Analisis antioksidan & orac

ANALISIS ANTIOKSIDAN

METODE ANALISIS ANTIOKSIDANMetode Kualitatif

Uji Warna Spektrofotometri IR

Metode Kuantitatif DPPH (Diphenyl pycril Hidrazil) Metode ORAC (Oxygen Radical Absorbance

Capacity) Iodimetri dan iodometri

Metode In vivo dengan hewan coba

UJI WARNA

Merupakan suatu metode kualitatif untuk menentukan keberadaan suatu antioksidan dengan mereaksikan suatu sampel dengan reaktan tertentu sehingga menunjukkan sifat fisik berupa perubahan warna tertentu sebagai indikator.

UJI WARNA PADA ASAM ASKORBAT (VITAMIN C)

Asam Askorbat + Perak nitrat (amoniakal ) Hitam

Asam Askorbat + Pereaksi Benedict Merah

Asam Askorbat + Larutan Iodium (coklat – ungu ) Warna Hilang (bening)

SPEKTROSKOPI IR (INFRA RED)

Merupakan metode analisis suatu gugus fungsi dari suatu senyawa berdasarkan serapannya terhadap sinar infra merah yang diberikan.

Cara kerja alat ini adalah dengan mengukur serapan infra merah pada suatu gugus fungsi, dimana tiap gugus fungsi mempunyai daerah serapan yang berbeda-beda.

DATA DAERAH RESAPAN IR

Dari data tersebut kita dapat mengdentifikasi gugus fungsi yang terdapat dalam suatu senyawa yang diuji.

STRUKTUR ANTIOKSIDAN

METODE ORAC Digunakan untuk menganalisis kandungan suatu

senyawa antioksidan dari suatu benda, misalnya makanan.

Pada metode ORAC, digunakan fluorescent sebagai bahan uji selain sampel yang digunakan.

Metode ini menggunakan mesin azo-intitiator, suatu alat yang berfungsi untuk membuat radikal bebas, peroxyl.

Fluorescent ditembakkan dengan peroxyl, lalu dihitung intensitasnya selama selang waktu tertentu.

Lalu dibuatlah kurva intensitas vs waktu ( baik ataupun tanpa antioksidan), sehingga kita dapat menghitung luasan daerah diatara kedua kurva tersebut.

Kadar antioksidan ditentukan dengan standar TE, trolox equivalent, dengan trolox sebagai standarnya.

Perhitungan nilai ORAC dilakuakn dengan rumus berikut:

ORAC value (µM) = 20k (SSample - SBlank) / (STrolox - SBlank)

Dimana S merupakan daerah dibawah kurva dan k adalah konstanta peluruhan fluoescent.

KELEBIHAN ORAC DAN KEKURANGANNYA ORAC merupakan metode yang sangat akurat,

karena metode menggunakan pengukuran fluorescent, ehinga ketelitian dari metode ini pn semakin baik

Efisien Kekurangannya metode ini hanya menunjukkan

aktivitas teradap radikal bebas tertentu, seperti peroxyl, serta metode ini tidak dapat mnentukan sampel yang teah rusak, entah apapun sebabnya.

IODIMETRI

Merupakan metode titrasi langsung Metode kuantitatif karena berdasarkan jumlah I2 yang

dihasilkan antara sampel dengan ion iodida Perbedaan dengan iodometri

Iodometri titrasi tidak langsung Iod yang dibebaskan dalam reaksi kimia

CONT`D

Dalam proses analitik, iodium digunakan sebagai pereaksi

oksidasi (iodimetri) dan ion iodida digunakan sebagai pereaksi

reduksi (iodometri). Ada beberapa zat merupakan pereaksi reduksi yang cukup

kuat untuk dititrasi secara langsung dengan iodium.  Maka

jumlah penentuan iodimetrik adalah sedikit. Akan tetapi

banyak pereaksi oksidasi cukup kuat untuk bereaksi sempurna

dengan ion iodida, dan ada banyak penggunaan proses

iodometrik.

APLIKASI IODIMETRI

Penetapan kadar vitamin C cara Iodimetri Dasar: Kadar vitamin C yang ditetapkan secara iodimetri

menggunakan iod sebagai penitar. Vitamin C bersifat reduktor

kuat akan dioksidasikan oleh I2 dalam suasana asam dan I2

tereduksi menjadi ion iodide. Indikator yang digunakan adalah

kanji dengan titik akhir biru.

Reaksi :

Alat :                                                Bahan :a. Erlenmeyer Asah 250 ml             a. Contoh Iberet Folic-500b. Gelas Ukur 100 ml         b. H2SO4 10 %

c. Buret Scelbach 50 ml                    c. Larutan I2 0.05 Md. Pipet Tetes                                     d. Indikator Kanjie. Statip                                              e. Air Sulingf. Neraca Analitik

Cara Kerja :1)   Ditimbang contoh sejumlah Y gram kedalam Erlenmeyer asah.2)   Dilarutkan dengan air dan ditambahkan 25 ml H2SO4 10 %.3)   Dititrasi dengan I2 0,05 M dengan indikator kanji hingga titik akhir berwarna biru.

Perhitungan :Kadar Vit. C = Vp x Mp x BE Vit. C x 100 x Bobot rata –rata x 100%

PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN METODA DPPH

• DPPH (1,1-Difenil-Pikril-2-Hidrazil), merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak.• Adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.

Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning

• Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman

Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif, B = kontrol positif [rutin], dan C = larutan uji [fraksi air ekstrak etanolik daun selasih])

DPPH berperan sebagai radikal bebas yang diredam oleh antioksidan dari bahan uji, dimana DPPH akan bereaksi dengan antioksidan tersebut membentuk 1,1-difenil-2-pikrilhidrazyl. Reaksi ini menyebabkan perubahan warna dari ungu pekat menjadi kuning atau kuning gelap yang dapat diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada gelombang 517 nm, sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan.Pengujian DPPH dapat untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50).

• • IC50 adalah konsentrasi suatu zat antioksidan yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal bebas DPPH. Zat antioksidan yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi akan mempunyai nilai IC50 yang rendah• Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam persen penghambatan, yang dihitung dengan rumus:Persen penghambatan = Aktifitas antioksidan :

A blanko – A sampel x 100%A blanko

A blanko = serapan radikal DPPH 1mMA sampel = serapan radikal DPPH 1mM

Selanjutnya dibuat grafik antara konsentrasi sampel (x) dengan persen penghambatan (y). Nilai IC50 dihitung berdasarkan rumus persamaan regresi.Secara spesifik, suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan jika nilai IC50 kurang dari 200 ppm Jika nilai IC50 yang diperoleh berkisar antara 200-1000 ppm, maka zat tersebut kurang aktif namun masih berpotensi sebagai zat antioksidan (Molyneux, 2004).

Grafik antara konsentrasi sampel (x) dengan aktivitas antioksidan (y).

ORAC (OXYGEN RADICAL ABSORBANCE

CAPACITY ) KAPASITAS OKSIGEN RADIKAL ABSORBANSI

APAKAH ORAC ITU? Sebuah metode skoring yang dikembangkan

dan digunakan oleh USDA (Departemen Pertanian Amerika) di Tufts University

untuk mengukur kekuatan antioksidan total makanan dan minuman. Dengan kata lain, ORAC data menyediakan ukuran kemampuan antioksidan untuk mengikat radikal bebas.

Uji ORAC mengukur aktivitas antioksidan sebenarnya dari produk makanan, bahan makanan, produk pertanian, dan produk farmasi.

Tubuh manusia membutuhkan rata-rata ORAC 1500 Antioksidan setiap hari untuk bisa bekerja melawan oksidasi yang terjadi dalam sel.

Bahaya dari radikal bebas memberikan kontribusi besar terhadap proses penuaan dan penyakit dan masalah kesehatan lainnya.

Studi menunjukkan bahwa makanan dengan nilai ORAC yang lebih tinggi dapat membantu dalam melindungi tubuh kita dari penuaan dini dan penyakit.

Bukti menunjukkan bahwa asupan antioksidan harian ditingkatkan menjadi antara 3.000 sampai 5.000 unit ORAC atau lebih untuk memiliki dampak yang menguntungkan signifikan pada darah dan jaringan lain.

Pola makan kaya antioksidan membantu menetralkan radikal bebas dalam tubuh, menjaga sistem kekebalan tubuh yang kuat sementara memerangi segala sesuatu dari keriput pada penyakit jantung dan kanker.

METODE ORAC Pada metode ORAC, digunakan fluorescent

sebagai bahan uji selain sampel yang digunakan. Metode ini menggunakan mesin azo-intitiator,

suatu alat yang berfungsi untuk membuat radikal bebas, peroxyl.

BMG LABTECH’s FLUOstar OPTIMA

Fluorescent ditembakkan dengan peroxyl, lalu dihitung intensitasnya selama selang waktu tertentu.

Lalu dibuatlah kurva intensitas vs waktu ( baik ataupun tanpa antioksidan), sehingga kita dapat menghitung luasan daerah diatara kedua kurva tersebut.

Kadar antioksidan ditentukan dengan standar TE, trolox equivalent, dengan trolox sebagai standarnya.

Perhitungan nilai ORAC dilakukan dengan rumus berikut:

ORAC value (µM) = 20k (SSample - SBlank) / (STrolox - SBlank) Dimana S merupakan daerah dibawah kurva dan k

adalah konstanta peluruhan fluoescent.

KELEBIHAN ORAC DAN KEKURANGANNYA ORAC merupakan metode yang sangat akurat,

karena metode menggunakan pengukuran fluorescent, ehinga ketelitian dari metode ini pn semakin baik

Efisien Kekurangannya metode ini hanya menunjukkan

aktivitas teradap radikal bebas tertentu, seperti peroxyl, serta metode ini tidak dapat mnentukan sampel yang teah rusak, entah apapun sebabnya.

TENTANG NILAI KANDUNGAN ANTIOKSIDAN OLEH ORAC Kekuatan antioksidan pada

makanan selalu disamakan dengan nilai ORAC, sebuah analisis uji coba yang mengukur Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC).

Bagaimanapun juga yang penting untuk dipahami adalah kandungan antioksidan dalam sebuah makanan tidak sepenuhnya terhitung oleh ORAC, dan ini tidak mencerminkan kemampuannya mengubah status antioksidan dalam manusia.

Ketika tes ORAC menghitung aktivitas perubahan radikal bebas melawan salah satu jenis radikal bebas – radikal peroxyl – terdapat beberapa jenis radikal bebas dan sejumlah pengujian kadar logam yang mengukur aktivitas melawan radikal bebas.

Apalagi, yang terpenting dari antioksidan yaitu antioksidan adalah bioavailable, atau dapat diambil dan digunakan tubuh. Fitonutrien memiliki beberapa tingkatan bioavailability setelah dikonsumsi dan kemungkinan pengaruh biologis yang berbeda saat diserap tubuh.

Dengan sendirinya, nilai ORAC hanya sebagian gambaran dari kandungan anti-oksidan dan bukan indikasi dari jaminan kesehatan.

Bahaya dari radikal bebas memberikan kontribusi besar terhadap proses penuaan dan penyakit dan masalah kesehatan lainnya.

Studi menunjukkan bahwa makanan dengan nilai ORAC yang lebih tinggi dapat membantu dalam melindungi tubuh kita dari penuaan dini dan penyakit.

Bukti menunjukkan bahwa asupan antioksidan harian ditingkatkan menjadi antara 3.000 sampai 5.000 unit ORAC atau lebih untuk memiliki dampak yang menguntungkan signifikan pada darah dan jaringan lain.

METODA IN VIVO Tikus Wistar dibagi 4 kelompok : K0 = Kelompok kontrol Negatif = Normal K 1 = Kelompok Kontrol Positif KP1 = Kelompok Perlakuan Dosis 1 KP2 = Kelompok Perlakuan Dosis 2 Selama 14 hari setiap kelompok kecuali kontrol

negatif tikus diberi minyak jelantah 0,42 ml/200 gram BB, kandung peroksida = 118 mek / kg.

Minyak jelantah diberikan peroral sekali sehari pada siang hari menggunakan sonde l pada siang hari

Sampel (ekstrak) diberikan juga setiap hari pada KP1,KP2 dan K obat pada pagi hari

Akan terjadi ROS pada hati tkus akibat pemberian minyak jelantah yg tinggi peroksida/radikal bebas

Sampel berupa ekstrak herbal (antioksidan) sebagai perlakuan bgmn pengaruhnya ?? Dg melihat kadar MDA, SOD serum darah tikus setelah perlakuan selama 14 hari atau 28 hari

Pengujian Pre n Post Test dengan mengambil darah pada sinus orbital (mata) atau ekor tikus

Utuk mengukur stress oksidatif tubuh dapat ditentukan dengan malondialdehid (MDA). Semakin tinggi kadar MDA plasma maka semakin tinggi stress oksidatif yang terjadi dalam sel-sel tubuh