2 BS Ekspresi Gen

7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen

1/66

Ekspresi gen

(DNA RNAProtein)


2/66

Struktur DNA Ujung 5 rantai

ikatan fosfodiester

Basa-basa

Ujung 3 rantai

Ujung 5 rantai

Ikatan hidrogen Ujung 3 rantai


3/66


4/66


5/66

Ekspresi gen

Penyimpananinformasi

Penggunaaninformasi

Urutan nukleotida gen Urutan nontemplate strand


6/66


7/66

7

Sintesis RNA


8/66

8

RNA polimerase

Holoenzim : RNA polimerasedengan subunit yang lengkap

Core-enzyme:RNApolimerase tanpasubunit
http://www.rockefeller.edu/labheads/darst/images/holo.htmhttp://www.rockefeller.edu/labheads/darst/images/2cores.htm


9/66


10/66

Inisiasi transkripsi (2)

Kedua untai DNA terpisah

Sintesis RNA dimulai

Setelah ~ 10 nt, faktor lepas


11/66

Terminasi

transkripsi

RNA pol mencapai

terminator RNA pol lepas


12/66Figure 6-13 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)


13/66


14/66

14

Faktor sigma bakteri

Holoenzim RNA polimerase bakteri

2

Faktor digunakan untuk mengekspresisekelompok gen secara serentak

Faktor

Berperan mengenali promoter dari gen Terdapat beberapa macam faktor sigma

Masing-masing mengenali promoter yang

berbeda


15/66

15

Faktor sigma alternatif

Kejutan panas pada E. coli

Suhu naik, protein heat shock (hsp) disintesis (17 protein)

Promoter 70(standard) TTGAA(16-18).TATAAT

Promoter 32(hsp) T-C-C-C TTGAA(13-15)CCCAT-T-

Sporulasi pada Bacillus subtilis

Kondisi lingkungan tidak menguntungkan, terjadi sporulasi

Gen-gen untuk pertumbuhan vegetatif inaktif Gen-gen untuk pembentukan spora menjadi aktif akibat

aktifnya faktor-faktor sigma baru


16/66

16

Terminasi transkripsi

Ada dua jenis terminasi

Terminasi yang tidak tergantung Rho

(Rho-independent) Terminasi yang tergantung Rho (Rho-

dependent)

Rho adalah protein yang berperandalam proses terminasi transkripsi gen-gen E. colidan Phagenya


17/66

17

Terminasi yang tidak tergantungRho (Rho-independent)

Mekanisme terminasi membutuhkanstruktur hairpin dan diikuti dengan

poly(A) Struktur hairpin diduga merupakan

faktor yang dapat menarik RNA keluar

dan ikatan antara A-U (DNA-RNA)yang lemah dapat lepas


18/66


19/66

19

Model terminasi transkripsitergantung rho

Rho merupakan protein dengan6 subunit yang memilikiaktivitas ATPase sehingga Rho

dapat bergerak 5

3 Ketika RNA Pol sampai pada

terminator Sintesis RNA berhenti (ketika

hairpin disintesis)

Rho tiba di RNA pol Rho melepaskan RNA dari

hibrid DNA-RNA denganaktivitas helikase yangdimilikinya


20/66


21/66

21

Ekspresi gen dari promoter yangkuat dan dapat diregulasi

Transkripsi merupakan titik kontrol yang paling penting

Dikontrol oleh promoter dari gen

Dua sifat penting dari promoter

Kuat

Afinitas tinggi terhadap RNA polimerase

Ikatan kuat - sering ditranskripsi

Ikatan lemah - RNA polimerase lepas

tidak ada transkripsi

Dapat diregulasi

Kapan gen diekspresi dapat dikontrol

gunakan induser / ko-represor


22/66

22

Promoter yang penting dalambioteknologi

lac(atau lacUV5)

trp

tac (atau trc)

pLdari fag l

gen 10dari fag T7


23/66


24/66


25/66

25

Promoter tacdan trc

Hibrid dari promoter lacdan trp

daerah -35 dari trp

daerah -10 dari lac terpisah 16 pb = promoter tac

terpisah 17 bp = promoter trc

3x lebih kuat dari trp 10x lebih kuat dari lac


26/66


27/66


28/66


29/66


30/66

30

Promoter gen 10 fag T7

prolac Gen RNA PolT7

prog10 Gen target

Protein

target

InduserRNA PolT7

T7 RNA Pol


31/66


32/66

32

Promoter bocor Beberapa promoter tidak diinaktifkan secara tuntasmasih ada

ekspresi yang rendah

Disebut bocor (LEAKY)

Dapat disebabkan oleh mutasi pada represor atau urutan DNAoperator atau faktor lain

Dapat disebabkan oleh jumlah kopi promoter vs. Gen represor

Gen pada plasmid multikopi dikontrol oleh represor yang dikodeoleh satu kopi gen pada kromosom

Untuk promoter lacmultikopi yang bocor

Letakkan di dalam sel dengan mutasi lacIq

lacIqmerupakan mutasi pada promoter gen lacI

Menyebabkan produksi protein represor Lac I yang tinggi akibat

peningkatan transkripsi


33/66


34/66

Yang mempengaruhi kekuatanpromoter

Sequence

Daerah -10:

Daerah -35:

Spacerantara daerah -10 dengan daerah -35:

Daerah -20 s/d -13 promoter lac yang kaya GCdiganti dengan sequence yang kaya AT,transkripsi meningkat 8 x

34


35/66


36/66

36

Prosestranslasi

Inisiasimemerlukan:

Subunit ribosomyang bebas

Faktor inisiasi


37/66

E i i il tRNA i t t


38/66

3838Figure 6-58 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)

Enzim aminoasil-tRNA sintetasemempunyai sisi pengikatan

spesifik untuk asam amino dantRNA


39/66


40/66


41/66

41

Faktor pelepasan

Prokariot RF1 : UAA, UAG

RF2 : UAA, UGA RF3 : protein pengikat GTP yang membantu

pengikatan RF1 & RF2 ke ribosom


42/66

42

Kodon

Urutan kodon pada mRNA Tidak tumpang tindih

Tidak ada loncatan Kodon terdiri dari tiga nukleotida

Kodon degenerate

Satu asam amino dapat dikode oleh lebihdari satu kodon

Kode genetik hampir universal


43/66

4343

Figure 6-50 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)

Kode genetika


44/66

44

Start kodon bakteri

> 90% = ATG

Bisa juga: TTG, GTG, CTG (semua mirip ATGdan mengkode fmet)

Untuk memastikan bahwa kodon di atas adalahstart kodon, cari urutan yang mirip denganSD/rbs (AGGAGGA) ~ 7 sampai 13 nt sebelahhulunya GTAACGAGGATAATGGAATG

http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm, 17-08-10)
http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htmhttp://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm


45/66


46/66

4646

Figure 6-51 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)

Tiga macam kerangka baca pada

mRNA


47/66

47

Kontrol ekspresi gen

Operon, atenuasi, perubahan faktorsigma

Vektor ekspresi pada E.coli


48/66

48

Kontrol ekspresi gen dapatterjadi pada tahap:

Transkripsi

Stabilitas mRNA

Pemrosesan mRNA pada eukariot

Translasi


49/66

49

Kontrol ekspresi gen bakteri

pada tahap transkripsi

Operon

protein represor dan aktivator

Atenuator Transkripsi dapat terhenti lebih awal akibat adanya

atenuator (terminator) di sebelah hulu (5) gen

Faktor sigma alternatif

Beberapa kondisi lingkungan memerlukanperubahan pola ekspresi gen secara keseluruhan


50/66

50

Operon

Gen-gen yang diperlukan untuk fungsi tertentuakan diekspresi bersamaan

Operon Regulasi transkripsi sekelompok gen pada prokariota

Dari satu promoter akan ditranskripsi satu mRNA yangmengandung > 1 gen (polycistronic)

Contoh Operon lac: Gen-gen untuk penggunaan laktosa

Operon trp: Gen-gen untuk sintesis triptofan


51/66

51

Komponen suatu operon

Trans acting (gen, tidak harus ada dalam DNA yang sama) Gen struktural

Gen yang mengkode protein/RNA

Gen regulator Gen struktural yang mengkode protein yang meregulasi ekspresi gen lain Terikat pada DNA pada sisi spesifik Represor: protein regulator yang bila terikat pada DNA, tidak terjadi

transkripsi Aktivator: protein regulator yang harus terikat pada DNA agar dapat

terjadi transkripsi

Cis acting (elemen genetik, harus ada dalam DNA yangsama) Promoter: Tempat pengikatan RNA polimerase Terminator: Tempat terminasi transkripsi Operator: Tempat pengikatan represor


52/66

52

Kontrol

positifdannegatif


53/66

53

Operon lac

Kontrol negatif

Represor lac

menghambat operonapabila tidak adalaktosa

Kontrol positif

Aktivator lacmengaktifkan operonapabila tidak adaglukosa

Ada glukosa dan laktosa dalam

medium pertumbuhan

Kontrol negatif operon lac


54/66

54

Kontrol negatif operon lac


55/66

55

Kontrol positif pada operon lac

Diatur oleh catabolite activator protein(CAP) bersama cAMP

[cAMP] turun bila ada glukosa

Operon lac: aktivator


56/66

56

Operon lac: aktivator

Kontrol positif: bila aktivator terikat DNA, baru terjadi

transkripsi Tidak ada glukosa ATP menjadi cAMPcAMP terikat CAP

(catabolite activator protein) CAP terikat DNA transkripsi

Ada glukosa CAP tidak dapat terikat DNA tidak terjadi

transkripsi

P ik t L I d


57/66

57

Pengikatan represor LacI padaoperator lac

Operator berbentuk palindrom (pengulangan terbalik) Ada > 1 operator

Afinitas dengan represor tinggi

O1 = -7 s/d +29 (axis simetri +11) Afinitas dengan represor rendah (pseudo-operator)

O2 = +410; O3 = -83)

Masing-masing dimer represor terikat pada 1 operator Tingkat represi dipengaruhi oleh jumlah operator

Tidak ada O2 atau O3 : represi menurun 2-4 x Tidak ada O2 dan O3 : represi menurun 100 x

Pengikatan represor pada operator Memperkuat pengikatan RNA pol (kompleks tertutup) Mencegah RNA pol menginisiasi transkripsi Represor lepas, transkripsi langsung dimulai (kompleks terbuka)


58/66

58

Operator lac

Operator = palindrom

Pengaruh ketiga operator


59/66

59

Represi =rasioaktivitas -galaktosi-dasedengan dantanpa

induser

Pengaruh ketiga operatorterhadap represor


60/66

60

Regulasi operon lac


61/66

61

Operon triptofan E. coli

Promoter trp Dikontrol oleh

represor trp- ko-represor (triptofan) represor yang disintesis dalam bentuk tidak

berfungsi kompleks represor-ko-represor dapat berfungsi

Hanya represor Gen diekspresi

Represor + Gen tidak diekspresi

ko-represor (trp)


62/66

62


63/66

63


64/66

Kontrol translasi

Ribosome Binding Site (RBS)

RBS Kuat: interaksi kuat dengan ribosom,

lebih sering ditranslasi RBS lemah: interaksi lemah dengan ribosom,

lebih jarang ditranslasi

Fungsi rbs dipengaruhi juga oleh sequencegen

bila terbentuk struktur sekunder antara gendengan rbs, gen tidak akan ditranslasi

64


65/66

RBS calculator

Menentukan perbedaan energibebas antara struktur sekunder

mRNA dengan mRNA yang telahterikat ribosom

Korelasi antara hasil prediksi

dengan hasil observasi belumcukup tinggi

65


66/66

Pustaka

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff,M., Roberts, K. & Walter P. (2008)Molecular Biology of the Cell, 5th ed.,

Garland Science, N.Y.

2 BS Ekspresi Gen

Documents