJ Wood (eds).

Development in crop science 1- oil

palm research. Amsterdam: Elsevier

Scientific.

Corley RHV. 1976. The Genus Elaeis. In.

Corley RHV, JJ Hordon, BJ Wood

(eds). Development in crop science

1-oil palm research. Amsterdam:

Elsevier Scientific.

Corley RHV, Lee CH, Law LH, Wong CY.

1986. Abnormal development in oil

palm clones. The Planter Kuala

Lumpur 62:233-240.

Euweens CJ et al. 2002. Effects of Tissue

Culture Conditions during Embroid

Multiplication on The Incidence of

“Mantled” Flowering in Clonally

Propagated Oil Palm. Plant Cell

Tissue and Organ Culture 70:311-

323.

Ditta G, Pinyopich A, Robles P, Pelaz S,

Yanofsky MF. 2004. The SEP4 gene

of Arabidopsis thaliana functions in

floral organ and meristem identity. Curr Biol 14:1935–1940.

Fornara F et al. 2004. Functional

characterization of OsMADS18,

amember of the AP1/SQUA

subfamily of MADS box genes.

Plant Physiol 135:2207–2219.

Glick BR, Pasternak JJ. 1994. Molecular

Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA.

ASM Pr. Washington. p. 19-22; 34;

71-75.

Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT,

Lewontin RC, Gelbart WM. 200. An

introduction to Genetic Analysis.

Edisi ke-7. Freeman WH. New York.

359-360.

Honma T, Goto K. 2001. Complexes of

MADS-box proteins are sufficient to

convert leaves into floral organs.

Nature 409:525–529.

Jaligot E, Rival E, Beulẻ T, Dussert S,

Verdeil JL. 2000. Somaclonal

Variation in Oil Palm (Elaeis guineensis Jacq.): The DNA

Methylation Hypothesis. Plant Cell

Rep 19:684-690.

Kaeppler SM, Phillips SR. 1993. Tissue

Culture-Induced DNA Methylation

Variation in Maize. In Proceedings

of National Academy of Sciences.

USA 90:8773-8776.

12

Karunanandaa B, Singh A, Kao T H. 1994.

Characterization of predominantly

pistil-expressed gene encoding a γ-

thionin-like protein of Petunia

inflate. Plant Mol Biol 26:459-464.

Lubis AU. 1992. Kelapa Sawit (Elaeis

guineensis Jacq.) di Indonesia. Pusat

Penelitian Perkebunan Marihat-

Bandar Kuala, Sumatera Utara.

422hal.

Masiero S et al. 2002. Ternary complex formation between MADS-box

transcription factors and the histone

fold protein NF-YB. J Biol Chem

277:26429–26435.

Matthes M, Singh R, Cheah SC, Karp A.

2001. Variation in Oil palm (Elaeis

guineensis Jacq.) Tissue Culture-

Derived Regenerats Revealed by

AFLPs With Methylation-Sensitive

Enzyms. TAG 102:971-979.

Mizukami Y, H Ma. 1997. Determination of Arabidopsis Floral Meristem Identity

by AGAMOUS. The Plant Cell

9:393-408.

Ng M, Yanofsky. 2001. Activation of

Arabidopsis by APETELA1. Plant

Cell 13:739-753.

Okayama H, Berg P. 1982. High efficiency

cloning of full-length cDNA. Mol

Cell Biol 2:161.

Pahan I. 2006. Panduan Lengkap Kelapa

Sawit: Manajemen Agribisnis dari Hulu hingga Hilir. Penebar Swdaya:

Jakarta. Hal. 68-78.

Pelaz S et al. 2000. B and C floral organ

identity function require Asepallata

MADS-box genes. Nature 405:200-

203.

Pinero M, Coupland G. 1998. The Control of

Flowering Time and Floral Identity

in Arabidopsis. Plant Physiol. 117:

1-8.

Pinyopich A et al. 2003. Assessing the

redundancy of MADS-box genes during carpel and ovule

development. Nature 424:85-88.

Rival A et al. 1998. Suitability of RAPD

Analysis for The Detection of

Somaclonal Variants in Oil Palm

(Elaeis guineensis Jacq.). Plant

Breeding 117:73-76.

Riyadi I. 2008. Studi ekspresi gen penyandi

AGAMOUS dan LEAFY tanaman

kelapa sawit (Elaeis guineensis

Jacq.) normal dan abnormal hasil

kultur jaringan [tesis]. Bogor:

Program Pascasarjana, IPB.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.

Molecular Cloning a Laboratory

Manual. Ed ke-2. New York: Cold

Spring Harbor Laboratory.

Santoso D et al. 2004. Molecular and genetic engineering studies toward

improvement of cacao bean

production. RUTi ANNUAL

REPORT 2004, IBRIEC-PRI, 54p.

Suwito. 2007. Kebutuhan Dukungan

Kebijakan, Pendanaan dan

Teknologi Terkini untuk Revitalisasi

Perkebunan Kelapa sawit. Seminar,

Pameran da Promosi Inovasi

Teknologi Perkebunan 2007 untuk

Mendukung Revitalisasi Perkebunan, 20-21 November 2007. Jakarta.

Taiz L, Zeiger E. 2002. Plant Physiology.

Sinauer Associate Inc. p:559-589.

Theissen G. 2001. Development of floral

organ identity: stories from the

MADS house. Curr Opin Plant Biol.

4:75–85.

Tregear JW et al. 2002. Characterization of a

Defensin Gene Expressed in Oil

Palm Inflorescence: Induction

During Tissue Culture and Possible Association with Epigentic

Simaclonal Variaton Events. Exp

Botany 53:1387-1396.

Wilkins TA, Smart LB. 1996. Ioslation of

RNA from plant tissue. Di dalam: A

Laboratory Guide to RNA Isolation,

Analysis and Synthesis. Kreig PA,

editor. New York: Wiley-Liss Inc.

Wilson K, Walker J. 2000. Principles and

Techniques of Practical

Biochemistry. UK: Cambrige

University.

LAMPIRAN

14

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Isolasi RNA

Uji kualitatif dan

kuantitatif RNA total

Sintesis utas pertama

complementary DNA

(cDNA)

Amplifikasi cDNA

dengan primer

EGAD1.2, AGAMOUS

dan SQUA

Analisis ekspresi dengan

UnScan gel IT

15

Lampiran 2 Pembuatan buffer ekstraksi

Trizma base 2.4228g + LiCl

1.2717g + EDTA 0.3722g

Larutkan dengan 80mL

akuades

pH diatur menjadi 8.5

dengan HCl pekat

Tera ke labu takar 100mL

dan di homogenkan

Letakkan di

pengaduk magnetik

Di pindahkan ke botol

larutan

Di tambahkan PVP 1%

(w/v)

Sterilasi dengan

autoclave

Sesaat sebelum di gunakan 70 mL larutan

ditambahkan Thiourena 0.0266g,

aurinitrikarboksilat 0.0294g dan 2-

Merkaptoetanol 700µL

16

Lampiran 3 Prosedur elektroforesis gel agarosa (Sambrook et al. 1989)

0.15 gram (untuk 0.5%) atau 0.3 gr (untuk 1 %) atau 0.45 gr

(untuk 1.5%) agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 30 mL

bufer TBE 0.5x. Pemanasan dilakukan untuk membantu

pelarutan.

Larutan didiamkan hingga cukup hangat.

EtBr sebanyak 1.5 µL

ditambahkan

Larutan dituang dalam cetakan

yang telah disusun bersama

sisirnya.

Setelah gel memadat,

sisir diambil

17

Lampiran 4 Kompisisi mix untuk sintesis cDNA

Komposisi sampel (2µg RNA) µL

DNTPs 1

Oligo dT 1

DEPC x

Total 10

Komposisi mix (2µg RNA) µL

Buffer 2

2.5mM MgCl2 4

0.1M DTT 2

RNAse out 1

Lampiran 5 Komposisi mix untuk amplifikasi dengan PCR (cDNA 600ng)

Komposisi mix µL

Buffer 3

MgCl2 1

dNTPs 0.6

Taq polymerase 0.3

Primer F 1

Primer R 1

NFW x

Total 30

Lampiran 6 Susunan nukleotida primer dan kondisi PCR untuk analisis ekspresi

Primer Susunan nukleotida Suhu Anealing

(ºC) Jumlah silklus

PCR

EGAD1-F 5‟-CTGAGCGTGTGTTAGCTAGTGTGTT-3‟ 55 35

EGAD1-R 5‟-TACCACAAAGGATAGAACAGAGCAAC-3‟

SQUA-F 5‟-ACTGCAGGAGCAGAACAAGATGC-3‟ 65

25 (Bunga) 35 (Daun) SQUA-R 5‟-CACTTAAGGTTCCCACAGCCCC-3‟

AG-F 5‟TGATGGGAGATTCTCTTGGCTCC-3‟ 65 35

AG-R 5‟ATGAAAGGCTACCAACTCGGGC-3‟