1 UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK KARANG LUNAK ...

1

UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK KARANG LUNAK Sarcophyton glaucum (Quoy & Gaimard)

TERHADAP SEL LESTARI TUMOR HeLa

Oleh: Thamrin Wikanta1), Yustia A. Zakaria2), Dian Ratih2). dan M. Nursid1)

ABSTRAK: Karang lunak Sarcophyton glaucum (Quoy & Gaimard) adalah salah satu karang Indonesian yang diduga berpotensi sebagai sumber bahan obat Telah dilakukan uji aktivitas sitotoksik dari ekstrak S. glaucum (Quoy & Gaimard) terhadap sel lestari tumor HeLa. Karang lunak dimaserasi dalam methanol, kemudian maserat disaring dan dievaporasi dalam rotavapor pada suhu dan tekanan rendah hingga kering. Pada ekstrak kasar kering yang didapatkan dilakukan uji golongan senyawa dan uji aktivitas antioksidan terhadap 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). Ekstrak kasar kering lalu difraksinasi dengan heksan, etil asetat, dan methanol, dan setiap fraksi dievaporasi kembali hingga kering. Terhadap ekstrak kasar dan setiap fraksi dilakukan uji toksisitas menggunakan metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dan uji sitotoksisitas terhadap sel lestari tumor HeLa menggunakan metoda 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromida (MTT). Hasil menunjukkan bahwa ekstrak S. glaucum (Quoy & Gaimard) mengandung golongan senyawa alkaloid. Ekstrak kasar bersifat toksik terhadap Artemia salina dengan nilai LC50 sebesar 83,79 μg/mL dan memiliki potensi antioksidan (442,48 μg/mL) lebih rendah dari pada vitamin C (9,13 μg/mL) sebagai kontrol positif. Potensi sitotoksisitas terhadap sel lestari tumor HeLa menggunakan metoda MTT menunjukkan bahwa ekstrak kasar memberikan nilai LC50 sebesar 50,69 μg/mL, sedangkan fraksi etil asetat memberikan nilai LC50 sebesar 22,18 μg/mL dan fraksi methanol memberikan nilai LC50 sebesar 45,52 μg/mL. Kata kunci: sitotoksisitas, etil asetat, Sarcophyton glaucum, sel lestari tumor HeLa. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------

1) Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Jakarta. 2) Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jakarta.

2

ABSTRACT: Cytotoxic activity test of Sarcophyton glaucum (Quoy & Gaimard)

extract against HeLa tumor cell line. By: Thamrin Wikanta1), Yustia A. Zakaria2), Dian Ratih2), and M. Nursid1)

Soft coral Sarcophyton glaucum (Quoy & Gaimard) is one of Indonesian corals that might be potential source of drug candidate. Tests on the cytotoxic activity of S. glaucum (Quoy & Gaimard) extract against HeLa tumor cell line has been conducted. Soft coral was macerated in methanol, then macerate was filtered and evaporated in rotary evaporator at low temperature and reduced pressure to dry. To the dried crude extract resulted was tested on compound group content and on the antioxidative activity against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). The dried crude extract was then fractionated with hexane, ethyl acetate, and methanol, and each fraction was reevaporated to dry. To the crude extract and each fraction was assayed its toxicity using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method and its cytotoxicity against HeLa tumor cell line using 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromida (MTT) method. The result showed that the S. glaucum (Quoy & Gaimard) extract contained alkaloid compound. The crude extract was toxic against Artemia salina with LC50 value of 83,79 μg/mL and its antioxidative potency (442,48 μg/mL) was lower than vitamine C (9,13 μg/mL) as a positive control. The cytotoxicity potency against HeLa tumor cell line using MTT method showed that the crude extract gave LC50 value of 50,69 μg/mL, while the ethyl acetate fraction gave LC50 value of 22,18 μg/mL and the methanol fraction gave LC50 value of 45,52 μg/mL. Key word: cytotoxicity, ethyl acetate, Sarcophyton glaucum, HeLa tumor cell line. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------

1) Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Jakarta. 2) Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jakarta.

3

PENDAHULUAN

Penyakit infeksi yang semula merupakan masalah utama di negara berkembang,

kini makin tergeser posisinya oleh penyakit degeneratif dan kanker, yang makin

menonjol. Berdasarkan data yang terkumpul pada rumah sakit kanker Yayasan Dharmais

pada periode 2001-2006, dari perkiraan 30 000 penderita di Indonesia terdapat sekitar 30

kasus per tahun. Hasil survei kesehatan rumah tangga menunjukkan bahwa kematian

akibat penyakit kanker makin meningkat pada setiap tahun, misalnya pada tahun 1972

sebanyak 1,3%, pada tahun 1981 sebesar 3,4%, dan pada tahun 1989 sebesar 4,5%.

Riwayat kematian penderita, awalnya bersifat asimptomatik (tanpa gejala) dan timbul

keluhan setelah terjadi metastasis, sehingga 60-70% penderita berada pada stadium lanjut

(Tjarita, 1979; Nafrialdi & Gan, 1995; Underwood, 1999; Tapan, 2005; Sudoyo, 2006).

Tumor atau neoplasma adalah massa sel abnormal yang terbentuk oleh sel-sel

yang tumbuh secara terus menerus, tidak terbatas, tidak terkoordinasi dengan jaringan

sekitarnya serta dapat mempengaruhi fungsi organ vital tubuh. Sel neoplastik dalam

tumor dapat bersifat benigna atau maligna. Tumor benigna cenderung tumbuh lebih

lambat dan sel-selnya tetap bersama atau menyatu, selalu dikelilingi oleh kapsul jaringan

ikat dan dapat dengan mudah diambil tindakan dengan operasi (Tapan, 2005; Nafrialdi

dan Gan, 1995; Tjarita, 1979; Sudoyo, 2006). Tumor maligna atau biasa disebut kanker,

tumbuhnya lebih cepat dari pada tumor benigna. Ia berasal dari jaringan ikat atau otot

dengan memiliki kemampuan yang unik yaitu bersifat invasif, dapat menembus dan

menyebar atau metastatis ke jaringan lain sehingga dapat menyebabkan kematian

penderita. Karakteristik dari kanker adalah terjadinya gangguan atau kegagalan dalam

mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostatis lainnya pada organisme

multiseluler (Anonim-1, 2006; Anonim-2, 2006; Underwood, 1999; Boik, 1995). Akibat

dari hal tersebut adalah sel mengalami pertumbuhan yang berlebihan, sel dan jaringan

mengalami gangguan differensiasi, bersifat invasif sehingga mampu tumbuh pada

jaringan di sekitarnya, bersifat metastatik atau menyebar ke tempat lain dan

menyebabkan pertumbuhan baru, mengakibatkan terjadinya pergeseran metabolisme ke

arah pembentukan makromolelul sehingga meningkatkan katabolisme karbohidrat untuk

energi sel (Anonim-1, 2006; Underwood, 1999; Boik, 1995; Tapan, 2005).

4

Terapi kanker dapat dilakukan dengan berbagai cara, mulai dari yang bersifat

konvensional yaitu pembedahan, hingga yang bersifat modern yaitu penggunaan

kemoterapi, radiasi, hormon, dan antibodi monoklonal. Cara kemoterapi memiliki

beberapa kelemahan dan efek samping berbahaya, diantaranya menyebabkan kerusakan

pada jaringan sekitarnya dan organ lain, seperti lambung, hepar, dan ginjal, di samping

memerlukan biaya yang mahal dan waktu pengobatan yang lama (Anonim-2, 2006; Boik,

1995; Tapan, 2005; Tjarita, 1979; Sudoyo, 2006).

Indonesia memiliki kekayaan hayati yang sangat beragam dan sangat tinggi

kelimpahannya, baik biota darat maupun biota laut. Para ilmuwan kini berusaha

melakukan berbagai upaya riset untuk mendapatkan bahan alam yang memiliki khasiat

sebagai antikanker dan dianggap relatif cukup aman (Manuputty, 1986; Manuputty,

2002). Biota laut yang banyak diteliti diantaranya adalah jenis sponge, karang lunak,

karang keras, bintang laut, cacing laut, jamur laut, dan rumput laut (Faulkner et al., 1994;

Munro et al., 1999; Proksch et al., 2002), dan diantaranya dilaporkan memiliki sifat

antitumor. Senyawa yang berkhasiat sebagai antitumor atau antikanker dan bersifat

sitotoksik dari biota laut, diantaranya adalah golongan terpenoid, alkaloid, flavonoid,

protein, dan polisakarida (Munro et al., 1987; Mayer, 1999; McKay, 1999; Jha dan Zi-

rong, 2004; Kijjoa dan Sawangwong, 2004).

Menurut Yokomatsu et al. (2006) karang lunak S. glaucum (Quoy & Gaimard)

mengandung senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antikanker terhadap kanker

pankreas. Dalam upaya menambah khasanah tentang manfaat dari biota laut nasional

sebagai sumber bahan obat alami maka pada penelitian ini dilakukan pengujian aktivitas

ekstrak karang lunak S. glaucum (Quoy & Gaimard) sebagai zat sitotoksik terhadap sel

lestari tumor HeLa dan sebagai antioksidan terhadap 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH).

BAHAN DAN METODA

a. Pembuatan ekstrak

Sampel karang lunak S. glaucum (Quoy & Gaimard) didapatkan dari perairan

Kepulauan Seribu pada kedalaman sekitar 15 m di dekat pulau Kotok pada bulai Mei

tahun 2005. Sebanyak 100 g sample karang lunak S. glaucum (Quoy & Gaimard)

dimaserasi dengan (3 x 100 mL) metanol dalam Erlenmeyer, masing-masing selama 24

5

jam. Maserat disaring dengan kertas Whatman No. 1, kemudian dipekatkan hingga kering

pada suhu rendah (25oC) dan tekanan rendah (50 mbar), selanjutnya pengeringan

disempurnakan pada suhu –40oC dan tekanan 200 x 10-3 mbar dengan freeze dryer.

Ekstrak kasar kering hasil freeze drying difraksinasi masing-masing dengan pelarut n-

heksana, etil asetat, dan metanol sehingga didapatkan 3 fraksi besar yaitu fraksi nonpolar

(n-heksana), fraksi semipolar (etil asetat), dan fraksi polar (metanol). Ketiga fraksi ini

masing-masing kemudian dievaporasi kembali hingga semua pelarut menguap, lalu

dibekukan dan dikeringkan pada suhu dan tekanan rendah menggunakan freeze dryer.

b. Identifikasi golongan senyawa

Identifikasi golongan senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak kasar yang

dihasilkan, meliputi uji golongan senyawa flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, steroid dan

terpenoid sesuai dengan metode Harborn (1987).

c. Uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach

Uji toksisitas dilakukan menurut Meyer et al. (1982), McLaughlin dan Rogers

(1998) dan Carballo et al. (2002) dengan metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

Metoda ini biasa dilakukan dalam uji pendahuluan untuk penapisan aktivitas

farmakologis produk alam (Carballo et al, 2002; Guerrero et al, 2004), dan juga

dilakukan sebagai tahap pendahuluan dalam penapisan bahan-bahan yang diduga

memiliki sifat antitumor atau antikanker sebelum melangkah kepada uji in vitro

menggunakan sel lestari tumor. Metode BSLT dipilih karena mudah dilakukan, sederhana

dan biayanya lebih murah bila dibandingkan dengan uji toksisitas metode lain, namun uji

tersebut memberikan hasil yang cukup signifikan (Widjhati et al., 2004).

Dalam uji ini digunakan larva Artemia salina sebagai hewan uji. Mula-mula telur

A. salina ditetaskan di dalam air laut buatan (38 g garam dapur dalam 1000 ml air biasa)

di bawah lampu TL 20 watt. Setelah 48 jam telur menetas manjadi nauplii instar III/IV

dan siap digunakan sebagai hewan uji. Larva A. salina dimasukkan ke dalam vial yang

telah berisi larutan sampel ekstrak karang lunak S. glaucum (Quoy & Gaimard) dengan

seri dosis 10, 100, 1000 ppm dengan 3 kali ulangan. Semua vial diinkubasi pada suhu

kamar selama 24 jam di bawah penerangan lampu TL 20 watt. Pengamatan dilakukan

6

setelah 24 jam dengan melihat jumlah Artemia salina yang mati pada tiap konsentrasi.

Penentuan nilai LC50 dalam µg/mL atau ppm dilakukan menggunakan analisis probit

dengan program MINITAB versi 13.2 dengan selang kepercayaan 95 %.

d. Uji aktivitas antioksidan terhadap DPPH

Uji aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metoda Chow et al. (2003). Uji aktivitas antioksidan terhadap DPPH diterapkan karena teknik pengerjaannya sederhana dan jumlah sampel yang digunakan sedikit. Penelitian yang menggunakan metode uji DPPH untuk mengukur aktivitas antioksidan telah banyak digunakan dan uji tersebut memberikan tingkat kepercayaan yang tinggi.

Satu ml 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) 1 mM ditambah metanol hingga

menjadi 5 ml (blanko). Sampel ekstrak karang lunak S. glaucum (Quoy & Gaimard)

dibuat dengan 5 seri konsentrasi yaitu 12,5; 25; 50, 100, dan 200 ppm. Sedangkan kontrol

positif digunakan vitamin C dengan seri konsentrasi 3; 6; 9; 12; dan 15 ppm. Tiap sampel

ditakar dengan volume yang sama, ditambahkan 1 ml DPPH 1 mM lalu diencerkan

dengan metanol hingga volumenya menjadi 5 ml. Diinkubasi pada suhu 37°C selama 30

menit. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 515 nm. Persentasi

hambatan dihitung berdasarkan rumus: {(absorbansi blanko-absorbansi sampel) /

absorbansi blanko} x 100%. Nilai hambatan dan konsentrasi ekstrak diplot masing-

masing pada sumbu x dan y, persamaan garis yang diperoleh digunakan untuk mencari

Inhibition Concentration 50% (IC50).

e. Uji aktivitas sitotoksik terhadap sel lestari tumor HeLa

Uji aktivitas sitotoksik dilakukan dengan metode MTT [3-(4,5-dimetilthiazol-

2yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida] menurut Hughes dan Mehmet (2003). Sel tumor

HeLa diperoleh dari koleksi Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT)

UGM. Sel lestari tumor HeLa dikultur dalam medium RPMI 1640 lengkap, Fetal Bovine

Serum (FBS) 10%, fungison 1% dan penisilin-streptomisin 1% (Hughes & Mehmet,

2003; Freshney, 1992).

Ektrak karang lunak S. glaucum (Quoy & Gaimard) yang aktif dari hasil uji

BSLT, dibuat seri dosis 12,5; 25; dan 50 ppm dengan 3 kali ulangan. Larutan ekstrak

7

dimasukkan ke dalam microplate 96 sumuran sebanyak 100 μL. Sel lestari tumor HeLa

dimasukkan ke dalam tiap sumuran masing-masing sebanyak 100 μL. Kontrol perlakuan

ada 3 terdiri dari kontrol sel (100 μL sel + 100 μL media), kontrol sampel (100 μL

ekstrak + 100 μL media) dan kontrol media (200 μL media). Sediaan dalam microplate

diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5 ml/menit. Setelah 24

jam ke dalam tiap-tiap sumuran ditambahkan MTT sebanyak 10 μL, diinkubasi kembali

pada inkubator CO2 selama 4 jam, kemudian reaksi MTT dihentikan dengan cara

menambahkan 100 μL sodium dodesil sulfat (SDS) 10 %. Microplate diinkubasi kembali

selama 12 jam pada suhu kamar. Setelah 12 jam, absorbansi tiap sumuran dibaca dengan

spektrofotometer plate reader pada panjang gelombang 560 nm. Persentase kematian sel

lestari tumor HeLa dihitung dengan rumus (A-B)/A x 100%, dimana A adalah jumlah sel

yang hidup pada sumuran kontrol, dan B adalah jumlah sel yang hidup pada sumuran

yang diberi ekstrak uji. Nilai LC50 (µg/ml atau ppm) dihitung dengan analisis probit

menggunakan program MINITAB versi 13.2 dengan selang kepercayaan 95 %.

HASIL DAN BAHASAN

a. Rendemen ekstrak

Hasil ekstraksi dari 100 g sampel basah dengan cara maserasi dalam pelarut

metanol yang kemudian di evaporasi dan dikeringkan pada suhu dan tekanan rendah

menghasilkan 2,31 g ekstrak kasar metanol yang berwarna hijau, sehingga didapatkan

rendemen ekstrak kasar = (2,31g / 100g) x 100% = 2,31%. Hasil ekstraksi partisi dari

500,10 mg ekstrak kasar S. glaucum (Quoy & Gaimard) masing-masing dalam pelarut

heksan (non-polar), etil asetat (semi-polar), dan metanol (polar) adalah 0,00 mg, 136,40

mg, dan 121,20 mg sehingga didapatkan rendemen masing-masing fraksi heksan, etil

asetat, dan metanol adalah 0,00%, 27,27%, dan 24,23%. Sisanya merupakan bahan

pengotor (garam dan lainnya sebesar 48,50%).

b. Penapisan fitokimia

Penapisan fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak kasar metanol dari S.

glaucum (Quoy & Gaimard) adalah untuk mengetahui golongan senyawa yang

terkandung di dalam ekstrak tersebut. Hasil penapisan menunjukkan bahwa ekstrak kasar

8

yang diuji hanya mengandung senyawa golongan alkaloid terbukti dengan terbentuknya

warna jingga setelah diberi pereaksi Dragendorff, dan endapan putih dengan pereaksi

Meyer, seperti disajikan pada Tabel 1. Hasil penegasan dengan pereaksi Dragendorff

pada plat KLT-Spektrofotometri menunjukkan bercak berwarna jingga, seperti

ditampilkan pada Gambar 1.

Tabel 1. Hasil penapisan fitokimia ekstrak kasar S. glaucum (Quoy & Gaimard). Table 1. Result of phytochemistry screening of S. glaucum (Quoy & Gaimard) crude extract.

Golongan senyawa/ Group compound

Pereaksi / Reagent

Hasil / Result

Keterangan/ Remark

Alkaloid Dragendorff Meyer

Terbentuk warna jingga / Orange colour formed

Terbentuk endapan putih / White precipitate formed

(+)

(+)

Flavonoid

HCl pekat (concentrated)

& Amyl alcohol

Tidak terbentuk warna hijau pada lapisan amil alkohol /

Green colour in the amyl alcohol layer was not formed

(-)

Steroid-Triterpen Liebermann Bouchard

Tidak terbentuk warna merah jingga–hijau / Redish orange-green

colour was not formed (-)

Tanin FeCl3 1% Tidak terbentuk warna hitam–biru–hitam / Black-blue-black colour was

not formed (-)

Saponin

Dikocok vertikal /

shake vertically 10 menit + HCl

2N

Tidak terbentuk busa stabil / Stabil foam was not formed (-)

Keterangan/Note : (-) reaksi negatif / negative respons; (+) reaksi positif / positive respons;

Terhadap pereaksi lainnya menunjukkan hasil negatif, berarti tidak mengandung

flavonoid, tanin, saponin dan triterpen. Senyawa alkaloid adalah senyawa organik

nonprotein yang mengandung unsur nitrogen, bersifat basa, masuk dalam golongan

senyawa semipolar, tetapi dalam bentuk garamnya bersifat polar. Kemungkinan ekstrak

tersebut mengandung lebih dari satu komponen sehingga terdapat pada kedua fraksi,

yaitu semipolar dan polar.

9

Keterangan / Note : Fasa gerak / mobile phase : Metanol Fasa diam / stationary phase : Silika gel GF254 Pereaksi Warna / Colour reagent : Dragendorff Deteksi / detection : Sinar UV 366 nm Rf / Rf : 0,25

Gambar 1. Kromatogram lapis tipis (KLT) hasil penapisan fitokimia dari ekstrak kasar S.

glaucum (Quoy & Gaimard). Bercak berwarna jingga. Figure 1. Thin layer chromatogram result of phytochemistry screening of S. glaucum (Quoy &

Gaimard) crude extract. It shows orange colour.

c. Aktivitas antioksidan ekstrak kasar S. glaucum (Quoy & Gaimard) Uji aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengetahui potensi aktivitas

antitoksidan dari senyawa yang terdapat dalam ekstrak kasar, berdasarkan prinsip adanya reaksi penangkapan hidrogen dari antioksidan oleh radikal bebas DPPH. Nilai IC50 dihitung berdasarkan persamaan garis regresi yang diperoleh antara konsentrasi dan inhibisi (%). Persamaan garis regresi linier yang diperoleh untuk vitamin C adalah y = 4,4725x + 9,1782 dengan nilai R2 = 0,9948, seperti dapat dilihat pada Gambar 2. Hasil uji aktivitas antioksidan dari vitamin C yang digunakan sebagai kontrol positif terhadap DPPH diperoleh nilai IC50 sebesar 9,13 μg/mL, artinya konsentrasi vitamin C yang diperlukan untuk menghambat 50% radikal bebas DPPH adalah 9,10 μg/mL. Semakin rendah nilai IC50, semakin tinggi aktivitasnya sebagai penangkap radikal bebas DPPH.

Hasil uji aktivitas antioksidan dari ekstrak kasar metanol terhadap DPPH sesuai dengan persamaan garis regresi linier yang diperoleh yaitu y = 0,105x + 3,5401 dengan nilai R2 = 0,8241, seperti dapat dilihat pada Gambar 3. Nilai IC50 dari ekstrak kasar metanol adalah 442,50 μg/mL yang berarti potensi antioksidan ekstrak kasar metanol hanya sekitar 2,06% dari potensi vitamin C. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kasar metanol memiliki aktivitas antioksidan yang jauh lebih kecil dibandingkan dengan aktivitas antioksidan vitamin C sehingga tidak potensial sebagai sumber senyawa antioksidan.

10

Gambar 2. Hubungan antara konsentrasi (μg/mL) dan potensi inhibisi (%) antioksidan vitamin C sebagai kontrol positif terhadap DPPH. Figure 2. Relationship between concentration (μg/mL) and inhibition potency (%) of antioxidant vitamin C as a positive control against DPPH.

Gambar 3. Hubungan antara konsentrasi (μg/mL) dan potensi inhibisi (%) antioksidan

ekstrak kasar S. glaucum terhadap DPPH. Figure 3. Relationship between concentration (μg/mL) and inhibition potency (%) of

antioxidant S. glaucum crude extract (%) against DPPH.

y = 4.4725x + 9.1782R2 = 0.9948

0102030405060708090

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Konsentrasi / Concentration (ug/mL)

Inhi

bisi

/ In

hibi

tion

(%)

y = 0.105x + 3.5379R2 = 0.8241

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200 250

Konsentrasi / Concentration (ug/mL)

Inhi

bisi

/ In

hibi

tion

(%)

11

d. Toksisitas ektrak kasar S. glaucum (Quoy & Gaimard) dengan metode BSLT

Uji toksisitas ekstrak kasar S. glaucum (Quoy & Gaimard) dengan metode BSLT

bertujuan untuk mengetahui tingkat toksisitas senyawa yang terdapat dalam ekstrak

terhadap larva udang Artemia salina Leach. Berdasarkan hasil uji toksisitas dengan

menggunakan analisis probit dihasilkan persamaan garis regresi linier : Y = 1,37 x + 2,54

dengan nilai R2 = 0,9843, seperti dapat dilihat pada Gambar 4. Hal ini menunjukkan

bahwa terdapat korelasi positif antara nilai probit dengan log konsentrasi. Makin tinggi

konsentrasi ekstrak yang digunakan makin tinggi tingkat toksisitas ekstrak tersebut

terhadap larva uji, terlihat dengan makin meningkatnya tingkat mortalitas larva uji.

Berdasarkan persamaan garis regresi linier, ekstrak kasar metanol S. glaucum (Quoy &

Gaimard) yang diperoleh memiliki nilai LC50 sebesar 63,10 μg/mL. Nilai LC50 yang

diperoleh lebih rendah dari 1000 μg/mL, berarti ekstrak tersebut termasuk golongan

senyawa yang bersifat toksik. (Munro et al., 1987; Munro et al., 1999).

Gambar 4. Hubungan antara konsentrasi logaritmik dengan nilai probit hasil uji toksisitas ekstrak kasar S. glaucum (Quoy & Gaimard) (μg/mL) terhadap larva udang Artemia salina Leach

Figure 4. Relationship between logaritmic concentration with probit value of the toxicity assay of S. glaucum (Quoy & Gaimard) crude extract against Artemia salina Leach nauplii.

y = 1.37x + 2.54R2 = 0.9843

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Konsentrasi logaritmik / Logaritmic concentration

Nila

i Pro

bit /

Pro

bit v

alue

12

e. Sitotoksisitas ekstrak kasar S. glaucum (Quoy & Gaimard) terhadap sel lestari

tumor HeLa

Uji toksisitas ekstrak kasar terhadap Artemia salina menghasilkan persamaan

garis regresi linier antara log konsentrasi dan nilai probit menghasilkan nilai LC50 ekstrak

kasar = 63,10 μg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak tersebut termasuk dalam

kategori toksik terhadap Artemia salina. Sifat toksik ekstrak tersebut kemudian diujikan

terhadap sel lestari tumor HeLa. Uji sitotoksik dari ekstrak tersebut terhadap sel lestari

tumor HeLa bersifat lebih spesifik dan dapat digunakan untuk mendeteksi kemungkinan

adanya zat antimitosis pada ekstrak. Berdasarkan hasil uji sitotoksik maka dilakukan

analisis probit sehingga didapatkan persamaan garis regresi linier, yaitu Y = 0,1329x +

4,8076 dengan nilai R2 = 0,9796. Berdasarkan persamaan garis tersebut didapatkan nilai

IC50 sebesar 25,12 ug/mL. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak kasar bersifat agak toksik

terhadap sel lestari tumor HeLa. Konsentrasi ekstrak yang digunakan memiliki korelasi

positif (R2 = 0,9796) terhadap tingkat inhibisi pertumbuhan sel lestari tumor HeLa. Hasil

uji sitotoksik dari ekstrak kasar dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Hubungan antara konsentrasi logaritmik dengan nilai probit hasil uji sitotoksisitas ekstrak kasar metanol-air S. glaucum (Quoy & Gaimard) terhadap sel lestari tumor HeLa.

Figure 5. Realtionship between logaritmic concentration with probit value of cytotoxicity assay result of S. glaucum (Quoy & Gaimard) methanol-water crude extract against HeLa tumor cell line.

y = 0.1329x + 4.8076R2 = 0.9796

4.94

4.96

4.98

5

5.02

5.04

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8

Konsentrasi logaritmik / Logaritmic concentration

Nila

i pro

bit /

Pro

bit v

alue

13

f. Uji sitotoksisitas fraksi metanol dan fraksi etil asetat S. glaucum (Quoy &

Gaimard) terhadap sel lestari tumor HeLa

Langkah riset selanjutnya adalah melakukan fraksinasi ekstrak kasar untuk

memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kasar berdasarkan sifat

kepolarannya dengan menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Partisi

dengan pelarut heksan tidak menghasilkan ekstrak sedangkan partisi dengan pelarut etil

asetat dan metanol menghasilkan ekstrak dengan rendemen masing-masing 27,27% dan

24,23%. Tahap selanjutnya adalah melakukan uji sitotoksisitas dari masing-masing fraksi

etil asetat dan metanol terhadap sel lestari tumor HeLa.

f.1. Fraksi metanol

Hasil uji sitotoksik dari fraksi metanol terhadap sel lestari tumor HeLa dapat

dilihat pada Gambar 6. Berdasarkan persamaan garis regresi linier yang dihasilkan antara

nilai probit terhadap log konsentrasi, yaitu Y = 0,4784x + 4,1813 dan nilai R2 = 0,3791,

didapatkan nilai IC50 fraksi metanol sebesar 50,12 μg/mL.

Gambar 6. Hubungan antara nilai konsentrasi logaritmik dengan nilai probit hasil uji sitotoksisitas ekstrak fraksi metanol S. glaucum (Quoy & Gaimard) terhadap sel lestari tumor HeLa.

Figure 6. Realtionship between logaritmic concentration (ug/mL) with probit value of cytotoxicity assay result of S. glaucum (Quoy & Gaimard) methanol fraction extract againstHeLa tumor cell line.

y = 0.4784x + 4.1813R2 = 0.3791

0

1

2

3

4

5

6

0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9 2.1

Konsentrasi logaritmik/Logaritmic concentration

Nila

i pro

bit/ P

robi

t val

ue

14

Ketentuan NCI USA menyatakan bahwa fraksi-fraksi dengan nilai LC50 ≤ 30

μg/mL baik untuk ditelusuri lebih lanjut karena bersifat prospektif mengandung senyawa

yang bersifat sitotoksik terhadap sel tumor (Munro et al.,1987). Nilai LC50 fraksi metanol

sebesar 50,12 μg/mL > 30 μg/mL maka penelusuran lebih diarahkan pada fraksi etil

asetat dengan tetap melakukan pengamatan mikroskopik terhadap hasil riset dari fraksi

metanol ini. Hasil pengamatan mikroskopik tentang efek sitotoksik dari fraksi metanol

terhadap sel tumor HeLa dapat dilihat pada Gambar 7. Dapat dilihat bahwa makin tinggi

konsentrasi ekstrak yang diberikan mengakibatkan makin banyak jumlah sel lestari tumor

HeLa yang mati.

A

B

B

A

7a. Konsentrasi 6,25 μg/mL 7b. Konsentrasi 12,5 μg/mL 7a. Concentration 6,25 μg/mL 7b. Concentration 12,5 μg/mL

B

B

A

A

7c. Konsentrasi 25 μg/mL 7d. Konsentrasi 50 μg/mL 7c. Concentration 25 μg/mL 7d. Concentration 50 μg/mL

15

B

Keterangan / Note : A : Sel hidup (terang) / life cell (bright) B : Sel mati (gelap) / dead cell (dark)

7e. Konsentrasi 100 μg/mL 7e. Concentration 100 μg/mL

Gambar 7. Pengamatan mikroskopik hasil uji sitotoksik fraksi metanol S. glaucum (Quoy

& Gaimard) terhadap sel lestari tumor HeLa pada berbagai konsentrasi (7a-e). Figure 7. Microscopic observation on the result of cytotoxicity assay of S. glaucum (Quoy &

Gaimard) methanol fraction against HeLa tumor cell line on different concentration (7a-e).

f.2. Fraksi etil asetat

Hasil uji sitotoksik dari fraksi etil asetat terhadap sel lestari tumor HeLa dapat

dilihat pada Gambar 8. Persamaan garis regresi linier yang dihasilkan antara nilai probit

terhadap log konsentrasi, yaitu : Y = 2,2091x + 1,6688 dengan nilai R2 = 0,9288,

menghasilkan nilai IC50 fraksi etil asetat sebesar 31,62 μg/mL. Nilai IC50 yang

didapatkan dari fraksi etil asetat pada riset ini, masih sedikit lebih tinggi dari pada

ketentuan NCI USA, yang menyatakan bahwa fraksi-fraksi dengan nilai IC50 ≤ 30 μg/mL

bersifat prospektif mengandung senyawa yang bersifat sitotoksik terhadap sel tumor

sehingga baik untuk ditelusuri lebih lanjut hingga dapat diketahui struktur kimianya dari

senyawa aktif dalam fraksi tersebut (Munro et al.,1987). Hal ini dilakukan dalam upaya

mencari kemungkinan membuat sintetik dan derivat senyawa aktif dengan nilai LC50 ≤ 10

μg/mL yang ditemukan dari fraksi tersebut. Untuk mengetahui lebih jauh tentang efek

sitotoksik dari ekstrak fraksi etil asetat terhadap sel tumor HeLa maka dilakukan

pengamatan mikroskopik. Hasil pengamatan mikroskopik dapat dilihat pada Gambar 8.

16

Gambar 8. Hubungan antara konsentrasi logaritmik dengan nilai probit hasil uji sitotoksisitas ekstrak fraksi etil asetat S. glaucum (Quoy & Gaimard) terhadap sel lestari tumor HeLa.

Figure 8. Realtionship between logaritmic concentration (ug/mL) with probit value of cytotoxicity assay result of ethyl acetate fraction extract S. glaucum (Quoy & Gaimard) against HeLa tumor cell line.

Makin tinggi konsentrasi ekstrak yang diberikan mengakibatkan tingkat inhibisi

pertumbuhan sel lestari tumor HeLa makin tinggi. Peningkatan konsentrasi fraksi etil

asetat yang digunakan berbanding lurus dengan tingkat inhibisi sel lestari tumor HeLa

dan hal tersebut dipertegas dengan persamaan garis regresi linier yang didapat, yang

menunjukkan korelasi yang tinggi. Kondisi tersebut tidak terjadi pada uji sitotoksik dari

fraksi metanol. Narisawa et al. (1989) menyatakan bahwa Sarcophytol A (SaA), senyawa

cembrane diterpenoid yaitu isolat dari S. glaucum, dapat menghambat perkembangan

kanker usus besar (large bowels), yang diperkirakan melalui mekanisme antipromosi.

Sedangkan Yokomatsu et al. (1994) menyatakan bahwa Sarcophytol A (SaA)

menunjukkan efek antikanker dan pencegah kanker pankreas. Pemberian SaA secara oral

merupakan cara efektif untuk inhibisi jenis kanker tertentu pada marmut (hamster). Hasil

riset Zhang et al. (2006) tentang Sarcophyton crassocaule menunjukkan adanya 5

senyawa cembrane diterpenoid yaitu Sarcrassins A-E dan satu senyawa Emblide dari

fraksi etil asetat (semipolar). Hasil uji toksisitas terhadap sel lestari tumor KB

menunjukkan bahwa tiga senyawa memiliki toksisitas tinggi dengan nilai IC50 masing-

masing 5, 4, dan 5 ug/mL sedangkan dua senyawa lain memiliki toksisitas sedang, yaitu

19 dan 13 ug/mL.

Sitotoksisitas Fraksi EtOAc (OK)

y = 2.2091x + 1.6688R2 = 0.9288

012345678

0.5 1 1.5 2 2.5

Konsentrasi logaritmik / Logaritmic concentration

Nila

i pro

bit /

Pro

bit v

alue

17

Hasil uji toksisitas dari senyawa-senyawa tersebut terhadap sel lestari tumor MCF

menunjukkan aktivitas sedang. Berdasarkan hasil-hasil riset tersebut menunjukkan bahwa

kemungkinan senyawa yang potensial bersifat sitotoksik terakumulasi pada fraksi etil

asetat.

Pada riset ini dilakukan juga uji aktivitas antioksidan dari ekstrak kasar dengan

tujuan untuk mengetahui kemungkinan adanya korelasi antara efek sitotoksik dengan

aktivitas antioksidan dari ekstrak. Hasil uji antioksidan dengan DPPH menunjukkan

bahwa aktivitas antioksidan S. glaucum (Quoy & Gaimard) jauh lebih kecil dari vitamin

C, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak S. glaucum (Quoy & Gaimard) tidak cukup

potensial memiliki sifat antioksidan.

B

B

A A

9a. Konsentrasi 6,25 μg/mL 9b. Konsentrasi 12,5 μg/mL 9a. Concentration 6,25 μg/mL 9b. Concentration 12,5 μg/mL

B

B

A

9c. Konsentrasi 25 μg/mL 9d. Konsentrasi 50 μg/mL 9c. Concentration 25 μg/mL 9d. Concentration 50 μg/mL

18

Keterangan / Note :

A : Sel hidup (terang) / life cell (bright)

B : Sel mati (gelap) / dead cell (dark)

B

9e. Konsentrasi 100 μg/mL 9e. Concentration 100 μg/mL Gambar 9. Pengamatan mikroskopik hasil uji sitotoksik fraksi etil asetat S. glaucum (Quoy

& Gaimard) terhadap sel lestari tumor HeLa pada berbagai konsentrasi (9a-e). Figure 9. Microscopic observation on the result of cytotoxicity assay of S. glaucum (Quoy &

Gaimard) ethyl acetate fraction against HeLa tumor cell line on different concentration (9a-e).

Apabila ekstrak yang didapatkan memiliki potensi sitotoksik tinggi (LC50 < 30

μg/mL) dan memiliki potensi antioksidan tinggi, misalnya potensinya sama dengan atau

lebih kuat dari vitamin C (IC50 ≤ 9,10 μg/mL) yang menjadi kontrol positif, maka ekstrak

tersebut mungkin akan sangat berguna untuk mengatasi perkembangan tumor yang

diakibatkan oleh kelebihan radikal bebas dalam tubuh, ataupun karena masuknya zat

mutagenik ke dalam tubuh. Dalam riset ini dapat diketahui bahwa ekstrak yang

didapatkan tidak cukup memiliki potensi sebagai zat antioksidan. Hasil pengujian

sitotoksisitas ekstrak menunjukkan bahwa toksisitasnya relatif rendah, namun ditinjau

dari efek sitotoksik dari ekstrak dapat menimbulkan inhibisi pekembangan tumor

walaupun tidak sangat potensial. Potensi sitotoksik yang relatif rendah ini kemungkinan

karena ekstrak yang diuji masih dalam bentuk campuran senyawa sehingga sangat besar

kemungkinannya bahwa terjadi efek antagonis antar senyawa yang terdapat dalam

campuran tersebut. Sangat penting untuk dilakukan isolasi senyawa-senya yang terdapat

di dalam ekstrak tersebut untuk mengetahui efek sitotoksiknya dari masing-masing

senyawa terhadap sel tumor HeLa.

19

Kesimpulan dan saran

1. Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak Sarcophyton glaucum (Quoy &

Gaimard) mengandung senyawa alkaloid. Berdasarkan hasil uji bioaktivitas ekstrak,

ekstrak kasar metanol-air memiliki IC50 25,12 ug/mL. Hal ini berarti terdapat efek

sinergis antara fraksi metanol dengan IC50 50,12 ug/mL dan fraksi etil asetat dengan

IC50 31,62 ug/mL, senyawa aktif yang merupakan senyawa alkaloid diperkirakan

terdapat dalam campuran yaitu di dalam ekstrak fraksi etil asetat.

2. Perlu dilakukan riset lanjutan untuk melakukan isolasi senyawa-senyawa yang terdapat

dalam ekstrak fraksi etil asetat yang bersifat cukup aktif serta mengetahui struktur

kimia dari senyawa-senyawa aktif yang terdapat dalam campuran tersebut.

3. Perlu dilakukan pengujian bioaktivitas ekstrak Sarcophyton glaucum (Quoy &

Gaimard) terhadap jenis sel lestari lainnya untuk mengetahui bioaktivitas atau

sensitivitas ekstrak tersebut terhadap berbagi jenis sel lestari agar dapat mengambil

manfaatnya.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim-1, 2006. World Health Organization, Global cancer rates could increase by 5%

to 15% by 2020. World cancer report provides clear evidence that action on smoking, diet and infections can prevent one third of cancers, another third can be cured. Diambil dari: http:/www.wh.int/mediacentre/news….. Diakses tanggal 28 Juli 2006.

Anonim-2, 2006. World Health Organization, New initiative to speed development and

introduction of vaccines to protect against cervical cancer. Diambil dari: http:/www.wh.int/mediacentre/news….. Diakses tanggal 28 Juli 2006.

Boik, J., 1996. Cancer & Natural Medicine: A Texbook of Basic Science and Clinical

Research. Oregon Medical Press. 315pp. Carballo, J.L, Hernadez-Inda, Z.L., Perez, P., and Garcia-Gravalos, M.D., 2002. A

comparison between two brine shrimp assay to detect in vitro cytotoxicity in marine natural product (methodology article). BMC Biotechnology. 2 : 1 - 5

Faulkner, D.J., Unson, M.D., and Bewley, C.A. 1994. The chemistry of some sponges

and their symbionts. Pure & Appl. Chem., 66 : 1883 – 1990.

20

Freshney, J.R., 1992. Animal Cell Culture, a practical approach. 2nd ed. Oxford

Univversity Press. P. 6. Guerrero, R.O, Khan, M.T.H., Casanas, B., and Morales, M., 2004. Specific bioassay

with selected plants of Bangladesh. Rev.Cubana Plant Med. 9 (2): 5 – 13 Hughes, D and Mehmet, H., 2003. Cell proliferation and apoptosis. Advanced Method.

BIOS Scientific Publisher Ltd, Oxford. 373 pp. Harborn, J.B., 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.

Edisi II. Penerjemah: K. Padmawinata dan I. Soediro. ITB Bandung. 354 pp. Jha, R.K. and Zi-rong, X. 2004. Biomedical compounds from marine organisms.

Marine Drugs, 2: 123 – 146 Kijjoa, A and Sawangwong, P. 2004. Drugs and cosmetic from the sea. Marine

Drugs, 2 : 73 – 82. Manuputty, A.E.W., 1986. Karang Lunak, Salah Satu Penyusun Terumbu Karang.

Oseana, XI (4): 131 – 141. Manuputty, A.E.W., 2002. Karang Lunak (Soft Coral) Perairan Indonesia, Pusat

Penelitian Oceanografi Proyek Pemanfaatan dan Diseminasi IPTEK Kelautan, LON-LIPI, Jakarta.

Mayer, A.M.S., 1999. Marine Pharmacology in 1998: Antitumor and Cytotoxic

Compounds. The Pharmacologist 11 (4): 159-164. McKay, J. 1999. Marine sponge: small animals with really neat compounds. The

Evergreen State College Olympia, Washington. internet Acces at http://www.ucmp.berkeley.edu/porifera.html

McLaughlin, J.L and Rogers, L.L., 1998. The use of biological assay to evaluate

botanicals. Drug Information Journal, 32 : 513-524. Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putman, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D. E., McLauglin,

J.L., 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med. 45 : 35 – 34.

Munro, M.H.G., Luibrand, R.T., and Blunt, J.W. 1987. The Search for Antiviral and

Anticancer Compounds from Marine Organisms. In : Scheuer, P. Bioorganic Marine Chemistry, Volume 1. Springer-Verlag, Berlin. 615 pp.

Munro, M.H.G., Blunt, J.W., Dumdei, E.J., Hickford, S.J.H., Lill, R.E., Li, S., Battershill,

C.N. and Duckworth,A.R. 1999. The discovery and development of marine compound with pharmaceutical potential. Journal of Biotechnology 70: 14 -25.

21

Nafrialdi dan Gan, S., 1995. Antikanker. Dalam: S.G. Ganiswara, R. Setiabudy, F.D.Suyatna, Purwantyastuti, Nafrialdi (Eds.). Farmakologi dan Terapi. Edisi IV. Bag. Farmakologi FK-UI, Jakarta. p. 686-701.

Narisawa, T., Takahashi, M., Niwa, M., Fukaura, Y., Fujiki, H., 1989. Inhibition of

methylnitrosourea-induced large bowel cancer development in rats by sarcophytol A, a product from a marine soft coral Sarcophyton glaucum. Cancer Research 49 (12): 3287-3289.

Proksch, P., Edrada, R.A., and Ebel R. 2002. Drugs from the sea – current status and

microbial implications. Appl. Microbiol. Biotechnol, 59 : 125 – 134. Sudoyo A.W., 2006. Kanker dan Gaya Hidup: Peran Lingkungan. p. 1-5. Diambil dari:

http://www. medistra. com. Diakses tanggal 20 Mei 2006. Tapan, E, 2005. Kanker, Antioksidan & Terapi Komplementer, PT. Elex Media

Komputindo Kelompok Gramedia, Jakarta. p. 1-61. Tjarita, A., 1979. Neoplasma. Dalam: S.Himawan (Ed.). Patologi. Bag. Pat. Anatomik

FK-UI. p. 77-82. Underwood, J.C.E., 1999. Patologi Umum dan Sistematik. Edisi II. Diterjemahkan oleh

Sarjadi. EGC Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta. p. 258. Widjhati R., Supriyono, A., dan Subintoro. 2004. Pengembangan Senyawa Bioaktif dari

Biota Laut. Makalah pada Forum Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Pusat Riset Pengolahan Produk dan Sosial Ekonomi Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan. Tanggal 25 Maret 2004. 13 pp.

Yokomatsu, H., Satake, k., Hiura, A., Tsutsumi, M., Suganuma, M., 1994. Sarcophytol

A: a new chemotherapeutic and chemopreventive agent for pancreatic cancer. Pancreas 9(4): 526-530.

Zhang, C., Li, J., Su, J., Liang, Y., Yang, X., Zheng, K., and Zeng, L., 2006. Cytotoxic

Diterpenoids from the Soft Coral Sarcophyton crassocaule. J. Nat. Prod 69: 1476-1480.