kimiakimi.files.wordpress.com · Web viewPerbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri Gram negatif

Laporan Praktikum Nama : Diana Agustini RaharjaMikrobiologi NIM : J3L112168

Kelas/kelompok : C P1/1PJP : M. Arif Mulya, S. Pi.Asisten : 1. Yuriska Sekar Rani

2. Lia Suliani3. Ramdhani

PEWARNAAN MIKROBA

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2013

PendahuluanPewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu Gram positif dan Gram negatif yang didasarkan pada sifat kimia dan  fisik dinding sel yang dimiliki oleh bakteri. Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya yaitu seorang ilmuwan Denmark bernama Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol (Karmana 2008).

Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar peneliti atau pengamat mampu membedakan endospora dengan sel vegetatif ataupun mengamati bentuknya. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, karena endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna). Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode pewarnaan endospora dengan larutan malacite green. Metode ini merupakan metode Shaeffor yang mana foton endospora diwarnai pertama kali dengan larutan malacite green. Pewarnaan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora bakteri. Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan merah pada sel vegetatif (James 2002).

Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri Gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. E. coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mm dan diamater 0.5 mm. Volume sel E. coli berkisar 0.6-0.7 mm3. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 °C, optimum pada 37°C. Usus besar manusia terkandung sejumlah E. coli yang berfungsi membusukkan sisa-sisa makanan. Dari sekian ratus strain E. coli yang teridentifikasi, hanya sebagian kecil bersifat patogen, misalnya strain O157:H7. Bakteri yang namanya berasal dari sang penemu Theodor Escherich yang menemukannya di tahun 1885 ini merupakan jenis bakteri yang menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. Hampir semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi selalu melibatkan E. coli akibat genetikanya yang sederhana dan mudah untuk direkayasa. Riset di E. coli menjadi model untuk aplikasi ke bakteri jenis lainnya. Bakteri ini juga merupakan media kloning yang paling sering dipakai. Teknik recombinan DNA tidak akan ada tanpa bantuan bakteri ini (Arican dan Andic 2011).

Bacillus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, serta dapat tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Sporanya tahan terhadap panas (suhu tinggi), mampu mendegradasi xylandan karbohidrat. Bacillus mempunyai sifat beberapa sifat di antaranya 1) mampu tumbuh pada suhu lebih dari 50 oC dan suhu kurang dari 5 oC, 2) mampu bertahan terhadap pasteurisasi, 3) mampu tumbuh pada konsentrasi garam tinggi (>10%), 4) mampu menghasilkan spora dan 5) mempunyai daya proteolitik yang tinggi dibandingkan mikroba lainnya. Bacillus

adalah anggota dari divisi Firmicutes. Bacillus merupakan bakteri yang bersifat aerob obligat atau fakultatif, dan positif terhadap uji enzim katalase. Bacillus secara alami terdapat di mana-mana, dan termasuk spesies yang hidup bebas atau bersifat patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, dan selulase yang bisa membantu pencernaan dalam tubuh hewan. Jenis Bacillus di antaranya B. cereus, B. clausii, dan B. pumilus termasuk dalam produk probiotik komersil yang terdiri dari spora bakteri yang telah dikarakterisasi dan berpotensi untuk kolonisasi, immunostimulasi, dan aktivitas antimikrobanya (Duc 2004).

TujuanPercobaan dilakukan untuk mengidentifikasi E. coli dengan cara pewarnaan

Gram dan untuk mengidentifikasi Bacillus dengan cara pewarnaan Gram dan pewarnaan spora.

Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan adalah kawat ose, pembakar spirtus, kaca

preparat, spidol, mikroskop, dan wadah untuk menampung bilasan. Bahan-bahan yang digunakan adalah biakan bakteri E. coli, biakan bakteri Bacillus, akuades, alkohol 70%, kristal ungu, kalium iodida, alkohol 90%, safranin, minyak imersi, dan malacite green.

Prosedur KerjaSuasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum.

Oleh karena itu, tangan dan kaca preparat yang digunakan dibasahi dengan alkohol 70%. Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara diteteskan setetes akuades pada pelat kaca dan biakan bakteri E. coli dalam media padat diambil dengan kawat ose yang telah disterilkan dengan panas api dan dioleskan di atas akuades pada kaca preparat. Sedangkan untuk biakan Bacillus dalam media cair tidak perlu diteteskan akuades terlebih dahulu, cukup dengan dioleskan pada kaca preparat. Setelah bakteri dioleskan pada kaca preparat, olesan tersebut ditandai dengan spidol di balik permukaan kaca preparatnya. Fiksasi dilakukan dengan cara dikeringudarakan dekat api spirtus. Setelah kering, kristal ungu diteteskan di atas biakan bakteri tersebut hingga rata menutupi area bakteri. Kristal ungu dibiarkan melekat hingga satu menit. Setelah satu menit, krital ungu yang telah diteteskan dibilas dengan akuades dari bagian samping kaca preparat hingga mengalir dan jangan langsung terkena biakan bakterinya. Kemudian kaca preparat dikeringudarakan kembali, diteteskan dengan kalium iodida hingga menutupi seluruh area biakan bakteri, dan dibiarkan selama satu menit. Setelah satu menit, kalium iodida yang telah diteteskan dibilas dengan menggunakan alkohol 90% dan dikeringudarakan. Safranin diteteskan pada biakan bakteri secara merata dan didiamkan selama satu menit dan setelah satu menit dibilas dengan akuades serta dikeringudarakan. Kaca preparat yang berisi bakteri tersebut diamati di bawah mikroskop. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran lebih kecil terlebih dahulu sampai dengan perbesaran 1000 kali. Perbesaran 1000 kali harus menggunakan minyak imersi.

Pewarnaan spora dilakukan dengan cara diteteskan setetes akuades pada pelat kaca dan biakan bakteri Bacillus dalam media cair diambil dengan kawat ose

yang telah disterilkan dengan panas api dan dioleskan pada kaca preparat. Setelah bakteri dioleskan pada kaca preparat, olesan tersebut ditandai dengan spidol di balik permukaan kaca preparatnya. Fiksasi dilakukan dengan cara dikeringudarakan dekat api spirtus. Setelah kering, malacite blue diteteskan di atas biakan bakteri tersebut hingga rata menutupi area bakteri selama 2 sampai 3 menit di atas uap air. Setelah malacite blue diteteskan, kaca preparat dibilas dengan akuades dari bagian samping kaca hingga mengalir dan jangan langsung terkena biakan bakterinya. Setelah itu, kaca preparat dikeringudarakan. Safranin diteteskan pada biakan bakteri secara merata dan didiamkan selama 30 detik dan setelah 30 detik dibilas dengan akuades serta dikeringudarakan. Kaca preparat yang berisi bakteri tersebut diamati di bawah mikroskop. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran lebih kecil terlebih dahulu sampai dengan perbesaran 1000 kali. Perbesaran 1000 kali harus menggunakan minyak imersi.

Data dan Hasil PengamatanBerikut ini data dan hasil pengamatan yang dilakukan pada sampel bakteri

E. coli dan Bacillus dalam pewarnaan mikroba baik pewarnaan Gram maupun pewarnaan spora.Tabel 1 Data pengamatan pada sampel bakteri E. coli dan Bacillus dengan pewarnaan mikroba

Sampel bakteriE. coli Bacillus

Sifat Gram Gram negatif Gram negatifBentuk sel Coccus BasilPenataan sel Streptococcus MonococcusSpora Tidak memiliki spora Memiliki endospora

Gambar 1 Hasil pewarnaan Gram pada E. coli dengan perbesaran 40x10

Gambar 2 Hasil pewarnaan Gram pada Bacillus dengan perbesaran 40x10

Gambar 3 Hasil pewarnaan spora pada Bacillus dengan perbesaran 100x10

PembahasanProses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun

mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat, dan meja. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan, seperti bakteri lain dari udara atau tangan yang dapat menempel pada kaca preparat sehingga akan didapatkan pengukuran yang tidak akurat jika tidak steril. Pewarnaan Gram yang dilakukan berdasarkan percobaan terbagi menjadi dua, yaitu pewarnaan Gram positif dan pewarnaan Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki beberapa ciri di antaranya 1) struktur dinding sel tebal (15-80 nm) dan berlapis tunggal (mono), 2) komposisi dinding sel berupa kandungan lipid rendah (1-4%), peptidoglikan ada sebagai lapisan tunggal yang merupakan komponen utama lebih dari 50% berat kering pada beberapa sel bakteri, dan memiliki asam tekoat, 3) lebih rentan terhadap penisilin, 4) pertumbuhan dihambat dengan nyata oleh zat-zat warna dasar seperi kristal ungu. 5) persyaratan nutrisi relatif rumint pada banyak spesies, serta 6) lebih resisten terhadap gangguan fisik. Sedangkan bakteri Gram negatif memiliki ciri di antaranya 1) struktur dinding sel tipis (10-15 nm) dan berlapis tiga (multi), 2) komposisi dinding sel berupa kandungan lipid yang tinggi (11-22%), peptidoglikan ada di dalam lapisan kaku sebelah dalam dengan jumlahnya sedikit sekitar 10% berat kering, dan tidak ada asam tekoat, 3) kurang rentan terhadap penisilin, 4) pertumbuhan tidak begitu dihambat oleh zat-zat warna dasar seperti kristal ungu, 5) persyaratan nutrisi relatif sederhana, serta 6) kurang resisten terhadap gangguan fisik (Pelczar 1986).

Sampel biakan bakteri pada media agar perlu ditambahkan akuades terlebih dahulu sebelum diberi pewarna pada pewarnaan Gram. Hal tersebut bertujuan agar bakteri yang dioleskan tidak dalam keadaan menumpuk, karena akan sulit untuk menentukan penataan selnya ketika bertumpuk. Bakteri yang dioleskan juga tidak boleh terlalu tipis, karena sejumlah besar bakteri yang diberi berbagai macam perlakuan dapat hilang pada kaca preparat akibat ikut terbilas dengan akuades maupun alkohol. Bakteri yang telah dioleskan pada kaca preparat diberi tanda pada bagian belakang kaca preparat dengan spidol agar mempermudah dalam pemberian perlakuan sehingga semua bakteri yang telah dioleskan dapat terwarnai semua. Selain itu, jika sampel bakteri yang dihasilkan dapat menumpuk, terlalu sedikit, ataupun tidak ada maka sebaiknya bakteri yang dioleskan pada kaca preparat dibuat dua. Bakteri yang telah dioleskan dikeringudarakan atau fiksasi udara agar bakteri menempel pada kaca preparat. Agar fiksasi memakan waktu lebih sedikit maka fiksasi dilakukan di dekat api pembakar spirtus, akan

tetapi fiksasi ini tidak boleh dilakukan terlalu dekat dengan api pembakar spirtus karena bakteri yang menempel dapat mati akibat suhu yang panas sehingga ketika ditambahkan kristal ungu maupun safranin dapat larut dan hilang ketika dibilas. Setelah bakteri terebut diteteskan kristal ungu yang berfungsi memberikan warna utama dengan warna berupa ungu selama 1 menit yang kemudian dibilas dengan akuades. Pembilasan dengan akudes dilakukan dengan cara mengalirkannya pada bagian bakteri tidak dioleskan dengan cara kaca preparat sedikit dimiringkan, bukan dengan cara menyemprotkannya secara langsung pada bakteri karena dapat menyebabkan sejumlah besar bakteri yang menempel pada kaca preparat ikut terbilas. Setelah itu, kaca preparat dikeringudarakan dan ditambahkan kalium iodida selama satu menit yang dapat menyatu dengan kristal ungu membentuk kompleks di dalam sel sehingga sel tetap berwarna ungu atau dengan kata lain untuk mengintensifkan warna utama. Setelah satu menit, kaca preparat dibilas dengan alkohol 90%. Fungsi alkohol ini adalah untuk dekolorisasi atau dengan kata lain untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu daru kompleks kristal ungu dan kalium iodida (KU-KI) pada bakteri Gram negatif, karena mengandung lebih banyak lipid sedangkan pada bakteri Gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung lebih banyak peptidoglikannya. Bakteri Gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga kompleks KU-KI tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif lipid tereksitasi (keluar) dari dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga kompleks KU-KI keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna atau warna ungu akan luntur karena peluruhan dinding sel. Setelah dibilas dengan alkohol dan dikeringudarakan, larutan safrani diteteskan pada area dioleskannya bakteri selama 1 menit. Saftranin merupakan warna penutup, pewarna tandingan, atau counterstain yang berfungsi untuk mewarna bakteri Gram negatif yang semula telah luntur pewarnaanya menjadi warna merah atau merah muda. Hasil akhirnya yaitu bakteri Gram positif akan berwarna ungu atau biru gelap dan bakteri Gram negatif akan memberikan warna merah atau merah muda. Pengamatan Gram yang dilakukan dengan mikroskop pembesaran 1000 kali harus menggunakan minyak imersi. Minyak imersi ini dapat menyebabkan karat, oleh karena itu setelah mikroskop tidak digunakan lagi maka minyak imersi yang menempel pada lensa dibersihkan.

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, perbesaran dapat memengaruhi hasil pengamatan. Perbesaran yang lebih kecil, misalnya pada perbesaran 400 kali, sel bakteri E. coli yang membentuk koloni tidak begitu jelas terlihat pembentukan koloni dari sel-sel tunggalnya. Semakin besar perbesaran yang digunakan dengan daya fokus yang tepat maka penataan dan bentuk sel dapat dilihat dengan jelas seperti pada sel Bacillus pada pewarnaan spora yang menggunakan pembesaran 1000 kali. Jika pada percobaan bakteri yang diamati terlalu tebal atau menumpuk maka yang seharusnya bakteri tersebut memberikan warna merah akan terlihat seperti memberikan warna ungu atau sebaliknya sehingga perlu diratakan terlebih dahulu. Terjadi penyimpangan pada saat bakteri Bacillus yang diamati dengan mikroskop. Hasil percobaan menunjukkan bakteri Bacillus merupakan bakteri Gram negatif. Bacillus seharusnya merupakan bakteri Gram positif yang berwarna ungu. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa hal seperti pewarnaan KU-KI kurang dari satu menit sehingga warna ungu belum

terserap secara sempurna sehingga warna safranin yang masuk pada sel bakteri tersebut ataupun dapat dikarenakan reagen sudah dalam keadaan tidak segar atau sudah lama. Jika suatu bakteri yang seharusnya Gram negatif tetapi memberikan hasil Gram positif dapat dikarenakan ketika dilakukan pewarnaan dengan kristal ungu yang terlalu lama dan ketika dikeringudarakan terlalu dekat api, warna ungu ini akan sangat melekat dengan kaca preparat dan akan sangat terserap ke dalam dinding sel bakteri tersebut. Sehingga ketika pewarnaan selanjutnya dengan safranin tidak dapat memberikan warna merah karena warna merah tersebut tidak dapat mengisi dinding sel akibat alkohol yang juga tidak bisa meluruhkan warna ungu yang dikarenakan warna ungu sudah terlalu melekat pada dinding sel.

Spora bakteri merupakan bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik bagi bakteri tersebut, maka bungkus spora akan pecah dan tumbuhlah bakteri. Spora juga disebut endospora jika masih terletak di dalam sel bakteri. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk daripada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif (Sudjadi 2006). Pewarnaan endospora dengan larutan malacite green akan menunjukkan reaksi positif pada bakteri penghasil endospora, yaitu larutan akan berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka larutan malacite green tidak dapat diikat (Pearce 2009). Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi agar bakteri dapat melekat pada kaca preparat. Kemudian preparat diteteskan malacite green secara merata yang berfungsi sebagai pewarna primer dan setelah itu kaca preparat diletakkan di atas uap air yang bertujuan untuk membantu warna menembus spora karena malacite green sulit untuk masuk ke dalam spora sehingga pori-pori spora dibuka dengan cara pemuaian oleh panas dan dijaga jangan sampai pewarnanya kering. Kemudian dicuci dengan akuades dengan cara dialirkan dan dikeringudarakan yang bertujuan menghilangkan malacite green dari bagian sel endospora. Pewarnaan dengan safranin bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk mewarnai bagian sel endopora, sehingga sel bakterinya akan memberikan warna merah atau merah muda. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan Bacillus memiliki endospora akan tetapi bagian sel bakterinya tidak berwarna merah dan sebagian berwarna hijau pada bagian dinding selnya. Hal ini dapat disebabkan malacite green yang diteteskan terlalu lama sehingga melekat pada kaca preparat sehingga ketika dilakukan pembilasan dan penambahan safranin, warna dari malacite green sulit untuk dihilangkan.

SimpulanBerdasarkan percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa E. coli

dan Bacillus merupakan bakteri Gram negatif. Akan tetapi, Bacillus seharusnya merupakan bakteri Gram positif. Bacillus juga memiliki endospora berdasarkan pewarnaan spora, selnya berbentuk basil dengan penataan sel monococcus sedangkan E. coli memiliki bentuk sel coccus, penataan selnya streptococcus, dan tidak memiliki endopora.

Daftar PustakaArican A, S Andic. 2011. Survival of E. coli O157:H7 in yoghurt incubated until

two different pH value and stored at 4 °C. Di dalam Kafkas Univ Vet Fak Derg 17 (4): 537-542. Turki: Yüzüncü Yil Press.Duc Le H, Huynh AH, Teresa MB, Andriano OH, Simon MC. 2004. Characterization of bacillus probiotics available for human use. Di dalam Appl Environ Microbiol 70(4): 2161-2171. London: Royal Holloway Press.James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Retno Indah, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Science for Nurses.Karmana Oman. 2008. Biologi. Jakarta: PT Grafindo Media Pratama.Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri, penerjemah; Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Anatomy and Physiology for Nurses.Pelczar MA, J Chan, ECS Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.Sudhadu Bagod. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan: Jakarta: Yudhistira Ghalia Indonesia.